嗜甘草的植物乳杆菌及其制备的甘草益生菌制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种嗜甘草的植物乳杆菌及其制备的甘草益 生菌制剂及制备方法。
【背景技术】
[0002] 甘草，学名Glycyrrhiza uralensis Fisch，别名国老、甜草、乌拉尔甘草、甜根子， 是豆科甘草属多年生草本植物，根与根状茎粗壮，是一种补益中草药，在中国、印度和希腊 的古代医药典籍中多有记载，至今已有几千年的使用历史。在中药中，甘草常用于治疗心气 虚，心悸怔忡，脾胃气虚，倦怠乏力，咽喉肿痛，气喘咳嗽，清热解毒等。
[0003] 现代药物化学分析表明，甘草的化学组成极为复杂，目前为止从甘草中分离出的 化合物有甘草甜素、甘草次酸、甘草甙、异甘草甙、新甘草甙、新异甘草甙、甘草素、异甘草素 以及甘草西定、甘草醇、异甘草醇、7-甲基香豆精、伞形花内酯等数十种化合物，目前，国内 外药理界研宄表明，甘草及其提取物具有保肝、抗炎、抗病毒、抗菌、抗癌、抗氧化、镇咳、免 疫调解、降糖和抗血小板凝集等多种活性，证实甘草在肝病治疗、糖尿病治疗、缺血再灌注 损伤、阿尔茨海默症、帕金森氏症、癫痫、抑郁、癌症治疗方面有更好的开发和应用前景，目 前临床用于治疗呼吸系统、消化系统、免疫系统等多种疾病。
[0004] 甘草是一类植物药类益生元，可促进多种益生菌生长。早在1998年，日本学者新 纳靖规就发现甘草经乳酸菌发酵后的发酵液提取物（GL)具有多种肝脏保护作用，并将其 开发成为一种护肝类保健食品。
[0005] 微生态制剂（Probioties)，也叫活菌制剂（Bigone)或生菌剂，是指运用微生态 学原理，利用对宿主有益无害的益生菌或益生菌的促生长物质，经特殊工艺制成的制剂。目 前，在食品领域，以乳酸菌发酵为代表的微生态制剂是近年来健康食品和保健食品开发中 的一支新生力量。鉴于甘草具有多种药理活性作用，因此，开发一种甘草微生态制剂具有广 阔的应用前景。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本申请发明人在乳杆菌发酵甘草的研发过程中，获得了一株以甘草为 唯一营养成分的嗜甘草的植物乳杆菌，且该菌在此培养环境中能够旺盛繁殖。然后，利用该 植物乳杆菌的嗜甘草特性，用该菌株发酵甘草，制备出一种包含植物乳杆菌和甘草发酵物 的益生菌制剂，经初步研宄结果显示，该益生菌制剂对化学性肝损伤（如酒精性肝炎和中 毒性肝炎）、慢性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝炎有预防及辅助治疗的作用。
[0007] 因此，本发明的目的之一在于提供一种嗜甘草的植物乳杆菌，该嗜甘草的植物乳 杆菌在以甘草为唯一营养成分的培养基环境中能够旺盛繁殖；本发明的目的之二在于提供 含有该嗜甘草的植物乳杆菌的制剂，所述制剂含有药学上一切可接受的载体；本发明的目 的之三在于提供一种具有护肝功能的甘草益生菌制剂，该甘草益生菌制剂包括上述的嗜甘 草的植物乳杆菌和甘草发酵物，对化学性肝损伤（如酒精性肝炎和中毒性肝炎）、慢性肝 炎、脂肪肝、自身免疫性肝炎有预防及辅助治疗的作用；本发明的目的之四在于提供具有护 肝功能的甘草益生菌制剂的制备方法，所述制备方法操作简单，易于工业化生产；本发明的 目的之五在于提供所述的具有护肝功能的甘草益生菌制剂在制备预防或治疗肝脏疾病药 物中的应用。
[0008] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0009] 嗜甘草的植物乳杆菌，生物保藏编号为CCTCC NO:M 2013449,所述嗜甘草的植物 乳杆菌在添加甘草和/或甘草浸液的培养环境中繁殖旺盛。本发明所得的嗜甘草的植物乳 杆菌在以甘草为唯一营养成分的培养基环境中能够旺盛繁殖，其在制备保健食品尤其是微 生态制剂中具有广泛的应用。
[0010] 生物保藏信息说明：
[0011] 嗜甘草的植物乳杆菌是在以甘草为唯一营养成分的培养基环境中能够旺盛繁殖， 命名为Lactobacillus plantarum BL-WHSYM9,已于2013年9月26日保藏于中国典型培养 物保藏中心，保藏地址为中国武汉，其保藏编号为：CCTCC N0:M 2013449。
[0012] 嗜甘草的植物乳杆菌BL-WHSYM9生物学特征如下：属于乳杆菌科中的乳杆菌属， 革兰氏阳性，45°C不生长，兼性厌氧菌，在pH4. 5-9. 5生长，最适pH6. 5左右。菌种呈短杆状， 有时呈链状或者呈对状，不产生芽孢；在LBS琼脂培养基中呈灰白色、不透明、圆形、光滑、 微小细密的菌落；属于通行发酵乳酸菌，能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、L-山梨糖、乳糖等。
[0013] 本发明所述的甘草浸液为甘草的浸提液，通过任何常规操作方法浸提均可，在本 发明的一个具体实施例中，所述甘草浸液的制备，以10%甘草浸液配制为例：l〇〇g甘草超 微粉体，加水2L，浸泡40分钟，煎煮40min，4层纱布过滤；药渣再加水2L，煎煮40min，4层 纱布过滤；合并两次滤液，经60-300目（如依次经过60、KKK200目）分级过滤，浓缩滤液 至1L。
[0014] 嗜甘草的植物乳杆菌是本申请的发明人在乳杆菌发酵甘草过程中获得的，其具体 的制备方法包括如下进行的步骤：
[0015] (l)LBS培养基培养：取人新鲜粪便，在LBS培养基上划线，37±2°C厌氧培养 20-48h ；
[0016] (2)MRS培养基培养：挑选步骤（l)LBS培养基上得到的不同形态的菌落分别接种 到MRS固体培养基上，37±2°C厌氧培养20-48h ;
[0017] (3)耐甘草乳杆菌筛选：挑选步骤（2)MRS固体培养基上得到的不同培养特征的乳 杆菌菌落分别接种到以甘草为唯一碳源的筛选培养基上，37±2°C厌氧培养20-48h，筛选 得到耐甘草乳杆菌；所述筛选培养基配方为：5%甘草浸液200mL/L，酵母膏0. 5g/L，硫酸铵 5g/L，磷酸二氢钾lg/L，硫酸镁0. 5g/L，琼脂15g/L。
[0018] (4)驯化：将步骤（3)得到的耐甘草乳杆菌接种到含5%甘草浸液的液体培养基 中，37±2°C培养20-48h后转接到含10%甘草浸液的液体培养基中，以此类推，最终转接到 含50%甘草浸液的液体培养基中；所述液体培养基的配方为：梓檬酸按2g/L，乙酸钠5g/L， 磷酸氢二钾5g/L，硫酸猛0. 2g/L，硫酸镁0. 5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/ L，吐温-80 lmL/L，（5-50) %甘草浸液200mL/L ;经多次驯化，得到稳定生长活性的嗜甘草 的植物乳杆菌。
[0019] 所述的嗜甘草的植物乳杆菌的制备方法，所述的LBS培养基，在一个具体实施例 中，其配方为：酵母浸粉0. 5 %，胰酪蛋白胨1 %，磷酸二氢钾0. 6 %，硫酸亚铁0. 0034 %，硫 酸镁0. 0575 %，葡萄糖2 %，乙酸钠2. 5 %，柠檬酸铵0. 2 %，硫酸锰0. 012 %，琼脂1. 5 %，吐 温-80 lmL，冰乙酸1.3mL;调节pH值为5. 5±0. 2。当日使用，无需高压灭菌，次日使用，需 118°C高压灭菌15min。
[0020] 所述的嗜甘草的植物乳杆菌的制备方法，所述的MRS培养基，在一个具体实施例 中，其配方为：葡萄糖2. 0%，柠檬酸铵0. 2%，乙酸钠0. 5%，磷酸氢二钾0. 5%，硫酸锰 0. 02%，硫酸镁0.05%，蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，酵母膏0.5%，吐温-80 0. 1%，琼脂 1. 5% ;调节 pH 6. 0±0. 2,121°C高压灭菌 15min。
[0021] 含有本发明所述的嗜甘草的植物乳杆菌的制剂，所述制剂含有药学上一切可接受 的载体。
[0022] 优选的，所述制剂包括冻干粉末、胶囊或片剂。
[0023] 优选的，所述制剂中嗜甘草的植物乳杆菌的活菌数多IX 108cfu/g。
[0024] 具有护肝功能的甘草益生菌制剂，所述甘草益生菌制剂包括本发明所研发的嗜甘 草的植物乳杆菌和甘草发酵物，所述甘草发酵物是由本发明所研发的嗜甘草的植物乳杆菌 发酵甘草和/或甘草浸液制备得到。经初步研宄结果显示，该益生菌制剂对化学性肝损伤 (如酒精性肝炎和中毒性肝炎）、慢性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝炎有预防及辅助治疗的 作用。
[0025] 本发明进一步提供了具有护肝功能的甘草益生菌制剂的制备方法，将生物保藏编 号为CCTCC NO:M 2013449的嗜甘草的植物乳杆菌接种于发酵培养基中发酵，所得发酵产物 即为具有护肝功能的甘草益生菌制剂，上述所得发酵产物应理解为发酵结束后所得的所有 产物，包括菌和经过发酵后的发酵培养基。所述发酵培养基中添加有甘草和/或甘草浸液， 所述发酵培养基中还包括其他利于乳酸菌发酵的氮源、无机盐和生长因子等。在本发明的 一个具体实施例中，所述发酵培养基配方为：酪蛋白胨10. 〇〇g/L，柠檬酸三铵2. 00g/L，牛 肉膏10. 00g/L，乙酸钠5. 00g/L，酵母浸膏5. 00g/L，硫酸镁0? 50g/L，葡萄糖20. 00g/L，硫酸 锰0.2§/1，磷酸氢二钾5.0(^/1，吐温1.0(^/1，10%甘草浸液200111171 ;10%甘草浸液配制 方法：100g甘草超微粉体，加水2L，浸泡40分钟，煎煮40min，4层纱布过滤，药渣加水2L， 煎煮40min，4层纱布过滤，合并两次滤液，经60、KKK200目分级过滤，浓缩滤液至1L。
[0026] 进一步，所述的制备方法，所得的发酵产物经过离心，取沉淀部分（沉淀部分包括 中层菌体和下层药泥）添加冻干保护剂进行真空冷冻干燥，得干粉状甘草益生菌制剂。所 述的离心、真空冷冻干燥采用本领域任何常规操作均可实现。所述的冻干保护剂为冻干领 域常用的保护剂，包括戊五醇、蔗糖、脯氨酸、脱脂奶粉等，优选脱脂奶粉。
[0027] 优选的，所述的制备方法，所述用于接种发酵的嗜甘草的植物乳杆菌菌龄为 12-24h，更优选的为24h。合适菌龄的菌种可通过菌种活化和/或扩大培养来实现，在本发 明的一个具体实施例中，所述菌种活化是将冻干的嗜甘草的植物乳杆菌菌粉接种于固体斜 面活化培养基上，在25-40°C培养22-26h。