一株高效降解邻苯二甲酸二丁酯的普罗威登斯菌(Providencia sp.)2D的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及环境污染物生物处理技术领域，更具体地，涉及一株高效且能完全降 解邻苯二甲酸二丁醋的普罗威登斯菌sp. )2D。
【背景技术】
[0002] 邻苯二甲酸二丁醋（di-/?-butylphthalate，DBP)属于邻苯二甲酸醋类化合物 (Phthalic acidester，PAEs)，是塑料工业最主要的增塑剂之一，也是农药、染料去污剂的 载体以及诸多化妆品、纺织品的生产原料，广泛用于食品包装材料、容器、医疗器械以及儿 童玩具等领域。由于上述制品的大量应用，DBP已经成为全球性的有机污染物，广泛存在于 大气、水体、土壤以及生物体中。特别是在农业生产中，由于塑料薄膜和塑料大棚的广泛应 用，残留在农业土壤中DBP极易通过食物链在人体中富集。DBP及其代谢物能够对机体造 成生殖毒性、发育毒性、神经毒性、多器官癌变等多种损伤，因此美国环保署（EPA)和中国国 家环境监测中心（CNEMC)都已将它列为优先控制污染物。
[0003] 研宄表明，DBP的水解和光解速率都非常缓慢，生物降解是其在环境中分解的主要 途径。因此，获得DBP高效降解菌是提高其生物降解效率的重要环节。利用微生物降解作 用，将DBP转化为无害物质或完全矿化，是公认的去除环境中DBP污染的最佳手段。由于环 境中DBP的普遍存在，DBP降解菌的出现频率也很高，目前对DBP有降解作用的微生物大多 数为戈登氏菌属、农杆菌属、不动杆菌属和赤红球菌属等，但已报道的这些细菌对于DBP的 生物降解不完全，会产生毒性更高的中间代谢产物，或者其降解速率还不能满足实际污染 控制的要求，因此仍需筛选更加高效的专性或兼性降解菌。
【发明内容】
[0004] 本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一株高效且能完全降解邻苯二甲酸二 丁酯的菌株。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的： 一株普罗威登斯菌sp. ) 2D，所述菌株于2015年1月22日保藏在中国 典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2015057;保藏地址为：中国武汉武汉 大学。 所述菌株/sp. 2D通过富集培养法从农场动物奠堆肥样品中富集获得，该 菌的最适生长条件为：温度30~40°C，pH为7. 0~8.5。
[0006] 所述菌株/sp. 2D在牛肉膏蛋白胨培养基（LB，酵母粉5. 0 g，蛋白 胨10. 0 g，氯化钠10. 0 g，pH= 7. 0)上划线培养7天，菌落呈橘黄色，质地膏状，丰厚湿润， 易被挑起，边缘较薄；扫描电子显微镜下该菌株呈长杆状，长约1. 5~3. 0 y m，宽约0. 5~ 0. Sum。经革兰氏染色鉴定该菌为革兰氏阴性菌。
[0007] 所述菌株/sp. 2D的生理生化鉴定实验结果如下：甲基红试验（阳 性)、V-P试验（阴性)、吲哚反应（阳性)、柠檬酸盐利用（阳性)、肌醇产酸试验（阳性)、葡萄糖 产酸试验（阳性)、淀粉水解试验（阴性)、尿酶试验（阳性)、明胶液化试验（阴性)、硝酸盐还原 (阳性)、氧化酶试验（阴性）和葡萄糖产气试验（阴性)。
[0008] 所述菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO :1所示，通过NCBI官方网站（hi:tp://www. ncbi. nlm. nih. gov/)的BLAST程序与其他已登录细菌菌株的16S rDNA序列进行比对，结果 表明该菌株与sp.相似性最高，同源率达99%。
[0009] 所述菌株/sp. 2D能够利用DBP作为唯一碳源和能源生长繁殖，并将 DBP完全矿化。
[0010] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 本发明提供了一株普罗威登斯菌sp. 2D，该菌株活力高，在72 h对高浓 度的DBP (1000 mg/L)降解效率超过80%，对低浓度的DBP (200 mg/L)几乎完全降解；该 菌株还能够降解DBP的中间产物邻苯二甲酸，所述菌株具有高效的DBP降解能力，同时具有 生长速度快、培养方法简单、适应能力强、不易变异的特点，极大地补充了 DBP降解菌的资 料库，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0011] 图1为Providencia sp. 2D在LB培养基上培养7天的生长形态。
[0012] 图2为/sp. 2D的扫描电镜图。
[0013] 图3为/￥〇成sp. 2D的16S rDNA的系统发育树。
[0014] 图4为/sp. 2D对DBP和邻苯二甲酸的降解动力学曲线。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本 发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单 修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术 人员所熟知的常规手段。
[0016] 实施例1邻苯二甲酸二丁酯降解菌的分离与鉴定 1、培养基配方 无机盐培养液（MSM，g/L):K2HP04:5. 8 ;KH2P04:4. 5 ; (NH4)2S04:2. 0 ;MgCl 2:0.1 6 ;CaCl 2: 0? 02 ;Na2Mo04 ? 2H20 :0? 0024 ;FeCl3:0. 0018 ;MnCl 2 ? 2H20 :0? 0015 ;调节无机盐培养液的最 终pH为7. 5,添加DBP，使其在无机盐培养液中的浓度为50 mg/L，DBP作为唯一碳源。
[0017] 牛肉膏蛋白胨培养基（LB):酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠10.0 g，加超纯 水至1L，调节pH= 7. 0。121°C灭菌20分钟。固体平板则添加1. 5% (W/V)琼脂粉。
[0018] 2、分离与鉴定 分离方法采用样品悬液摇瓶法：称取5 g堆肥样品（取自农场动物堆肥）于含有50 mL 无菌水的150 mL三角瓶中，在30°C，140 rpm条件下培养3天后取5 mL堆肥悬液加入100 mL含DBP (50 mg/L)的上述MSM培养基中。经30°C，140 rpm培养7天后，每次按取1 mL 的接种量连续富集、转接10次，并相应提高MSM培养基中DBP含量至1000 mg/L(第二次转 接，MSM培养基中DBP的含量为100mg/L，之后每转接一次，MSM培养基中DBP的含量相应提 高100mg/L)。然后将转接10次的培养液稀释103~10 5涂布于LB固体平板上，30°C倒置 培养1~3天。待平板上长出单菌落后，挑取单菌落多次划线纯化，分离获得一株细菌，编 号为2D。然后将菌株接种于LB固体平板上30°C倒置培养7天，观察其菌落形态。LB平板 培养7天的菌落呈橘黄色，质地膏状，丰厚湿润，易被挑起，边缘较薄(见图1 )。
[0019] 扫描电镜样品制备与观察：将菌种2D的单菌落接入含有10 mL的LB液体培养基 过夜活化。吸取800 yL菌液经8000 rpm离心3~5 min，去上清液，加入500 yL PBS 洗菌3次。在收获的菌体沉淀中加入1 mL 2.5% (v/v)戊二醛充分混匀，4°C静置过夜。然 后再次经8000 rpm离心3~5 min，去上清液，加入500 yL PBS洗菌3次。随后将菌体 分别在30%，50%，70%，85%，90%和100%的梯度乙醇中脱水2次，每个梯度约浸泡15 min，然 后8000 rpm离心去上清液，最后用乙酸异戊酯置换乙醇2次，每次20 min，方法同乙醇脱 水。菌体经过〇)2干燥后制片观察。扫描电镜下可以观察到该菌呈长杆状，长约1.5~3.0 ym，宽约0.5~0.8 ym (见图2)。
[0020] 菌株的生理生化鉴定指标包括12项：甲基红试验、V-P试验、吲哚反应、柠檬酸盐 利用、肌醇产酸试验、葡萄糖产酸试验、淀粉水解试验、尿酶试验、明胶液化试验、硝酸盐还 原、氧化酶试验和葡萄糖产气试验。具体实验结果见表1。
[0021]
【主权项】
1. 一株普罗威登斯菌（sp. )2D，其特征在于，所述菌株于2015年1月22 日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏编号为CCTCCM2015057。
2. 根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株的16SrDNA序列如SEQIDNO: 1所示。
3. 根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株为革兰氏阴性菌；在LB培养基 上菌落呈橘黄色，质地膏状，丰厚湿润，易被挑起，边缘较薄。
4. 根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株能将邻苯二甲酸二丁酯完全矿 化。
【专利摘要】本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体公开了一株高效且能完全降解邻苯二甲酸二丁酯的普罗威登斯菌（Providencia sp.）2D，所述菌株于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC M 2015057。该菌株在72h对高浓度的DBP（1000mg/L）降解效率超过80%，对低浓度的DBP（200mg/L）几乎完全降解；该菌株还能够降解DBP的中间产物邻苯二甲酸，最终将DBP完全矿化，所述菌株具有高效的DBP降解能力，极大地补充了DBP降解菌的资料库，该菌还具有生长速度快、培养方法简单、适应能力强、不易变异的特点，具有良好的应用前景。CCTCC M 201505720150122
【IPC分类】C12N1-20, C12R1-01
【公开号】CN104845898
【申请号】CN201510066060
【发明人】莫测辉, 赵海明, 蔡全英, 李彦文, 李慧, 冯乃宪, 杜欢, 喻娇
【申请人】暨南大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年2月9日