棒曲霉素的检测方法及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及纳米生物传感以及生物检测领域，具体地说，是提供一种棒曲霉素的检测方法及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]棒曲霉素是由霉菌产生的一种有毒的真菌代谢产物。能够产生棒曲霉素的霉菌，主要包括青霉属、曲霉属、丝衣霉等霉菌，这些霉菌，可广泛地感染多种水果、蔬菜、粮食、饲料和中药材，导致这些作物及其制品受棒曲霉素污染。如受这些霉菌感染的苹果，距其霉烂斑点3厘米处的果肉中，仍可检出棒曲霉素。棒曲霉素对热稳定，100°C加热15分钟仍然不能破坏其结构，且在酸性溶液及有机溶剂中能长期保存。棒曲霉素曾因为其抑制多种菌生长而被用作抗生素，它具有引起抽搐、肠道出血、肺部出血、肾脏损害等急性毒性，棒曲霉素对神经系统、呼吸系统、泌尿系统、免疫系统和生殖系统等都具有较强的毒性。同时具有基因毒性、致畸、致癌等慢性毒性。目前检测棒曲霉素的方法有:色谱法、色谱联用技术、酶联免疫法等。这些方法检出限低、精密度高，但操作复杂、检测成本高。建立一种快速、简单、低成本的棒曲霉素检测方法有重要意义。
[0003]中国专利CN104593374A公开了一种特异识别棒曲霉素的寡核苷酸适配体，其可用于棒曲霉素的检测，但未见用于棒曲霉素的检测的进一步应用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种检测棒曲霉素的方法。
[0005]本发明采用的技术方案:一种检测棒曲霉素的方法，包括如下步骤:
(A)使棒曲霉素核酸适体(Apt)与单链信号探针ssDNA(Sp)杂交，形成杂交链；
(B)使该杂交链与待测样品作用，当待测样品中有棒曲霉素存在时，杂交链选择性地与棒曲霉素反应释放出单链信号探针s sDNA;
(C)消除杂交链的干扰，利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用外切酶，选择性地催化双链DNA水解成单核苷酸，体系中单链信号探针ssDNA不水解而保留下来；(D)利用棒曲霉素核酸适体-棒曲霉素结合体不能诱导银离子还原成近红外荧光银纳米簇，只有单链信号探针ssDNA(Sp)能诱导生成具有强荧光的近红外银纳米簇，检测体系中荧光强度，从而测定待测样品中的真菌毒素棒曲霉素的含量。
[0006]所述棒曲霉素核酸适体为 5，-CAGCTCAGAAGCTTGATCCCGGCCCGCCAACCCGCATCATCTACACTGATATTTTACCTT
GACTATCAGTCGTGC-3’。
[0007]所述可与棒曲霉素核酸适体杂交的单链信号探针DN A为5 ’ -CCCCCCACACCCGATCCCCCCGCACGACTGATAGTC-3’。
[0008]本发明的检测原理如下:先让Apt与Sp杂交(下划线部分)；当有棒曲霉素存在时，杂交链与棒曲霉素反应释放出Sp;体系中存在Apt-Sp(剩余的)，Apt-棒曲霉素和Sp Jpt-棒曲霉素不能诱导银离子还原生成近红外荧光的银纳米簇，对测定无干扰;杂交链可能有干扰;为了消除杂交链的干扰:a.利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，b.用核酸外切酶，选择性地催化双链DNA水解成单核苷酸，体系中单链信号探针ssDNA未水解而保留下来;此时体系中只留下可诱导生成近红外荧光的银纳米簇的Sp，以波长为585 nm的光为激发光，测定体系荧光发射(610-800 nm)光谱的荧光强度，依据荧光强度与棒曲霉素的量的关系，从而可以测定真菌毒素棒曲霉素的含量。由于消除体系中背景荧光的干扰，可以提高检测的灵敏度和精度。
[0009]本发明还提供了一种检测棒曲霉素的试剂盒，其至少包括:棒曲霉素核酸适体、可与棒曲霉素核酸适体杂交的单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、核酸外切酶、银离子还原检测体系。
[0010]所述棒曲霉素核酸适体为5 ’ -CAGCTCAGAAGCTTGATCCCGGCCCGCCAACCCGCATCATCTACACTGATATTTTACCTT GACTATCAGTCGTGC-3’。
[0011 ]所述的单链信号探针ssDNA为5 ’ -CCCCCCACACCCGATCCCCCCGCACGACTGATAGTC-3 ’。
[0012]所述DNA扩增体系包括缓冲溶液，缓冲溶液由Tris-HCUMgCl2和(NH4)2SO4组成，三磷酸脱氧单核苷酸混合溶液dNTP和Phi29 DNA聚合酶。
[0013]所述核酸外切酶为ExoIII核酸外切酶。
[0014]所述的银离子还原检测体系中的还原剂为抗坏血酸。
[0015]本发明还提供了一种可用于检测棒曲霉素的棒曲霉素核酸适体，其碱基序列为5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCCGGCCCGCCAACCCGCATCATCTACACT
GATATTTTACCTT GACTATCAGTCGTGC-3’。
[0016]本发明的优点:
采用本发明的检测方法和试剂盒，可以消除干扰，0.008-0.30 ng/mL，检测限3 pg/mL。
【附图说明】
[0017]图1为Sp-Ag纳米簇荧光与棒曲霉素的浓度关系图。
【具体实施方式】
[0018]实施例1
一种检测棒曲霉素的试剂盒至少包括:棒曲霉素核酸适体、可与棒曲霉素核酸适体杂交的单链信号探针DNA、DNA扩增体系、核酸外切酶、银离子还原检测体系。棒曲霉素核酸适体为5 ’ - CAGCTCAGAAGCTTGATCCCGGCCCGCCAACCCGCATCATCTACACTGATATTTTACCTTGACTATCAGTCGTGC-3 ’。单链信号探针DNA为5 ’ -CCCCCCACACCCGATCCCCCCGCACGACTGATAGTC-3 ’。DNA扩增体系包括缓冲溶液(缓冲溶液由Tris-HCUMgCl2和(NH4)2SO4组成)，三磷酸脱氧单核苷酸混合溶液dNTP和Phi29 DNA聚合酶。。核酸外切酶为Exo III核酸外切酶。所述的银离子还原检测体系中的还原剂为抗坏血酸。
[0019]实施例2
一种检测棒曲霉素的方法，具体操作过程如下:
将各DNA储备液在95°C下经加热处理5分钟，使用前，并在室温下放置30分钟。然后，分别取含3.0 μπιο?棒曲霉素核酸适体(Apt)的杂交缓冲溶液40 μ!^Ρ3.0 μπιο?信号探针ssDNA(Sp)的杂交缓冲溶液40 yL置于2ml离心管中，在37°C下杂交I小时，生成棒曲霉素核酸适体-信号探针杂交物(Apt -Sp) ο
[0020]在37°C下，分别依次将浓度为O?50 ng/mL的棒曲霉素添加到Apt-Sp溶液中，棒曲霉素与Apt-Sp中Apt段反应，生成核酸适体-棒曲霉素，释放出Sp。这时，体系中有Sp、剩余(未反应的)Apt-Sp和核酸适体-棒曲霉素等物质。
[0021 ] 加入10 yL缓冲溶液(缓冲溶液组成为50mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2,10 mM(NH4)2SO4lPH 7.5 )，然后加入dNTP (10 mM) 18 yL。再向体系中加入2yL Phi29 DNA 聚合酶(10 u/μ?),在37°C下反应15分钟，使得以棒曲霉素核酸适体-信号探针杂交序列(Ap-Sp)为摸板扩增成双链DNA。在65°C下保持10分钟使Phi29 DNA去活。
[0022]再向该反应体系中加入2yL Exo III核酸外切酶(20 u/yL)，在37°C下反应30分钟，Exo III选择性地催化双链DNA水解成单核苷酸，单链信号探针Sp不水解而保留下来。
[0023]向反应液中加入25 yL I mmol硝酸银和180Λ柠檬酸钠缓冲液(10 mM，pH7.8)。然后，混合物在室温下避光或暗室中放置10分钟后，在快速搅拌下，加入10yL浓度为ImM的新制备的抗坏血酸溶液。然后在45°C下反应5min。将溶液转移至微量比色皿，以波长为585nm的光为激发光，测定体系荧光发射(610-800 nm)光谱的荧光强度，依据荧光强度与棒曲霉素的量的关系，进行棒曲霉素的定量测定，结果如图1所示。
[0024]线性范围0.005-0.30 ng/mL，线性方程为y = 32.28 + 775.8 C，相关系数为r =
0.9969，检测限3pg/mL，回收率在96.5?106.2%。其它真菌毒素等生物小分子对棒曲霉素的检测无干扰。
【主权项】
1.一种棒曲霉素的检测方法，其特征是，该方法包括如下步骤: (A)棒曲霉素核酸适体Apt与单链信号探针ssDNA杂交，形成杂交链； (B)使该杂交链与待测样品作用，当待测样品中有棒曲霉素存在时，杂交链中Apt段选择性地与棒曲霉素反应生成Apt-棒曲霉素，同时释放出单链信号探针ssDNA; (C)消除杂交链的干扰，利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用外切酶选择性地催化双链DNA水解成单核苷酸，体系中单链信号探针ssDNA不水解而保留下来； (D)利用棒曲霉素核酸适体-棒曲霉素结合体不能诱导银离子还原成近红外荧光银纳米簇，只有单链信号探针ssDNA能够诱导银离子还原生成强荧光的近红外银纳米簇的原理，检测体系荧光强度，从而测定待测样品中的真菌毒素棒曲霉素的含量。2.根据权利要求1所述的棒曲霉素的检测方法，其特征是，所述棒曲霉素核酸适体为5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCCGGCCCGCCAACCCGCATCATCTACACTGATATTTTACCTTGACTATCAGTCGTGC-3’。3.根据权利要求1或2所述的棒曲霉素的检测方法，其特征是，所述的单链信号探针ssDNA为5 ’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCGCACGACTGATAGTC-3’。4.一种检测棒曲霉素的试剂盒，其特征是，其至少包括:棒曲霉素核酸适体、单链信号探针DNA、DNA扩增体系、外切酶、银离子还原检测体系。5.根据权利要求4所述的检测棒曲霉素的试剂盒，其特征是，所述棒曲霉素核酸适体为5，-CAGCTCAGAAGCTTGATCCCGGCCCGCCAACCCGCATCATCTACACTGATATTTTACCTTGACTATCAGTCGTGC-3’。6.根据权利要求4所述的检测棒曲霉素的试剂盒，其特征是，所述的单链信号探针DNA为5，-CCCCCCACACCCGATCCCCCCGCACGACTGATAGTC-3，。7.根据权利要求4所述的检测棒曲霉素的试剂盒，其特征是，所述DNA扩增体系包括缓冲溶液，缓冲溶液由Tris-HCl、MgCl2和(NH4)2SO4组成，三磷酸脱氧单核苷酸混合溶液dNTP和Phi29 DNA 聚合酶。8.根据权利要求4所述的检测棒曲霉素的试剂盒，其特征是，所述核酸外切酶为ExoIII核酸外切酶。9.根据权利要求4所述的检测棒曲霉素的试剂盒，其特征是，所述的银离子还原检测体系中的还原剂为抗坏血酸。
【专利摘要】本发明涉及一种检测棒曲霉素的方法及试剂盒，该方法包括如下步骤：（A）使棒曲霉素核酸适体（Apt）单链信号探针DNA（ssDNA）杂交，形成杂交链；（B）使该杂交链与待测样品反应，当待测样品中有棒曲霉素存在时，杂交链与棒曲霉素反应释放出单链信号探针ssDNA；（C）利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用外切酶选择性地催化双链DNA水解成单核苷酸，体系中单链信号探针ssDNA未水解而保留下来；（D）在ssDNA诱导下，银离子还原生成近红外荧光银纳米簇；检测体系荧光强度，从而测定待测样品中的棒曲霉素的含量。该方法具有高灵敏度，操作简单，低成本等特点。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105543375
【申请号】CN201610043724
【发明人】曾云龙, 符方芬, 邓克勤, 杨凡, 黄昊文, 唐春然
【申请人】湖南科技大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月24日