s maltophilia\ Burkholderia gladiolipv.alliicola-.Burkholderia cepacia; iferMoJoferia 均由美国农业部国家水稻研究中 心提供。
[0021 ] 分别提取细菌基因组DNA，提取方法参见细菌DNA提取试剂盒(上海生工生物工程 有限公司)的说明书。提取的样品基因组DNA 0D2M/0D2S。范围在1. 6-2. 0内，浓度大于10ng/
[0022] 4. HDA扩增反应与电泳检测： 1) HDA反应体系和反应方法 以步骤3提取的细菌基因组DNA为模板，利用本发明所提供的HDA反应试剂盒进行反 应。
[0023] 反应体系为50ML，即在0? 2mL的PCR反应管中加入5yL的10X缓冲液，0? 2ymol 的 ATP，0.1 nmol 的 dNTPs，10U Bst polymerase，3 yg RecA 蛋白，0.3 yg UvrD helicase， 2 y L的10 y mol/L的上游引物Xoo-JYF，2 y L的10 y mol/L的下游引物Xoo-JYR，2 y L的样 品基因组DNA，用ddH20补至50 y L。
[0024] 所述的HDA反应方法为：将反应体系放入65°C恒温水浴锅中恒温扩增lOOrnin。
[0025] 2 )扩增产物的电泳检测 用1XTAE电泳缓冲液制备1. 5%的琼脂糖凝胶。取扩增产物与5ML 10X上样缓冲液 混合后，在已制备的琼脂糖凝胶的点样孔中进行点样。设置电压（3V/cm - 5V/cm)，电泳时 间为50 min - 60 min。用凝胶成像仪拍照记录。
[0026] 采用上述引物对特异性的扩增片段长度为281bp，根据检测样品是否产生281bp 的扩增条带判定样品中是否含有水稻白叶枯病菌成分。
[0027] 3)检测水稻白叶枯病菌HDA方法的确定 凝胶电泳结果见图1和图2。图1显示所有水稻白叶枯病菌orjzaepv. oiyzae YN1、YN11、YN18、YN24、PX0347、PX0349、PX0364、0S86、0S198、0S225、ZHE173) 均产生了和阳性对照一致的特异性条带；图2显示除阳性对照产生特异性条带外，其余检 测菌株（Za刀仏咖anasoryzicola RH3、RS85、RS105、HNB8-47、PX071、PX086.、 PX099、AHB4-75、JSB2-24、JSB3-22、YNB10-32、SCB4-UXanthomonasaxon〇]D〇dis^^. ci triYC\Xanthomonas campestrispv.campestrisX8-1\Ustilaginoidea oryzaeLN>SX0201 ； Jan thomonas maltophilia\ Burkholderia gladiolipv. alliicola\Burkholderia cepacia、Burkholderia glumae\ Pellicularia sasakif)势寺异痕条荀。
[0028] 以上结果表明，所提供的试剂盒和检测方法能够完全准确的对水稻白叶枯病菌进 行鉴定。与已有检测方法相比，该发明具有快捷、成本低和简单易操作的优点，特别适用于 在基层单位的日常检验检疫工作中大范围推广。
[0029]SEQIDNo:l:5' -CTCGGCAAGAAGAAGCAGTC-3' SEQ ID No:2:5' -TAACTGCTGGCAATGATCCG-3' 3￡〇10?^〇:3:水稻白叶枯病菌糖基转移酶基因67尺〇517_/(_/^/? 151/>6>/^15 16>序列（6〇118&111^ 号为：AF169030. 1): attcgcccgcaaggtcgttctgacggctattcgtgggcgatcctctgatgaaacttccgagtcgatcattg atgagcgttttggcggttgagttccagcgaatttatgtggtgaagaacggcgtgaccacctgactgatacagatgt ggagaatgctccggcacctcgtcgaaaaggggctggttgccgcgcagtttttgttggtactgggtgcgagctatagc cataagaatcgtgacctggctatcctggcttggaaagagttgcgtcgacgcggccacaatatcgccttagttatggc tggtgcagtggtcgccaagggaagctctcggcaagaagaagcagtcgcccgctggggcgctgacgaagagcaacttg taataatgccagatgtaagtagtgcggtcaggaactggttattgcggcatgccagcatcgtgttgtatccaacctca gcggaaggcttcggcctcgtcccgtttgaggctgcttctatgggaaccccaacggcgcatgtgagcttcggcccact tagggagctaatagattcgccagaacttcctcaggattgggatccgttgcgcatggcggatcattgccagcagttat tgcaagatccccagttggccggaaaaaatatcaagcgtgtccttgctagcggggggcgcctcgtttggagtgcgact gcagccgatctgaccgtggcgtaccgtcaaacgcttgcgtccgcgccgcgaaactaatatttccagaggtttaaaat atgaatacgactgaccttgatcaaatatcgcttgaacaagcactcattgacttcgaagtagccaatgcacgcgtgat ggacctcacttcgcgtctgacctctatgagtcgggagctgatccagactcgatcggaattggagcgcttacgtatcg gtgcagcgcccatttcgtactcagtcaccaattttgagggctacgacgatgtccataatcgttatgcgcagatacct gcatcgcgtttggtgaagtttgcttcgatgtttaacagtaagctgcgtcggtgtctgtaatggaccgtcctcgtatt cttcattgcatcacggtgtataacgggggggcattcgtacctgccgcaatcaaaagtgcgctgcgcctagatcagcc aggaagcacaaatagatgtataagtcctggatgacg〇
【主权项】
1. 一种检测水稻白叶枯病菌的HDA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含一对特异性 检测水稻白叶枯病菌的HDA引物对、10X缓冲液、ATP、dNTPs、Bst polymerase、RecA蛋白、 UvrD heIicase、阳性对照 DNA 和 ddH20 ; 所述HDA引物对序列为： SEQ ID No :1 :5' -CTCGGCAAGAAGAAGCAGTC-3' ； SEQ ID No :2 :5' -TAACTGCTGGCAATGATCCG-3'。2. 根据权利要求1所述的一种检测水稻白叶枯病菌的HDA试剂盒，其特征是：所述 IOX 缓冲液包括 IOOmM 二硫苏糖醇、350mM Tris-HAcUOOmM MgS04、lmg/mL BSA 和 25 yM 海 藻糖，此方案简化了 HDA反应过程，也节省了试剂盒空间。3. -种检测水稻白叶枯病菌的检测方法：其特征是： (1) 从待测样本中提取DNA作为检测模板：采用细菌DNA提取试剂盒提取待测样本 DNA，保存备用； (2) 利用检测水稻白叶枯病菌的HDA试剂盒，进行HDA反应，得到扩增产物； 所述试剂盒包含一对特异性检测水稻白叶枯病菌的HDA引物对、IOX缓冲液、ATP、 dNTPs、Bst polymerase、RecA 蛋白、UvrD helicase、阳性对照 DNA 和 ddH20 ; 所述HDA引物对序列为： SEQ ID No :1 :5' -CTCGGCAAGAAGAAGCAGTC-3' ； SEQ ID No :2 :5' -TAACTGCTGGCAATGATCCG-3' ； 所述的HDA反应方法为：将反应体系放入60-70°C恒温水浴锅中恒温扩增90-120min ; (3) 检测扩增产物，并作出判断 所述的检测扩增产物并作出判断是采用琼脂糖凝胶电泳的方法进行，出现281bp的特 异性扩增条带即判断为检测出水稻白叶枯病菌。4. 根据权利要求3所述的一种检测水稻白叶枯病菌的检测方法，其特征是：所述反应 体系中RecA蛋白的含量为3 y g。5. 根据权利要求3所述的一种检测水稻白叶枯病菌的检测方法，其特征是：所述反应 体系中UvrD helicase的含量为0. 3 y g。6. 根据权利要求3所述的一种检测水稻白叶枯病菌的检测方法，其特征是：所述反应 体系是放入65°C恒温水浴锅中恒温扩增lOOmin。
【专利摘要】一种检测水稻白叶枯病菌的HDA试剂盒及检测方法，包含一对特异性检测水稻白叶枯病菌的HDA引物对、10×缓冲液、ATP、dNTPs、Bst？polymerase、RecA蛋白、UvrD？helicase、阳性对照DNA和ddH2O。一种检测水稻白叶枯病菌的检测方法，是从待测样本中提取DNA作为检测模板：采用细菌DNA提取试剂盒提取待测样本DNA，保存备用；利用检测水稻白叶枯病菌的HDA试剂盒，进行HDA反应，得到扩增产物；检测扩增产物，并作出判断。该发明是水稻白叶枯病菌检测技术体系的进一步完善和发展，使得水稻白叶枯病菌的检测真正实现准确、快捷、成本低和简单易操作，特别适用于在基层单位的日常检验检疫工作中大范围推广。
【IPC分类】C12Q1/04, C12Q1/68
【公开号】CN105063193
【申请号】CN201510464084
【发明人】张帆涛, 谢建坤, 冉隆科, 罗向东, 周毅
【申请人】江西师范大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月31日