用于鉴定施氏鲟种质的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及鱼类种质的鉴定方法，具体涉及一种用于鉴定施氏舞种质的分子标记 及利用该分子标记鉴定施氏舞种质的方法。
【背景技术】
[0002] 舞形目鱼类是地球现存最古老的鱼类之一，有"活化石"之称。施氏舞（Acipenser dabryanus)属舞形目、舞科、舞属，俗名七粒浮子等，主要分布于黑龙江水系，自下游至上游 额尔古纳河及石勒喀河等；多数分布于黑龙江中游和松花江下游，乌苏里江较少。由于过度 捕捞和水体污染等原因，施氏舞的资源量已经急剧减少。施氏舞2010年被世界自然与资源 保护耳关盟（International Union for Conservation of Nature and Natural Resources 简称IUCN)红色名录列为极度濒j危（Critically Endangered, CR)物种，具有很高的经济价 值和科研价值。
[0003] 目前对于舞形目鱼类的鉴定主要采用形态学和分子生物学等方法，由于形态学不 适用于鱼子酱等舞鱼产品的鉴定，通常采用线粒体上的分子标记鉴定舞鱼及其产品。如 Boscari 等(Boscari, E.,et al. , Species and hybrid identification of sturgeon caviar:a new molecular approach to detect illegal trade. Molecular ecology resources,14(3):489-498.May 2014D0I:10. 1111/1755-0998. 12203ISSN 1755-098X)采 用线粒体D-l〇〇p和S7对施氏舞进行了鉴定，对施氏舞的鉴定准确性不高，操作繁琐。中国 专利申请号200510010346.0,名称为"一种鉴定史氏舞、达氏鳇的技术"的发明专利，它是在 施氏舞、达氏鳇及其产品DNA检测中使用具有种属特异性的DNA分子标记AHN，AHN引物大 小为10bp，碱基序列为cacccggatg。用此引物对施氏舞、达氏|皇及其产品DNA进行PCR检 测，施氏舞可获得200bp电泳带，达氏鳇则无此带，达到对两种鱼及其产品进行鉴定、标识 的目的。该专利方法仅能在一定程度上鉴定出施氏舞，区分施氏舞与达乌尔鳇，仅适用于已 知为施氏舞或达乌尔鳇的疑似样本，因此适用范围较窄。因此，亟待开发出能够简便快速、 准确检测施氏舞与其他舞鱼的分子鉴定技术，用于放流等种质鉴定和市场监管等。
【发明内容】
[0004] 本发明为了鉴定施氏舞及其产品，从分子生物学层面上将形态上不易区分的施氏 舞或其产品进行鉴定，提供了一种用于鉴定施氏舞种质的分子标记及利用该分子标记鉴定 施氏舞种质的方法。本发明在舞科鱼类中筛选核基因片段作为分子标记，应用核基因片段 SNP位点，成功鉴定了施氏舞，同样适用于施氏舞产品的鉴定。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：
[0006] -方面，本发明涉及一种用于鉴定施氏舞种质的分子标记，其为以待测舞科鱼类 基因组DNA为模板，通过特异性引物PCR扩增获得的fzd8基因片段，所述特异性引物的核 苷酸序列为：
[0007]正向引物：5'-TAACCACGACACACAGGATG-3'（SEQ IDN0:8)，
[0008] 反向引物：5' -CTGAATAAAGACACGAACCC-3'（SEQ ID N0:9);
[0009] 上述扩增获得的fzd8基因片段的核苷酸序列中第299位为C或T。
[0010] 另一方面，本发明涉及fzd8基因片段的特异性引物，其核苷酸序列为：
[0011] 正向引物：5'-TAACCACGACACACAGGATG-3'（SEQ ID N0:8);
[0012] 反向引物：5'-CTGAATAAAGACACGAACCC-3'（SEQ ID N0:9)。
[0013] 另一方面，本发明涉及一种鉴定施氏舞种质的方法，其特征在于：
[0014] (1)从待测舞科鱼类样本中提取基因组DNA ;
[0015] (2)以待测舞科鱼类基因组DNA为模板，利用所述fzd8基因片段的特异性引物 PCR扩增fzd8基因片段；
[0016] (3)检测扩增获得的fzd8基因片段并测序，经序列比对直接鉴定；
[0017] 其中扩增获得的fzd8基因片段的核苷酸序列中第299位为C时，样本为施氏舞或 其产品；扩增获得的fzd8基因片段的核苷酸序列中第299位为T时，样本为其他舞鱼或其 产品。
[0018] 本发明所述的舞科鱼类包括施氏舞、达氏舞、中华舞、俄罗斯舞、西伯利亚舞、小体 舞和达乌尔鳇中的任意一种或者多种。
[0019] 所述的施氏舞产品或其他舞鱼产品包括鱼子酱、熏制品、罐头和/或皮制品等。
[0020] 根据本发明，SNP(single nucleotide polymorphism，SNP)是单个核酸差异的分 子标记技术，在物种鉴定领域，方法是依据同一个目的基因序列在近缘物种间的单个碱基 的差异，进而用于研究种群遗传变异和物种鉴定。
[0021] 根据本发明，fzd8是卷曲蛋白基因片段，利用fzd8上含有的单核苷酸多态性 (SNP)位点，用于施氏舞的种质鉴定，具有实验准确快捷，操作简便，适用范围广等优点。
[0022] 本发明以施氏舞、达氏舞、中华舞、俄罗斯舞、西伯利亚舞、小体舞和达乌尔鳇样本 中提取的基因组DNA为模板，用本发明所述fzd8基因片段的特异性引物进行PCR扩增， 得到的fzd8基因片段为707bp，其核苷酸序列分别为SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:7。
[0023] 上述fzd8基因片段经序列比对后，确定fzd8基因片段的核苷酸序列的第299位 点的碱基是C的样本来源于施氏舞，其他舞科鱼类样本来源的fzd8基因片段的第299位 为T。即通过鉴定本发明所述特异性引物扩增出的fzd8基因片段中第299位的碱基是否为 C，可鉴定施氏舞或其产品。
[0024] 本发明的有益效果表现为：
[0025] 1、本发明采用核基因DNA序列作为分子标记，相较于线粒体基因，可以更准确快 速地将形态上不易区分的施氏舞或其产品鉴定出来。采用fzd8基因片段上SNP位点分析 鉴定，具有实验准确，鉴定可靠快捷，操作简便等优点。
[0026] 2、本发明在舞科鱼类中筛选设计了 fzd8基因片段作为分子标记，应用fzd8基因 片段的SNP位点，能把施氏舞或其产品从达氏舞、中华舞、俄罗斯舞、西伯利亚舞、小体舞及 达乌尔鳇中鉴定出来。具有适用的待检测样本来源更广，准确性高，实验快捷，操作简便，结 果准确可靠的优点。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合【具体实施方式】对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。
[0028] 本发明使用的主要仪器如下：
[0029] PCR 仪：Bio-Rad iCycler 和MJ100
[0030]离心机：Eppendorf Centrifuge 5415