专利名称：缺失突变的chiB启动子及其组成型表达蛋白的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是一种经过基因操作产生的苏云金芽胞杆菌几丁质酶编码基因ChiB突变的启动子序列及其应用。具体地描述，从苏云金芽胞杆菌总DNA中克隆出这一几丁质酶启动子序列，经过在其分子的5'-端和3'-端缺失部分碱基序列后，获得比原野生型启动子缩短的序列，该序列称为“chiBp A 135”，将其与不同的表达载体连接，转化不同的苏云金芽胞杆菌，使该转基因细胞组成型表达其下游几丁质酶或其他目的基因的方法和应用。
背景技术：
几丁质是含量仅次于纤维素的生物高分子物质，广泛存在于自然界中。几丁质酶(EC3. 2. I. 14)能特异性水解几丁质，将几丁质降解成几丁单糖以及几丁二糖[(G1cNAc)2]、几丁三糖[(GlcNAc)3]等分子大小不同的几丁寡糖[(GlcNAc)n]。I、几丁质酶在农业方面具有巨大的应用前景，为控制植物病虫害提供了很好的选择。绝大多数植物病原真菌细胞壁都含有大量的几丁质。不少体外抑菌研究证明，几丁质酶能抑制病原真菌孢子的萌发和菌丝的生长{Hoondal，2005#1941 ;ffang, 2002#1965}。因此几丁质酶一直被认为是植物抗真菌病害的潜在物质。许多研究已经将细菌和植物几丁质酶基因转移到大豆、马铃薯、烟草、莴苣、番茄、葡萄及甜菜等植物中，获得了表达几丁质酶活性的转基因植物。Zhang等{Zhang，2011#2043}在催化植物生长根基细菌的基因组中整合枯草芽胞杆菌几丁质酶基因用于提高植物抗病原真菌的能力。这些植物与非转基因植物相比，它们不仅能抗真菌，而且对线虫、昆虫和其它一些病原生物也有一定的抗性。最近，Nature报道了脂质几丁寡糖可作为信号分子刺激植物内生真菌菌丝和菌根的形成，进而促进植物根部发育[3]，这是几丁寡糖在农业应用方面的最新发现。由于几丁质是昆虫甲壳及中肠围食膜的重要组成成分，几丁质酶破坏昆虫这些结构后，可以加速害虫罹病进程，提高死亡率。白僵菌素是著名的生物杀虫毒素，Fan等{Fan, 2007#1976}通过在蚕白僵菌中联合表达外源几丁质酶来提高其杀虫活力。另外研究发现几丁质酶可以杀死或阻止发育阶段中的蚊子幼虫，由此可以设想利用几丁质酶来控制蚊子和由蚊子传播的疾病，而不需使用农药{Dahiya，2006#260}。2、几丁质酶在工业上也具有重要的经济价值。它能提高很多有价值产品的产量。鉴于几丁质衍生物具有重要的药物价值，几丁质酶也用于生产几丁寡聚体、氨基葡萄糖和几丁单体。如，Hayes等{Hayes, 2008#2331}利用几丁质酶从贝类废弃物中生产具有药用价值的壳聚糖；Wang等{Wang，2006#210}利用枯草芽胞杆菌的几丁质酶从贝类废弃物中获取能抑制癌细胞增生的几丁寡聚体;Makino等{Makino，2006#2336}利用芽胞杆菌和沙门氏菌的几丁质酶获得几丁寡聚体。几丁质酶也可直接用于人类卫生保健，例如几丁质酶用于生产眼药，可以作为抗真菌类护肤品的添加剂{Dahiya，2006#260}。在贝类加工中，固体废弃物的主要成份是几丁质、碳酸钙和蛋白。因此可以利用产几丁质酶的真菌生产酵母单细胞蛋白(SCP)。Cody等{Cody，1990#1940}报道曾试图使用几丁质酶将几丁质转变为乙醇。
3、几丁质酶在科学研究中也有重要应用。几丁质和壳聚糖是广泛存在于真菌细胞壁的多聚分子。利用几丁质酶和其它技术的结合可以定位真菌及植物细胞壁中的几丁质。Grenier等{Grenier, 1991#1939}利用大麦几丁质酶和胶体金颗粒来定位真菌菌丝及孢子中的壳聚糖。真菌原生质体是研究细胞壁合成、酶的合成、分泌以及生物技术应用的良好实验材料。而几丁质是真菌细胞壁的组成成份，利用几丁质酶和其它细胞壁降解酶能有效的得到真菌原生质体。Hoondal等{Hoondal, 2005#1941}利用肠杆菌(Enterobacter)的几丁质酶，有效的得到了瑞氏木霉(Trichoderma reesei),佛罗里达侧耳(Pleurotus fIorida)和双孢燕(Agaricus bisporus)等真菌的原生质体。4、高分子量的几丁寡糖有明显的抗肿瘤作用，可激活巨噬细胞和淋巴细胞，增强机体免疫力，已用于抗癌的临床治疗以及药物和保健食品的开发领域[4~6]。 5、在细菌细胞中，有的酶无需诱导便可以表达，称为组成型表达酶。而细菌几丁质酶属于诱导型表达酶，几丁质酶基因的表达是受本身代谢机制控制，如果环境中没有几丁质存在，细胞中的调控机制会关闭这一相关基因。所以，如果细菌细胞可以组成型表达酶，便可以利用普通细菌培养基，使制备酶的方法即简便又经济。虽然目前已从多种芽胞杆菌内克隆到几丁质酶编码基因(chi)，产几丁质酶菌株的酶活性不是很高，且需要诱导培养，这些都制约着几丁质酶的微生物发酵生产技术。
发明内容
本发明的目的之一是克服现有育种技术所存在的效率低且工作量大的不足，提供一种缺失突变的几丁质酶编码基因ChiB启动子及其组成型表达蛋白的应用。若采用传统的育种技术获得组成型表达的基因启动子，主要利用化学及物理诱变剂处理细胞的全部DNA，诱变方法是随机改变细菌全基因组的DNA分子，且DNA的突变频率极低，所以需要大量的诱变及筛选，工作量极大，诱变周期很长。而本发明提供了定向分子操作的方法。所利用的科学原理是，细胞中存在一类负调控基因表达的蛋白，称为阻遏蛋白，该蛋白特异地结合在所调控基因的启动子负控制元件序列上，该序列通常称为操纵子区域。若将操纵子区域删除，则阻遏蛋白失去结合位点，也就失去了负调控基因表达的功能，此时该基因便可以组成型表达。这种定向分子操作的方法只需要很短的时间便可以完成。本发明的目的之二是，利用组成型表达启动子，在以获得几丁质酶为目的的细菌培养过程中不必再添加几丁质作为诱导物，可以简化方法，节约成本，获得更高的酶活性。本发明涉及了缺失的几丁质酶B基因(ChiB)启动子，可以在无诱导物存在的培养条件下，提高同源及异源几丁质酶或其他目的蛋白的表达水平。所述的缺失启动子的这一功能是完全无预期的发现，在利用缺失方法研究chiB启动子功能时，获得所述的缺失启动子，将该片段连接几丁质酶基因后，酶的合成量明显提高，而且不需要几丁质诱导，可以组成型表达。在实施例中，描述了这一缺失启动子的分子改造方法及其序列。在另一实施例中，提供了利用所述的缺失启动子片段构建组成型表达载体的方法，该载体的宿主可以是大肠杆菌(E. coli)或苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)。在随后的2个实施例中，描述了如何不需诱导培养细菌，获得来自其他细菌的异源￠-半乳糖苷酶。在最后一个实施例中，组成型表达的目的蛋白，是来自地衣芽胞杆菌的几丁质酶ChiMY和来自Bt的另一几丁质酶ChiA。本发明提供了缺失启动子片段的获得方法，还提供了利用该启动子在大肠杆菌(E. coli)或苏云金芽胞杆菌(Bt)中不需诱导制备几丁质酶的方法，所述的几丁质酶可以是Bt本身的，也可以是来自其他芽胞杆菌的。本发明首先提供了一种分子定向育种方法，该方法使几丁质酶编码基因chiB启动子序列缩短，防止了阻遏蛋白对基因表达的抑制；所述的序列缩短的方法是将原启动子序列中负控制元件上游作为PCR扩增的一端起始点，这样获得的扩增产物则是缺失了包括负控制元件序列在内的缺失启动子序列。经DNA操作后获得了缺失突变的几丁质酶编码基因chiB启动子序列chiBp A 135,所述序列如序列表SEQ ID No. I所示。构建过程简述如下I)提取大肠杆菌中的重组质粒pMD-chiBp。 2)设计并合成如下两条引物ChiBpi 324-F :5’ -GCATGGATCCCCTTATCTTTCTACG-3，BamH I chiBp 下 _135-R 5，-GTCCGTCGACTAAATCGTAACAAAT-3，Sal I两个引物的5'端分别加入了限制性内切酶BamH I和SalI位点。3)以重组质粒pMD-chiBp为模板，进行PCR反应
反1 组分Mi Aht
绂冲液(IOX)(.含20mmol/LMgCl2)5蜱L
dNTP(2.5mmol/L)2^iL校板 DNAI ~400ng无歯H2O 补足令:50jiL扩增条件94°C变性4min ；touchdown 小程序(94°C变性 40s，46°C退火 45s，72°C延伸35s，共5个循环)，94°C变性35s，50°C退火40s，72°C延伸35s，26个循环72°C维持IOmin04)回收PCR片段，亚克隆到测序载体；再转化到大肠杆菌感受态细胞，在含氨苄青霉素，终浓度为50-100 ii g/ml的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法提取质粒，经PCR扩增和BamH I和Sal I双酶切鉴定阳性克隆。5)对阳性克隆质粒进行测序，确证缺失启动子片段。本发明同时提供了上述构建的缺失突变的几丁质酶编码基因ChiB启动子序列(如SEQ ID No. I所示)的应用，所述的启动子序列能够使与其相连接的核苷酸序列以组成型方式表达，能够利用这一突变的启动子在苏云金芽胞杆菌细胞中组成型、大量表达(制备)目的蛋白，不需要特异添加诱导物。实施本发明的方法时，可以参考下列各个实施例，但这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围及权利要求书的保护范围。本发明的优点和积极效果本发明提供的定向分子育种的原理及其操作方法，适用于包括几丁质酶基因在内的其他需要诱导才能够表达的细菌基因。本发明提供了一段经过分子改造的、缺失的几丁质酶编码基因ChiB启动子序列chiBp A 135，利用该序列及其相连接的几丁质酶基因序列，能够在大肠杆菌及苏云金芽胞杆菌细胞中，不需要诱导以组成型方式制备几丁质酶的方法。所述的几丁质酶，可以是苏云金芽胞杆菌本身的，也可以是来自其他芽胞杆菌的。本发明的积极效果在于培养方法上的 简便性及其经济性，当需要利用大肠杆菌及苏云金芽胞杆菌细胞制备几丁质酶时，可以不添加几丁质作为基因表达的诱导物，因为携带所述缺失启动子序列的细菌可以组成型合成酶，且活性比原菌株提高6倍。
图I为几丁质酶基因全长启动子电泳图。图2为几丁质酶基因缺失启动子电泳图。图3为几丁质酶基因缺失启动子序列。图4为含缺失启动子片段表达载体的构建流程图。图5为大肠杆菌中P -半乳糖苷酶活力检测结果。图6为芽孢杆菌中P -半乳糖苷酶活力检测结果。图7为芽孢杆菌中几丁质酶活力检测结果。
具体实施例方式实施例I、芽胞杆菌几丁质酶chiB基因启动子序列的分离及分子改造第一步，引物一扩增一获得全长启动子片段ChiBp将苏云金芽胞杆菌以色列亚种Bt75 (ATCC 35646)接种于LB液体培养基中，30°C振荡培养14h，提取总DNA，取5 ii L DNA样品，琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和浓度。设计并合成如下两条引物，并且为以后的克隆和构建的需要，两个引物的5'端分另Ij加入了限制性内切酶BamH I和Sal I位点chiBp-F :5’ -GACTGGATCCTTCTAAGTTCTGGAG-3’ (SEQ ID No. 2)BamH IchiBp-R :5’ -TAAGGTCGACTGAATCTGCTAATGC-3’ (SEQ ID No. 3)Sal I以Bt75总DNA为模板，进行PCR反应扩增Bt75chiB基因野生型启动子片段chiBp，其反应体系(50 u L)如下反应ii分加入..
IOxPCR BufferS^iL
dNTP(^2.5mM)4jliL
'Jjfil(IOpM)1.5>iL
W 物 2(10pM)1.5pL
Taq Plus(5U/pL)0.5pL
校板 DN Al-400ng
.AlWH2O扩增条件94°C变性4min ；touchdown 小程序(94°C变性 40s,46°C退火 45s,72°C延伸35s，共5个循环)，94°C变性35s，50°C退火40s，72°C延伸35s，26个循环后72°C维持IOmin0电泳检测结果表明(如图I所示)，图I :几丁质酶基因全长启动子电泳图。将PCR产物纯化回收，回收片段连接到测序载体PMD19-T (Takara公司产品)中；获得重组质粒pMD-chiBp。将其转化到感受态的大肠杆菌DH5 a细胞，在含50 100 u g/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上培养过夜；挑取白色菌落的转化子，再接入含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜，离心收集菌体，用SanPrep柱式质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒，经PCR扩增和限制型内切酶SalI酶切鉴定阳性克隆，送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序。结果显示，chiBp全长606bp,将其序列与Genbank中已有的序列(序列号CP003763. I)比对，显示该片段包含了 Bt几丁质酶基因chiB结构基因的前102个碱基和上游调控序列504个碱基。确证pMD-chiBp连接了 chiB全长启动子片段。第二步，缺失引物——扩增——获得缺失启动子片段chiBp A 135为获得截短缺失的chiB启动子片段，设计并合成如下两条引物，为随后的克隆和构建的需要，两个引物的5'端分别加入了限制性内切酶BamH I和SalI位点chiBp上 324-F :5’ -GC ATGGATCCCCTTATCTTTCTA CG-3’ (SEQ ID No. 4)BamH IchiBpT_m-R :5，-GTCCGTCGACTAAATCGTAACAAAT—3，(SEQ ID No. 5)Sal I以重组质粒pMD-chiBp为模板，对Bt75chiB基因缺失启动子片段chiBp A 135进行PCR扩增，该片段全长189bp(-324至-135)。反应体系，扩增程序和基因操作步骤与上述方法一致。电泳检测结果如图2所示，证明长度大小正确。连接缺失启动子的重组质粒命名为pMD-chiBp A 135。图3为几丁质酶基因缺失启动子序列。实施例2、细菌表达载体pCB-chiBp A 135的构建含缺失启动子片段表达载体的构建流程如图4所示。用试剂盒提取实施例I构建的重组质粒pMD-chiBp A 135，经BamH I和SalI酶切后，释放出缺失启动子片段chiBp A 135，与经过同样酶切的表达载体pCB相连。pCB质粒是本室构建的质粒探测性载体，其构建方法已经于2012年5月在国际刊物《CurentMicrobiology》Vol. 64(5) :492-500, 2012，上发表。构建时选用嗜热脂肪地芽胞杆 菌(B. stearothermophilus)的P _半乳糖苷酶基因bgaB (约2kb)作为报告基因,报告基因上游没有任何启动子序列，故插入任一有功能的启动子，则可以在芽胞杆菌细胞中表达出3 -半乳糖苷酶。随后将连接产物用CaCl2法转化到大肠杆菌DH5 a，从转化子中提取重组质粒并进行PCR扩增及酶切鉴定。将验证正确的重组质粒命名为pCB-chiBp A 135。大肠杆菌转化子命名为E. coli (pCB-75Bp A 135)。将该质粒再转化进苏云金芽胞杆菌Bt75中。芽胞杆菌转化的具体方法为首先制备Bt75菌株感受态。方法为，将Bt75菌株接种于3mL的液体LB培养基中，30°C、200rpm活化12h ;再以1%接种量转接活化的Bt75菌于3mL液体LB培养基中，30°C、200rpm培养3 3. 5h至0D_为I. 0左右；无菌条件下取ImL菌液，9000rpm离心3min,弃上清；将沉淀重悬于0. 75mL预冷的无菌ddH20,4°C下9000rpm离心3min收集菌体；再用0. 2mL预冷的无菌ddH20漂洗一次菌体；最后将细胞沉淀重悬于80uL预冷的20%PEG6_中，获得Bt75感受态细胞，准备用于电转化。将5 IOuL重组质粒pCB-chiBp A 135DNA加入Bt75感受态细胞悬液中，混匀后置于预冷的电击杯中，冰浴IOmin ;使用lKV/mm左右的电压电击混合液，电击完毕后将电击杯冰浴lmin，之后加入ImL SOC液体培养基，在37°C、200rpm震荡条件恢复培养3h，恢复培养 结束后将菌液涂布在含有红霉素抗性(终浓度为50ii g/mL)的LB固体培养基平板上，37°C培养过夜。获得的正确转化子称为Bt75 (pCB-chiBp A 135)。实施例3、pCB_chiBp A 135在大肠杆菌中组成型表达P -半乳糖苷酶基因一bgaB将含有全长启动子的对照菌株E. coli (pCB-chiBp)和含有缺失启动子的实验菌株E. coli (pCB-chiBp A 135)，同时在含有50 u g/mL氨苄青霉素抗性的LB培养基中37°C、200rpm振荡过夜培养12h后，以1%的接种量转接LB培养基，于48h测3 -半乳糖苷酶酶活力。具体操作为取0. 15mL的细菌培养液放入I. 5mL的离心管，加入0. 45mL的10/9Zbuffer，再加入6uL 10%的TritonX-100，混匀后置于冰上直至温浴；55 °C温浴3 5min，加入0. 15mL ONPG溶液(4mg/mL)，并开始计时。当混合液变成黄色时加入0. 3mL的Na2CO3(IM)终止反应，并计时。IOOOrpm离心lOmin，在A42tl波长下测量上清液的吸光值。测定结果显示，含有野生型启动子的对照菌株E. coli (pCB-chiBp)在无诱导物的LB培养基培养条件下，酶活仅达到0. 4U，而含有缺失启动子的实验菌株E. coli (pCB-chiBp A 135)，利用缺失启动子表达的P -半乳糖苷酶活力，同样在无诱导物的培养条件下，酶活达到4U，约是野生型启动子的10倍。具体结果见图5。实施例4、重组质粒pCB-chiBp A 135在芽胞杆菌中组成型表达P -半乳糖苷酶基因一bgaB将含有全长启动子的对照菌株Bt (pCB-chiBp)和含有缺失启动子的实验菌株Bt (pCB-chiBp A 135)在含有50 u g/mL红霉素抗性的LB培养基中30°C、200rpm振荡过夜培养12h后，以1%的接种量转接基本培养基(M)和诱导培养基(C)。基本培养基中除无机盐外加入1%蛋白胨。诱导培养基中除无机盐外加入1%几丁质粉末。培养48h后，分别检测对照Bt菌株和实验Bt菌株3 -半乳糖苷酶酶活力。方法与实施例3所述一致，只是增加破细胞壁的步骤，即加入0. 315mL 10/9的Z buffer后加0. 075mL溶菌酶(4mg/mL)和
0.06mL P -巯基乙醇(29uL/mL),混勻后于37°C温浴30min。后续步骤完全一样。测定结果显示，含有全长启动子的对照菌株Bt (pCB-chiBp)在无诱导物的基本培养基中，酶活仅达到I. 2U左右，而含有缺失启动子的实验菌株Bt (pCB-chiBp A 135)，同样在基本培养基中的酶活力达过7. 5U，约为全长启动子表达酶的6倍，呈现组成型表达。具体结果见图6。实施例5、重组质粒pCB-chiBp A 135在芽胞杆菌中组成型、超量表达2种几丁质酶基因一chiMY，chiA实施例4中测定结果描述可以看出，缺失启动子片段的重组质粒pCB-chiBp A 135，能够在芽胞杆菌中组成型超量表达与之相连的外源基因-bgaB。本实施例中，描述了另外2个不同的结构基因-来自地衣芽胞杆菌几丁质酶基因chiMY和来自苏云金芽胞杆菌几丁质酶基因chiA，在缺失启动子chiBp A 135调控下的组成型、超量表达2种几丁质酶。
I)利用下列一对引物，首先克隆地衣芽胞杆菌几丁质酶基因的结构基因chiMY。chiMY75~F:AAATGTCGACTAAGGAGGAAAAATAGATGAACATCGT (SEQ ID No. 6)SailchiMY75~R GGGTGCATGCTACTCAGACTCCTT (SEQ ID No. 7)SphI扩增条件94°C变性4min ；touchdown 小程序(94°C变性 45s，40°C退火 50s，72°C延伸2min，共4个循环)，94°C变性40s，45°C退火45s，72°C延伸2min，26个循环后72°C维持 IOmin。2)利用下列一对引物，克隆苏云金芽胞杆菌Bt75几丁质酶A基因的结构基因chiAchiA-F:GGGGTCGACTAATTAATTAAAGGAGTGTTGATATG (SEQ ID No. 8)SalIchiA-R:GGGGCATGCTAAATCGTGGTATTGGGAC (SEQ ID No. 9)SphI扩增条件94°C变性4min，94°C变性 35s，48°C退火 40s，72°C延伸 lmin35s，30 个循环后，72°C维持IOmin。将上述得到的各个结构基因片段通过各自的酶切位点与构建好的表达载体pCB-chiBp A 135 连接。首先，将连接产物用CaCl2法转化进大肠杆菌，转化子经PCR及酶切鉴定后，将得到的正确重组质粒分别命名为PDM和pDA。然后，将验证正确的2个重组质粒分别电转化进苏云金芽胞杆菌Bt75菌株中。培养转化子后，按照Joshi等的方法测定几丁质酶活力，具体方法是将芽胞杆菌转化子在无几丁质诱导物的基本培养基中培养3天，SOOOrpm离心IOmin,取200uL上清液加入200uL含10%胶体几丁质的磷酸盐缓冲液(pH6. 0)，50°C水浴Ih ;加入200uL l%NaOH溶液终止反应,混勻后8000rpm离心IOmin ;取400uL上清液于新的EP管中，加入等体积的DNS试剂，混匀后沸水浴5min，以没有反应的培养液做对照，测OD535值。检测结果证明，缺失启动子可以使连接的2个不同来源的几丁质酶编码结构基因，在无诱导物条件下组成型表达几丁质酶，酶活性都达到每毫升7U。而原出发菌株，在无诱导物条件下，酶活性都仅达到每毫升IU左右。具体结果见图7。
SEQUENCE LISTING
<1 io> IW+JT 大学
<120>缺失突变_ chiB扇动子及其绀成S表达蛋ei_应爾 <160> 9
<170> PateutIn veiiion 3.3
<210> I <211> 勝<212> DNA<213> 苏ZC.金芽進杆菌(Bacillus imringifflsis)
<400> I
tctcaacttg ctatgccatt acaagttgaa ctcatacaat tttttctcaa atttaattac60
aaagagcctt ttcctcccta atcaatattt tatttteata tatagtttgt attcaagcct 120
111tgtattg agaaggtctt tttcaa丄-tta ataaagcgtt tacactaaat etttg 180
ttacgattt189
<210> 2 <211> 25 <212'- DKA <213>人IE介成 <400> 2
gacIggatcc ItciaagtIc tggag25
<210> 3 <211> 25 <212> DNA <213>人[:介成 <400> 3
tmggtegm tgaatcigci aatgc26
<210>4
<2!1>25
-DDNA <213>人L合成
<400>4
gcatggatcc CCttatclii ctacg25
<210>5
权利要求
1.ー种分子定向育种方法，该方法使几丁质酶编码基因ChiB启动子序列缩短，防止了阻遏蛋白对基因表达的抑制；所述的序列缩短的方法是将原启动子序列中负控制元件上游作为PCR扩增的一端起始点，这样获得的扩增产物则是缺失了包括负控制元件序列在内的缺失启动子序列。
2.一种经权利要求I所述的方法获得的缺失突变的几丁质酶编码基因chiB启动子序列chiBp Δ 135,所述序列如序列表SEQ ID No. I所示。
3.—种权利要求2所述的缺失突变的几丁质酶编码基因chiB启动子序列chiBp Λ 135的应用，所述的启动子序列能够使与其相连接的核苷酸序列以组成型方式表达，能够利用这ー突变的启动子在苏云金芽胞杆菌或大肠杆菌细胞中组成型、大量表达目的蛋白。
全文摘要
一种缺失突变的几丁质酶编码基因chiB启动子及其组成型表达蛋白的应用。本发明首先提供了一种DNA定向分子育种方法，经所述的方法进行DNA操作后获得的缺失突变的几丁质酶编码基因chiB启动子序列——chiBp△135，如序列表SEQ ID No.1所示。所述的启动子序列，可以使与其相连接的目的基因的核苷酸序列以组成型方式表达。可以利用这一突变的启动子在苏云金芽胞杆菌或大肠杆菌细胞中组成型、大量表达目的蛋白。
文档编号C12N15/70GK102978209SQ20121040886
公开日2013年3月20日 申请日期2012年10月24日 优先权日2012年10月24日
发明者陈月华, 罗洋, 谢池楚, 李蓬飞, 蔡峻 申请人:南开大学