专利名称：Dc-cik细胞分离培养试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及用于分离和培养DC-CIK细胞的试剂盒及其应用。
背景技术：
以肿瘤免疫治疗为核心的生物治疗已成为继手术、放疗和化疗之后的第四种治疗模式。该治疗模式是采用患者自体免疫细胞进行诱导，刺激或辅助人体自身免疫系统，从而完善和增强患者的免疫机能，且治疗手段安全，基本无毒副作用，因此于近年来显示出良好的应用前景。
DC-CIK联合治疗是目前肿瘤生物治疗中最成熟的治疗方案之一。DC(树突状细胞)是迄今发现的功能最强大的抗原提呈细胞，可高效准确识别肿瘤抗原并将信息传递给人体免疫系统，在机体的抗肿瘤免疫中发挥着重要作用；DC主要由骨髓中的髓样干细胞和淋巴样干细胞分化而来，数量较少，仅占外周血单核细胞数量的1%以下。CIK细胞(细胞因子诱导的杀伤细胞)是一种新型免疫活性细胞，兼有T淋巴细胞的强大抗肿瘤活性和NK细胞(自然杀伤细胞)的非主要组织相关性复合物限制性杀瘤的特点，对肿瘤细胞的杀伤活性可达84. 7% ;CIK细胞主要由⑶3+⑶56+和⑶3+⑶8+ T细胞亚群组成，其中⑶3+⑶56+ T细胞为自然杀伤活性T细胞(NKT细胞)，在正常人外周血中含量极少，具有抗肿瘤活性，CD3+CD8+T细胞为细胞毒性T细胞(CTL细胞)，是体内执行细胞免疫功能的主要效应细胞。DC和CIK细胞共同培养联合应用不仅可显著增强CIK的抗肿瘤活性，还可提高CIK对肿瘤靶细胞杀伤作用的特异性。DC-CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤谱广、杀瘤活性高等优势，可在不损伤机体免疫系统结构和功能的前提下直接杀伤肿瘤细胞，并且具有调节和增强机体免疫的功能，尤其是对手术和放化疗后的患者效果更为显著，能消除患者机体微小的残留或转移性病灶，防止癌细胞的扩散和复发，对改善患者生活质量以及提高患者生存率具有重要意义，是现今肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。DC和CIK细胞尚不能直接从组织中大量分离获得，必须经过培养扩增并纯化后才能满足临床应用的需求。目前，国内DC-CIK细胞的分离和培养技术主要存在以下缺点
(I)分离获得的DC和CIK细胞纯度和活性较低。国内主要采用淋巴细胞分离法，分离得到的DC和CIK细胞纯度和活性普遍较低，其中还混杂有较多的红细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、血小板等，当细胞碎片回输入人体后易引发病人出现发热、炎症等不良反应。(2) CIK细胞增殖速度慢，数量少。国内现有技术培养的CIK细胞其增殖速度慢，难以达到肿瘤治疗所需数量级，肿瘤治疗效果欠佳。(3)CIK细胞有效抑瘤因子表达水平低。CIK细胞的细胞毒性与⑶3+⑶56+的表达水平呈正相关，而国内现有技术培养的CIK细胞中⑶3+⑶56+双阳性细胞比例低，双阳性表达率不足10%
发明内容
本申请人针对现有DC-CIK细胞分离和培养技术存在的上述缺陷，经过研究改进，提供一种DC-CIK细胞分离培养试剂盒；本发明的另一个目的在于提供上述DC-CIK细胞分离培养试剂盒在分离和培养DC-CIK细胞中的应用。本发明的技术方案如下
一种DC-CIK细胞分离培养试剂盒，包括
(1)淋巴细胞分离液；
(2)外周血样处理液包括含有质量百分浓度为广3%牛血清白蛋白的D-PBS缓冲液；
(3)CIK细胞诱导增殖体系包括⑶3、白细胞介素-I和白细胞介素-2 ； (4)DC诱导增殖体系包括GM-CSF和白细胞介素-4 ；
(5)细胞培养瓶包被体系包括纤粘连蛋白和Y干扰素；
(6)淋巴细胞培养基GT-T551；
(7)细胞培养袋。本发明还提供了一种上述DC-CIK细胞分离培养试剂盒在分离和培养DC-CIK细胞中的应用，具体步骤如下
(I)外周血样单核细胞的分离取新鲜的人外周血样，在其中加入血液抗凝剂后制得抗凝血样；向所述抗凝血样中加入1/3 2/3体积的所述外周血样处理液，充分混匀，用f I. 5倍体积的所述淋巴细胞分离液分离所得混合液中的单个核细胞，并用所述淋巴细胞培养基GT-T551调节所述单个核细胞密度至1 5X IO6个/mL，得到外周血单核细胞悬液；将所述外周血单核细胞悬液用所述外周血样处理液洗涤，于室温离心5 10 min,转速150(T2000r/min，取白膜层细胞；
(2)DC和CIK细胞的分离
向步骤(I)所得白膜层细胞中加入含有5 10%自体血清的所述淋巴细胞培养基GT-T551，将所得细胞混悬液接种至所述纤粘连蛋白预包被的细胞培养瓶，为瓶A，并于细胞培养箱中进行细胞培养；f5h后，将瓶A中的悬浮细胞接种至所述Y干扰素预包被的细胞培养瓶，为瓶B ;
(3)DC细胞的诱导增殖
向瓶A中的贴壁细胞加入含有5 10%自体血清的所述淋巴细胞培养基GT-T551，并同时加入终浓度为50(T750U/mL的所述GM-CSF以及终浓度为50(Tl000U/mL的所述白细胞介素_4，于细胞培养箱中进行细胞培养；培养过程中每三天更换一次含有5 10%自体血浆的所述淋巴细胞培养基GT-T551，同时再次加入上述GM-CSF和白细胞介素_4 ；5^7天后，收获细胞并将其转移至所述细胞培养袋中进行扩大培养，8 10天后收获细胞，即得DC细胞；
(4)CIK细胞的诱导增殖
向瓶B中加入含有5 10%自体血清的所述淋巴细胞培养基GT-T551，并同时加入终浓度为300飞00 u g/mL的所述⑶3、终浓度为10(T300U/mL的所述白细胞介素_1以及终浓度为500(T7500U/ml的所述白细胞介素-2，于细胞培养箱中进行细胞培养；48 72 h后，换用含有5 10%自体血浆以及终浓度为50(T750万U/L所述白细胞介素_2的所述淋巴细胞培养基GT-T551继续培养；8 10天后，收获细胞并将其转移至所述细胞培养袋中进行扩大培养，14 16天后收获细胞，即得CIK细胞；
(5)DC与CIK细胞的共培养将步骤(3)所得DC细胞和步骤(4)所得CIK细胞按照细胞数量比1:5 1:8的比例混合培养，得到DC-CIK细胞；
所述自体血清分离自添加了血液促凝剂的所述人外周血样；
所述自体血浆分离自步骤(I)所制抗凝血样；
以上百分含量如无特殊说明均为体积百分含量。其进一步的技术方案为
步骤(3)所述扩大培养是在所述淋巴细胞培养基GT-T551中进行的。步骤(4)所述扩大培养是在含有5 10%所述自体血浆以及终浓度50(T750万U/L 的所述白细胞介素-2的所述淋巴细胞培养基GT-T551中进行的。步骤(5 )所述混合培养是在含有f 5%所述自体血浆以及终浓度50(T750万U/L的所述白细胞介素-2的所述淋巴细胞培养基GT-T551中进行的。与现有DC-CIK细胞分离和培养技术相比，本发明具有如下有益技术效果
I.本发明试剂盒分离所得淋巴细胞具有很高的纯度和活性，经检测细胞纯度和活性(活细胞百分率)均能达到98%以上。2.本发明试剂盒共培养的CIK细胞增殖速度快，经检测，用本发明试剂盒进行DC-CIK细胞共培养的CIK细胞在培养第14天数量可达2. 5 X IO9个/L，完全满足肿瘤治疗所需有效数量级。3.本发明试剂盒培养的⑶3+⑶56+双阳性细胞比例高，经检测培养14天后⑶3+⑶56+双阳性细胞可达52. 3%，具有很好的临床效应。
4.本发明试剂盒操作方法简单，条件易控，可广泛应用于人和哺乳动物DC-CIK细胞的分离培养。
图I为本发明实施例2中CIK细胞培养第0 14天的生长状态图。图2为本发明实施例2中DC细胞培养第7天的形态观测图。图3为本发明实施例2中不同培养时间(0 15天)⑶3+⑶56+细胞的流式细胞仪检测结果，其中，右上角方框中显示的是⑶3+⑶56+细胞。图4为本发明实施例2中不同培养时间(0 14天)⑶3+⑶56+细胞的间接免荧光法检测结果。
具体实施例方式以下结合附图，并通过实施例对本发明进行具体说明。实施例I 实施例3中所述血库浓缩白细胞血采集自医院肿瘤病人，所述自体血清分离自添加了血液促凝剂的上述血库浓缩白细胞血，分离步骤为取上述血液于3000r/min离心30min,吸取上清即得。所述自体血浆分离自添加了肝素的上述血库浓缩白细胞血，分离步骤为同上。实施例I
本实施例中DC-CIK细胞分离培养试剂盒组成如下
(I)淋巴细胞分离液；(2)外周血样处理液含有质量百分浓度为1%牛血清白蛋白的D-PBS缓冲液；
(3)CIK细胞诱导增殖体系⑶3、白细胞介素-I和白细胞介素-2 ；
(4)DC诱导增殖体系GM-CSF、白细胞介素-4 ；
(5)细胞培养瓶包被体系纤粘连蛋白、Y干扰素；
(6)淋巴细胞培养基GT-T551。 将上述试剂盒应用于DC-CIK细胞的分离培养，具体步骤如下
(I)外周血样单核细胞的分离吸取20mL淋巴细胞分离液置于50mL离心管中，取20mL添加了肝素的血库浓缩白细胞血，并在其中加入8mL外周血样本处理液(含有质量百分浓度为1%牛血清白蛋白的D-PBS缓冲液)，充分混匀，将所得混合液沿试管壁缓慢加至上述淋巴细胞分离液液面上方，加样过程中勿使血液混入淋巴细胞分离液；将该离心管置于水平式离心机内，于室温以2000r/min的转速离心15min ；吸去上层血衆,用毛细吸管吸取单个核细胞，并用淋巴细胞培养基GT-T551调节单个核细胞密度至I X IO6个/mL，得到外周血单核细胞悬液；将所得外周单核细胞悬液用5倍体积的外周血样处理液洗涤3次，于室温以1500r/min的转速离心8 min，取白膜层细胞。(2) DC和CIK细胞的分离
向步骤(I)所得白膜层细胞中加入20mL淋巴细胞培养基GT-T55U含ImL自体血清)，将所得细胞混悬液接种至纤粘连蛋白预包被的T75方瓶，为瓶A，并于5%C02恒温细胞培养箱中进行细胞培养；Ih后，将瓶A中的悬浮细胞接种至Y干扰素预包被的T75方瓶，为瓶B ；
(3)DC细胞的诱导增殖
向瓶A中的贴壁细胞加入20mL淋巴细胞培养基GT-T551 (含ImL自体血清)，同时加入终浓度为500U/mL的GM-CSF以及终浓度为750U/mL的白细胞介素_4，于5%C02恒温细胞培养箱中进行细胞培养；培养过程中每三天更换一次新鲜的淋巴细胞培养基GT-T551 (含5%的自体血浆)，同时再次加入上述GM-CSF和白细胞介素-4 ；5天后收获细胞并将其转移至I. 8L细胞培养袋中进行扩大培养(培养基为GT-T551)，10天后收获细胞，即得DC细胞。(4) CIK细胞的诱导增殖
向瓶B中加入20mL淋巴细胞培养基GT-T551 (含ImL自体血清)，并同时加入终浓度为400 ii g/mL的CD3、终浓度为100U/mL的白细胞介素_1以及终浓度为7500U/mL的白细胞介素_2，于5%C02恒温细胞培养箱中进行细胞培养；48h后，将瓶B细胞转移至T175方瓶，换用60mL新鲜的淋巴细胞培养基GT-T551 (含3mL自体血浆以及终浓度为750万U/L的白细胞介素-2)继续培养，8天后，收获细胞并将其转移至I. 8L细胞培养袋中进行扩大培养，培养液为含5%自体血浆以及终浓度为750万U/L的白细胞介素-2的淋巴细胞培养基GT-T551，两天补一次液，每次补加IOOmL新鲜的淋巴细胞培养基GT-T551 (含1%自体血浆以及终浓度为750万U/L的白细胞介素_2)，14天后收获细胞即得CIK细胞；
(5)DC与CIK细胞的共培养
将步骤(3 )所得DC细胞和步骤(4)所得CIK细胞经活细胞计数后按照细胞数量比1:8的比例于含有1%自体血浆以及终浓度为750万U/L的白细胞介素-2的淋巴细胞培养基GT-T551中混合培养，14天后得到DC-CIK细胞。实施例2本实施例中DC-CIK细胞分离培养试剂盒组成如下
(1)淋巴细胞分离液
(2)外周血样处理液含有质量百分浓度为2.5%牛血清白蛋白的D-PBS缓冲液；
(3)CIK细胞诱导增殖体系⑶3、白细胞介素-I和白细胞介素-2 ；
(4)DC诱导增殖体系GM-CSF、白细胞介素-4 ；
(5)细胞培养瓶包被体系纤粘连蛋白、Y干扰素；
(6)淋巴细胞培养基GT-T551。将上述试剂盒应用于DC-CIK细胞的分离培养，具体步骤如下
(I)外周血样单核细胞的分离吸取20mL淋巴细胞分离液置于50mL离心管中，取20mL添加了肝素的血库浓缩白细胞血，并在其中加入IOmL外周血样本处理液(含有质量百分浓度为2. 5%牛血清白蛋白的D-PBS缓冲液)，充分混匀，将所得混合液沿试管壁缓慢加至上述淋巴细胞分离液液面上方，加样过程中勿使血液混入淋巴细胞分离液；将该离心管置于水平式离心机内，于室温以2000r/min的转速离心15min ；吸去上层血衆,用毛细吸管吸取单个核细胞，并用淋巴细胞培养基GT-T551调节单个核细胞密度至3 X IO6个/mL，得到外周血单核细胞悬液；将所得外周单核细胞悬液用5倍体积的外周血样处理液洗涤3次，于室温以2000r/min的转速离心5 min,取白膜层细胞。(2) DC和CIK细胞的分离
向步骤(I)所得白膜层细胞中加入20mL淋巴细胞培养基GT-T55U含2mL自体血清)，将所得细胞混悬液接种至纤粘连蛋白预包被的T75方瓶，为瓶A，并于5%C02恒温细胞培养箱中进行细胞培养；2h后，将瓶A中的悬浮细胞接种至Y干扰素预包被的T75方瓶，为瓶B ；
(3)DC细胞的诱导增殖
向瓶A中的贴壁细胞加入20mL淋巴细胞培养基GT-T551 (含2mL自体血清)，同时加入终浓度为750U/mL的GM-CSF以及终浓度为500U/mL的白细胞介素_4，于5%C02恒温细胞培养箱中进行细胞培养；培养过程中每三天更换一次新鲜的淋巴细胞培养基GT-T551 (含10%的自体血浆)，同时再次加入上述GM-CSF和白细胞介素-4 ；6天后收获细胞并将其转移至
I.8L细胞培养袋中进行扩大培养(培养基为GT-T551)，9天后收获细胞，即得DC细胞。(4) CIK细胞的诱导增殖
向瓶B中加入20mL淋巴细胞培养基GT-T551 (含2mL自体血清)，并同时加入终浓度为300 u g/mL的⑶3、终浓度为100U/mL的白细胞介素_1以及终浓度为5000U/mL的白细胞介素-2，于5%C02恒温细胞培养箱中进行细胞培养；48 h后，将瓶B细胞转移至T175方瓶，换用60mL新鲜的淋巴细胞培养基GT-T551(含6mL自体血浆以及终浓度为500万U/L的白细胞介素-2)继续培养，9天后，收获细胞并将其转移至I. 8L细胞培养袋中进行扩大培养，培养液为含10%自体血浆以及终浓度为500U/L的白细胞介素-2的淋巴细胞培养基GT-T551，两天补一次液，每次补加IOOmL新鲜的淋巴细胞培养基GT-T551 (含1%自体血浆以及终浓度为500万U/L的白细胞介素_2)，15天后收获细胞即得CIK细胞；
(5) DC与CIK细胞的共培养
将步骤(3)所得DC细胞和步骤(4)所得CIK细胞经活细胞计数后按照细胞数量比1:5的比例于含有5%自体血浆以及终浓度为500万U/L的白细胞介素-2的淋巴细胞培养基GT-T551中混合培养，15天后得到DC-CIK细胞。实施例3
本实施例中DC-CIK细胞分离培养试剂盒组成如下
(1)淋巴细胞分离液
(2)外周血样处理液含有质量百分浓度为3%牛血清白蛋白的D-PBS缓冲液；
(3)CIK细胞诱导增殖体系CD3、白细胞介素-1和白细胞介素-2 ；
(4)DC诱导增殖体系GM-CSF、白细胞介素-4 ；
(5)细胞培养瓶包被体系纤粘连蛋白、Y干扰素；
(6)淋巴细胞培养基GT-T551。将上述试剂盒应用于DC-CIK细胞的分离培养，具体步骤如下
(1)外周血样单核细胞的分离吸取20mL淋巴细胞分离液置于50mL离心管中，取20mL添加了肝素的血库浓缩白细胞血，并在其中加入15mL外周血样本处理液(含有质量百分浓度为3%牛血清白蛋白的D-PBS缓冲液)，充分混匀，将所得混合液沿试管壁缓慢加至上述淋巴细胞分离液液面上方，加样过程中勿使血液混入淋巴细胞分离液；将该离心管置于水平式离心机内，于室温以2000r/min的转速离心15min ；吸去上层血衆,用毛细吸管吸取单个核细胞，并用淋巴细胞培养基GT-T551调节单个核细胞密度至5 X 1O6个/mL，得到外周血单核细胞悬液；将所得外周单核细胞悬液用5倍体积的外周血样处理液洗涤3次，于室温以1800r/min的转速离心10 min，取白膜层细胞。(2) DC和CIK细胞的分离
向步骤(1)所得白膜层细胞中加入20mL淋巴细胞培养基GT-T551 (含1. 5mL自体血清)，将所得细胞混悬液接种至纤粘连蛋白预包被的T75方瓶，为瓶A，并于5%C02恒温细胞培养箱中进行细胞培养；5h后，将瓶A中的悬浮细胞接种至Y干扰素预包被的T75方瓶，为瓶B ;
(3) DC细胞的诱导增殖
向瓶A中的贴壁细胞加入20mL淋巴细胞培养基GT-T551 (含1. 5mL自体血清)，同时加入终浓度为600U/mL的GM-CSF以及终浓度为1000U/mL的白细胞介素_4，于5%C02恒温细胞培养箱中进行细胞培养；培养过程中每三天更换一次新鲜的淋巴细胞培养基GT-T551(含7. 5%的自体血浆)，同时再次加入上述GM-CSF和白细胞介素-4 ;7天后收获细胞并将其转移至I. 8L细胞培养袋中进行扩大培养(培养基为GT-T551)，8天后收获细胞，即得DC细胞。(4) CIK细胞的诱导增殖
向瓶B中加入20mL淋巴细胞培养基GT-T551 (含1. 5mL自体血清)，并同时加入终浓度为500 u g/mL的⑶3、终浓度为200U/mL的白细胞介素_1以及终浓度为6000U/mL的白细胞介素-2，于5%C02恒温细胞培养箱中进行细胞培养；72h后，将瓶B细胞转移至T175方瓶，换用60mL新鲜的淋巴细胞培养基GT-T551 (含4. 5mL自体血浆以及终浓度为600万U/L的白细胞介素-2)继续培养，10天后，收获细胞并将其转移至I. 8L细胞培养袋中进行扩大培养，培养液为含7. 5%自体血浆以及终浓度为600万U/L的白细胞介素-2的淋巴细胞培养基GT-T551，两天补一次液，每次补加IOOmL新鲜的淋巴细胞培养基GT-T551 (含1%自体血浆以及终浓度为600万U/L的白细胞介素_2)，16天后收获细胞即得CIK细胞；
(5)DC与CIK细胞的共培养将步骤(3)所得DC细胞和步骤(4)所得CIK细胞经活细胞计数后按照细胞数量比1:6的比例于含有3%自体血浆以及终浓度为600万U/L的白细胞介素-2的淋巴细胞培养基GT-T551中混合培养，14天后得到DC-CIK细胞。实施例4 DC-CIK细胞的相关性能指标检测
1.活细胞百分率和细胞纯度的测定
采用台盼兰活细胞计数法对实施例I 实施例3中与DC细胞共培养的CIK活细胞进行计数(第14天)，得出活细胞百分率，计算公式为活细胞百分率=(活细胞数/细胞总数)X 100%o采用镜检法检测细胞纯度，计算公式为细胞纯度=(I-血细胞数/活细胞总数)X 100%
结果参见表I。表I CIK活细胞计数、活细胞百分率以及细胞纯度测定结果
权利要求
1.ー种DC-CIK细胞分离培养试剂盒，其特征在于包括 (1)淋巴细胞分离液； (2)外周血样处理液包括含有质量百分浓度为广3%牛血清白蛋白的D-PBS缓冲液； (3)CIK细胞诱导增殖体系包括⑶3、白细胞介素-1和白细胞介素-2 ； (4)DC诱导增殖体系包括GM-CSF和白细胞介素_4 ； (5)细胞培养瓶包被体系包括纤粘连蛋白和Y干扰素； (6)淋巴细胞培养基GT-T551； (7)细胞培养袋。
2.权利要求I所述DC-CIK细胞分离培养试剂盒在分离和培养DC-CIK细胞中的应用，其特征在于具体步骤如下(I)外周血样单核细胞的分离取新鮮的人外周血样，在其中加入血液抗凝剂后制得抗凝血样；向所述抗凝血样中加入1/3 2/3体积的所述外周血样处理液，充分混匀，用f I. 5倍体积的所述淋巴细胞分离液分离所得混合液中的单个核细胞，并用所述淋巴细胞培养基GT-T551调节所述单个核细胞密度至1 5X IO6个/mL，得到外周血单核细胞悬液；将所述外周血单核细胞悬液用所述外周血样处理液洗涤，于室温离心5 10 min,转速150(T2000r/min，取白膜层细胞； (2)DC和CIK细胞的分离 向步骤(I)所得白膜层细胞中加入含有5 10%自体血清的所述淋巴细胞培养基GT-T551，将所得细胞混悬液接种至所述纤粘连蛋白预包被的细胞培养瓶，为瓶A，并于细胞培养箱中进行细胞培养；f5h后，将瓶A中的悬浮细胞接种至所述Y干扰素预包被的细胞培养瓶，为瓶B ; (3)DC细胞的诱导增殖 向瓶A中的贴壁细胞加入含有5 10%自体血清的所述淋巴细胞培养基GT-T551，并同时加入终浓度为50(T750U/mL的所述GM-CSF以及终浓度为50(Tl000U/mL的所述白细胞介素_4，于细胞培养箱中进行细胞培养；培养过程中每三天更换一次含有5 10%自体血浆的所述淋巴细胞培养基GT-T551，同时再次加入上述GM-CSF和白细胞介素_4 ；5^7天后，收获细胞并将其转移至所述细胞培养袋中进行扩大培养，8 10天后收获细胞，即得DC细胞； (4)CIK细胞的诱导增殖 向瓶B中加入含有5 10%自体血清的所述淋巴细胞培养基GT-T551，并同时加入终浓度为30(Γ500 μ g/mL的所述⑶3、终浓度为10(T300U/mL的所述白细胞介素_1以及终浓度为500(T7500U/mL的所述白细胞介素-2，于细胞培养箱中进行细胞培养；48 72 h后，换用含有5 10%自体血浆以及终浓度为50(Γ750万U/L所述白细胞介素-2的所述淋巴细胞培养基GT-T551继续培养；8 10天后，收获细胞并将其转移至所述细胞培养袋中进行扩大培养，1Γ16天后收获细胞，即得CIK细胞； (5)DC与CIK细胞的共培养 将步骤(3)所得DC细胞和步骤(4)所得CIK细胞按照细胞数量比1:5 1:8的比例混合培养，得到DC-CIK细胞； 所述自体血清分离自添加了血液促凝剂的所述人外周血样； 所述自体血浆分离自步骤(I)所制抗凝血样；以上百分含量如无特殊说明均为体积百分含量。
3.根据权利要求2所述DC-CIK细胞分离培养试剂盒在分离和培养 DC-CIK细胞中的应用，其特征在于步骤(3)所述扩大培养是在所述淋巴细胞培养基GT-T551中进行的。
4.根据权利要求2所述DC-CIK细胞分离培养试剂盒在分离和培养DC-CIK细胞中的应用，其特征在于步骤(4)所述扩大培养是在含有5 10%所述自体血浆以及终浓度50(Γ750万U/L的所述白细胞介素-2的所述淋巴细胞培养基GT-T551中进行的。
5.根据权利要求2所述DC-CIK细胞分离培养试剂盒在分离和培养DC-CIK细胞中的应用，其特征在于步骤(5)所述混合培养是在含有f 5%所述自体血浆以及终浓度50(Γ750万U/L的所述白细胞介素-2的所述淋巴细胞培养基GT-T551中进行的。
全文摘要
本发明提供一种DC-CIK细胞分离培养试剂盒及其应用，该试剂盒包括淋巴细胞分离液、外周血样处理液、CIK细胞诱导增殖体系、DC诱导增殖体系、细胞培养瓶包被体系、淋巴细胞培养基GT-T551以及细胞培养袋；其在分离和培养DC-CIK细胞中的应用，具体步骤如下外周血样单核细胞的分离、DC和CIK细胞的分离、DC细胞的诱导增殖、CIK细胞的诱导增殖以及DC与CIK细胞的共培养。本发明试剂盒分离所得淋巴细胞具有很高的纯度和活性、CIK细胞增殖速度快、CD3+CD56+双阳性细胞比例高、操作方法简单，条件易控，可广泛应用于人和哺乳动物DC-CIK细胞的分离培养。
文档编号C12N5/078GK102978161SQ201210409099
公开日2013年3月20日 申请日期2012年10月24日 优先权日2012年10月24日
发明者齐来俊 申请人:江阴齐氏生物科技有限公司