专利名称：一种分离培养嗅鞘细胞的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于组织工程领域，具体地，涉及一种快速分离嗅鞘细胞的试剂盒、该试剂盒的应用以及一种快速分离嗅鞘细胞的方法。
背景技术：
嗅鞘细胞是目前所发现的极少数中枢神经系统可以再生的细胞之。其特点为终身具有神经再生功能，还能够释放多种神经营养因子、神经粘附分子，被认为是髓鞘化能力最强的胶质细胞，正在逐步用于治疗脊髓损伤。嗅鞘细胞与胶质细胞、许旺细胞在表现型上有共同点，它们都能促进轴突的再生，主要区别在于嗅鞘细胞不但存在于中枢神经系统，也存在于外周神经中。嗅黏膜中的神经元是唯一出生后才生长并在成年时继续分化的神经元，寿命为4 12周，随着新细胞的生长，又建立了新的神经支配关系。嗅鞘细胞存在于嗅神经及嗅球的神经层上，沿嗅神经的全长，从周围神经系统到中枢神经分布。嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells, OECs)是在功能上介于施旺细胞和少突胶质细胞之间的一种特殊的胶质细胞，具有神经营养、抑制胶质增生、瘢痕形成、成鞘作用等。嗅鞘细胞为轴突生长提供了适宜的微环境，具有较强的迁移特性，使其成为促进中枢神经再生的理想候选细胞之一。目前，对于嗅鞘细胞的分离培养、扩增还没有统一的标准。现阶段用于嗅鞘细胞的分离培养方法主要有机械方法解离嗅球，但经过这种机械分散方法，细胞破碎较多，细胞活性差。在体外神经元培养过程中采用胰蛋白酶生化消化和机械消化，并在显微镜下密切观察，可以避免消化不充分和过度，使细胞活性提高。纯化细胞的方法较多，一般有差速贴壁、化学药物法、梯度离心法、免疫亲和吸附法。后者纯化效果最好，其纯度可达99 %以上，是目前普 遍采用的方法之一。但是此法步骤较为繁琐，费用高，同时细胞经过反复清洗，活性下降，于是给下一步培养带来了一定的困难。
发明内容
为了解决嗅鞘细胞分离的纯度、数量和时间的问题，本发明提供了一种快速分离嗅鞘细胞的试剂盒。利用此试剂盒，能有效纯化哺乳动物嗅鞘细胞，快速获得大量嗅鞘细胞，以利于下一步的实验研究。根据本发明的一个方面，本发明的快速分离嗅鞘细胞的试剂盒包括洗涤液，细胞培养液和细胞消化液，其中:所述洗涤液:本发明所述的洗涤液为ACSF(人工脑脊液)所述培养液:本发明所述的培养基A为DMEM基础培养基；本发明所述的培养液B为胎牛血清(美国GIBCO公司)所述消化液:本发明所述消化液为89%胰酶，10% DNA酶，I %肝素。根据本发明的一个方面，所述嗅鞘细胞源自哺乳动物。根据本发明的一个方面，所述洗涤液、培养液以及细胞消化液是无菌的。根据本发明的一个方面，所述洗涤液、培养液以及细胞消化液为独立包装。
根据本发明的一个方面，用于嗅鞘细胞培养的细胞培养液是将细胞培养液按照9:I比例配置的细胞培养混合液。本发明的另一目的在于提供了一种快速分离嗅鞘细胞的方法。该方法将嗅球用洗涤液ACSF洗涤，经胰酶消化后，得到嗅球细胞，经原代培养，传代培养最终获得分离的嗅鞘细胞。
图1是原代嗅鞘细胞培养7天后的细胞观察2是原代嗅鞘细胞传代培养后的细胞形态观察图
具体实施例方式实施例1根据本发明的一个方面，所述快速分离嗅鞘细胞的方法可通过下述步骤实现:由于主要影响纯化的是成纤维 细胞，因此在培养24-48小时后加入阿糖胞苷，可以优先抑制和杀灭进入分裂期的成纤维细胞，但OECs也受到一定程度的抑制。使用BPE (牛脑垂体抽提物)来促进OECs增殖，第8-16d可得到生长状态良好的OECs，纯度可达80%。OECs细胞表面具有特异性的低亲和神经营养因子受体(L-NGFR)，可以特异性的与LNGFR抗体结合，为免疫纯化提供了基础，免疫纯化后纯度可以提高到98%。本发明的培养方法采用培养24小时首次半量换液方法，利用在原代培养24_48h后加入阿糖胞苷，可以有效抑制和杀灭进入分裂期的成纤维细胞，但OECs也受到一定程度的抑制。使用BPE(牛脑垂体抽提物)来促进OECs增殖，从而确保了细胞培养和传代过程中的生长和纯化效果。实施例2根据本发明的一个方面，所述快速分离嗅鞘细胞的方法可包括:嗅鞘细胞的原代分离培养利用洗涤液将细胞清洗,消化液消化后,收集细胞、离心、弃去上悬液,用细胞培养混合液充分吹打成单细胞悬液，接种培养。接种24小时后，半量换液，继续培养，以后每3天更换一次细胞培养混合液。7天即可完成原代培养。嗅鞘细胞的传代培养弃除原代培养的培养混合液，用洗涤液充分清洗细胞，去除悬浮在贴壁细胞表面的圆形细胞，加入细胞消化液，待细胞回缩、细胞间隙增大时，加入细胞培养混合液，充分吹打、离心，弃上清液，然后接种、培养。嗅鞘细胞的收获细胞密度达90%，弃去原培养液，加入细胞消化液进行消化，收获培养的嗅鞘细胞。
权利要求
1.一种分离培养嗅鞘细胞的试剂盒，包括: 洗涤液:本发明所述的洗涤液为ACSF(人丁脑脊液)，4°C保存。
培养液A:本发明所述的培养基A为DMEM基础培养基。
培养液B:本发明所述的培养液B为胎牛血清(美国GIBCO公司)。
细胞消化液:本发明所述消化液为89%胰酶，10% DNA酶，1%肝素。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述洗涤液、培养液以及细胞消化液是无菌的。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述洗涤液、培养液以及细胞消化液是独立包装。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述嗅鞘细胞源自于哺乳动物。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述培养液的技术指标如下:渗透压(240-340m0sm/kg)、ρΗ(7.0-7.5)、总蛋白含量(3-3.5g/100ml)、血红蛋白((20mg/100ml)
6.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述培养液为培养液A与培养液B的混合培养基。
7.根据权利要求1所 述的试剂盒，其特征在于:所述磷酸盐缓冲液为0.01M，所述细胞消化液以质量/体积百分比浓度0.25%的胰蛋白酶液为主，内含DNA酶和肝素。
8.一种分离嗅球细胞的方法，包括: 1)利用传统分离法获得嗅鞘细胞，经细胞培养混合液培养获得原代细胞的嗅球细胞。
2)利用洗涤液冲洗步骤I)获得的嗅球细胞，随后用细胞消化液消化，经传代培养获得传代培养的嗅球细胞； 3)利用细胞消化液对步骤2)获得的传代培养的嗅球细胞进行消化，获得分离的嗅球细胞，其中洗涤液为ACSF (人工脑脊液)；细胞培养混合液为按照9: I体积比来配制的培养液A与培养液B，其中培养液A为DMEM，B为胎牛血清；以及细胞消化液(89%胰酶，10%DNA酶，I %肝素)。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在步骤I)中，采用24小时半量更换细胞培养混合液。
10.根据权利要求8所述的方法，其中在步骤2)中，传代培养使细胞密度达到90%。
全文摘要
本发明提供了一种快速分离嗅鞘细胞的试剂盒及方法。该试剂盒包括洗涤液、细胞培养液A、细胞培养液B和细胞消化液。其中洗涤液为人工脑脊液，细胞培养液A为DMEM培养基，细胞培养液B为胎牛血清，细胞消化液为89％胰酶、10％DNA酶和1％肝素。与传统分离培养方法相比，采用此试剂盒，培养24小时后，通过半量换液方式进行培养和纯化，所得到的细胞纯度更高，增殖更快，一般7天即可完成原代细胞培养。将原代细胞传代，利用培养液进行培养，一般2-3天细胞密度即可达到90％，为使用嗅鞘细胞进行进一步的医学和生物学研究提供了丰富的细胞来源。
文档编号C12N5/079GK103087988SQ20111033760
公开日2013年5月8日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者田杰 申请人:北京清美联创干细胞科技有限公司