专利名称：一株对蒸汽爆破预处理产物具有解毒作用的构巢裸胞壳的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株构巢裸胞壳。
技术背景
化石能源将逐步枯竭，新能源和可再生能源为能源供给提供了重要选择，燃料乙醇作为一种C、H比例小、燃烧热值大、CO2排放量低的燃料，正日益受到广泛关注。以玉米、 小麦等粮食为原料生产乙醇威胁着粮食安全，因此以木质纤维素为原料生产乙醇，即纤维乙醇得到各国政府的支持。
预处理方法是制约纤维乙醇发展的瓶颈之一，对于糖得率和发酵性能有重要影响。蒸汽爆破法处理过程中无需加入化学品，且处理后纤维素的酶水解率较高，具有处理时间短、环境污染小、低能耗的优势，是目前比较推崇的预处理技术。但由于蒸爆过程的处理条件比较激烈，这一过程中会产生甲酸、乙酸、糠醛和羟甲基糠醛等发酵抑制物，会对后续的发酵过程产生影响，因此需要对汽爆物料进行脱毒处理。解毒方法主要包括生物解毒、物理解毒、化学解毒。其中生物解毒是指用一些特定的酶或微生物作用于发酵抑制物，通过改变抑制物的结构而降低其毒性，包括酶处理法和微生物处理法。微生物处理方法与酶处理方法的原理是相同的，但微生物能够持续地产生多种酶，能同时去除多种抑制物质，与酶处理法相比具有成本低，解毒效率高的优点。发明内容
本发明提供了一株构巢裸胞壳(Emericella nidulans)，能够去除乙酸、糠醛和羟甲基糠醛等蒸汽爆破预处理所产生的发酵抑制物，提高燃料乙醇的得率。
本发明对蒸汽爆破预处理产物具有解毒作用的构巢裸胞壳为构巢裸胞壳 110 (Emericella nidulans 110)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年12月M日， 保藏编号为CGMCC No. 4514。
本发明的构巢裸胞壳110 (Emericella nidulans 110)属于子囊菌门(Ascomycota)，散囊菌目(Eurotiales)，发菌禾斗(Trichocomaceae)，曲菌属 (Aspergillus)。
本发明构巢裸胞壳110在刚果红纤维素琼脂培养基上培养，菌落呈圆形，结构致密，边缘呈锯齿状，菌落隆起，干燥，不透明(如图1所示)，培养2天菌落直径为8mm ；在普通光学显微镜下观察，菌丝体为白色，菌丝有隔，产灰绿色孢子，分生孢子头(如图2和图3 所示)。
本发明构巢裸胞壳110可在刚果红纤维素琼脂培养基和察氏培养基中生长，最适生长温度28 0C，最适pH值为6。
本实施方式构巢裸胞壳110对经蒸汽爆破预处理产物具有解毒作用，可以清除抑制纤维素降解和发酵的有毒物质，这些有毒物质包括Ca2+、Mg2+、Al3+、狗2+、乙酸、丙酸、丁酸、糠醛和5-羟甲基2-呋喃甲醛。
本发明构巢裸胞壳110 (Emericella nidulans 110)保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年12月M日，保藏编号为CGMCC No. 4514。
图1为本发明构巢裸胞壳110的菌落形态图；图2为本发明构巢裸胞壳110的透视电镜照片；图3为本发明构巢裸胞壳110的扫描电镜照片；图4为构巢裸胞壳110和相近菌株的18S rDNA序列进行同源性比对构建的系统发育树图；图5构巢裸胞壳110对Ca2+的去除效果；图6为构巢裸胞壳110对Mg2+的去除效果；图7为构巢裸胞壳110对Al3+的去除效果；图8为构巢裸胞壳110对!^2+的去除效果；图9为构巢裸胞壳110以葡萄糖为碳源对有机酸的代谢效果，其中- -为乙酸，-Δ-为丁酸，为丙酸；图10为构巢裸胞壳110以混合有机酸为碳源的代谢效果，其中- -为乙酸，-Δ -为丁酸，-□-为丙酸； 图11为构巢裸胞壳110以木糖为碳源对有机酸的代谢效果，其中- -为乙酸，-Δ -为丁酸，-■-为丙酸；图12为构巢裸胞壳110对糠醛在40°C的共代谢效果，其中- -为以糠醛为唯一碳源，-□-为以葡萄糖作主要碳源；图13为构巢裸胞壳110对糠醛在35°C的共代谢效果，其中- -为以糠醛为唯一碳源，-口 -为以葡萄糖作主要碳源；图14为构巢裸胞壳110对羟甲基糠醛(5-羟甲基2-呋喃甲醛)在40°C的共代谢效果，其中- -为以 5-羟甲基2-呋喃甲醛为唯一碳源，-■-为以葡萄糖作碳源；图15为构巢裸胞壳110对羟甲基糠醛(5-羟甲基2-呋喃甲醛)在35°C的共代谢效果其中- -为以5-羟甲基2-呋喃甲醛为唯一碳源，-■-为以葡萄糖作碳源。
具体实施方式
具体实施方式
一本实施方式对蒸汽爆破预处理产物具有解毒作用的构巢裸胞壳为构巢裸胞壳110 (Emericella nidulans 110)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年 12月24日，保藏编号为CGMCC No. 4514。
本实施方式构巢裸胞壳110在刚果红纤维素琼脂培养基上培养，菌落呈圆形，结构致密，边缘呈锯齿状，菌落隆起，干燥，不透明，培养2天菌落直径为8mm ；在普通光学显微镜下观察，菌丝体为白色，菌丝有隔，产灰绿色孢子，分生孢子头。
本实施方式构巢裸胞壳110可在刚果红纤维素琼脂培养基和察氏培养基中生长， 最适生长温度280C，最适pH值为6。
刚果红纤维素琼脂培养基(IOOOmL)由0. 50g Κ2ΗΡ04、0· 25g MgS04、1. 88g纤维素粉、0. 20g刚果红、14g琼脂、2g明胶和余量的蒸馏水组成，调节pH为5，于121°C灭菌30min。 察氏培养基(IOOOmL)由 3g NaNO3>0. 50g Κ2ΗΡ04、0· 5g KC1、0. Olg FeS04、30g 蔗糖、20g 琼脂和余量的蒸馏水组成，于121°C灭菌30min。
具体实施方式
二本实施方式构巢裸胞壳110 (Emericella nidulans 110)由秸秆堆肥中分离、纯化得到，具体步骤为取IOg秸秆堆肥，放入IOOmL装有玻璃珠的无菌水中，振荡1小时后制成混浊液；吸取5mL悬浮液装入盛有30mL马铃薯葡萄糖液体培养基的三角瓶中，于100r/min、35°C的条件下培养3 5天；之后更换新鲜的马铃薯葡萄糖液体培养基继续培养，转接5 6次后进行分离，得富集培养后的培养液。取富集培养后的培养液，采用倍比稀释法将样品稀释至10、ΙΟ"2, ΙΟ"3, ΙΟ"4,10_5，将稀释液滴入无菌的刚果红纤维素琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均勻地涂布在培养基表面，在35°C培养 4天，挑选水解圈较大的单独菌落移入斜面，进行菌种分离。待斜面菌体生长饱满后进行平板划线纯化培养，至菌落形态一致，结合显微镜检测个体形态特征后，再挑选单一菌落移种斜面，即得到构巢裸胞壳110。
所述马铃薯葡萄糖液体培养基(IOOmL)由200g、20g葡萄糖和余量的蒸馏水组成， 于 121°C 灭菌 30min。
对分离纯化得到的构巢裸胞壳110进行分子生物学鉴定，按以下步骤进行提取菌株的总DNA，采用真菌通用引物ITS扩增构巢裸胞壳FLZlO的18s rDNA ITS序列，PCR产物纯化后，进行测序，测序结果与GenBank中的18S rDNA序列进行同源性比对，然后用软件CLUSTALX 1. 83和MEGA 4. 1以近邻结合法构建系统发育树(如图4所示)，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列与四脊裸胞壳(Emericella quadrilineata)的 18S rDNA序列的同源性最高，保守区相似性为100%，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定构巢裸胞壳110属于曲霉属，为构巢裸胞壳。
PCR引物购买自上海生工生物技术有限公司。
本实施方式构巢裸胞壳110对经蒸汽爆破预处理产物具有解毒作用，可以清除抑制纤维素降解和发酵的有毒物质，这些有毒物质包括Ca2+、Mg2+、Al3+、狗2+、乙酸、丙酸、丁酸、糠醛和5-羟甲基2-呋喃甲醛。无机离子方面，构巢裸胞壳110对Ca2+、Mg2+、Al3+、Fe2+ 均有明显的去除效果，培养48h去除率分别为70 %、50 %、90 %、80 %。有机物方面，35 °C时以葡萄糖为碳源的培养基中，构巢裸胞壳110对乙酸、丙酸、丁酸于96h的去除率可分别达 24. 20 %、30. 92 %、27. 73 %。35°C时以葡萄糖为碳源的培养基中，构巢裸胞壳110对糠醛和 5-羟甲基2-呋喃甲醛的去除率分别为56. 52%、69. 21%。
对无机离子的去除试验将察氏培养基分装于4个IOOmL的三角瓶中，每个三角瓶分装50mL，培养基中葡萄糖的质量百分比浓度为1%。在4个三角瓶的培养基中分别加入 Ca2+、Mg2+、Al3+和Fe2+，使培养基中的离子浓度分别为|丐离子800mg/L、镁离子500mg/L、铝离子80mg/L、铁离子350mg/L，调节pH至5. 0，于115°C灭菌30min。向4个培养基中分别接种构巢裸胞壳110，于40°C、150rpm/min培养48小时，然后于0h、24h和4 取样，采用离子发射光谱(ICP)测定各离子浓度。
本实施方式构巢裸胞壳110对Ca2+的去除效果如图5所示，构巢裸胞壳110对Mg2+ 的去除效果如图6所示，构巢裸胞壳110对Al3+的去除效果如图7所示，构巢裸胞壳110对 Fe2+的去除效果如图8所示。从图中可以看出，随着培养的进行，培养液中的离子浓度下降趋势明显。构巢裸胞壳110对过量的Ca2+有明显的去除作用，培养4 去除率可达70% ； 构巢裸胞壳110对!^2+的去除作用明显，培养4 去除率可达80% ；构巢裸胞壳110可以对Mg2+进行去除，培养4 去除率在50%左右；构巢裸胞壳110在培养4 对Al3+的去除率可达90%。
通过以上分析可见，构巢裸胞壳110对Ca+、Mg2+、Al3+和Fe2+均有明显的去除效果， 由此可以推测，由于构巢裸胞壳110的存在可以代谢发酵液中部分过量的离子，使得酵母所需的离子处于适宜的浓度范围内，在一定程度上解除过量离子对酵母的抑制作用。
对有机酸的去除试验将乙酸、丙酸和丁酸混合，使每种酸在察氏培养基中的体积浓度均为2%，得混合酸，将混合酸分别加到察氏培养基中，①葡萄糖作为碳源，混合酸加到察氏培养基中；②混合酸做碳源，混合酸加到不加葡萄糖的察氏培养基中；③木糖作为碳源，混合酸加到以木糖替代葡萄糖的察氏培养基中。以上三组培养基均调节PH为5. 5，分别接种构巢裸胞壳110进行培养，于0h、24h、4a!、7a!、％h分别取样，用气相色谱测定有机酸浓度。
本实施方式构巢裸胞壳110以葡萄糖为碳源对有机酸的代谢效果如图9所示，构巢裸胞壳110以混合有机酸为碳源的代谢效果如图10所示，构巢裸胞壳110以木糖为碳源对有机酸的代谢效果如图11所示。从图9中可看出，在35°C时，乙酸、丙酸和丁酸三种酸在培养96h时浓度均有下降，96h的去除率可分别达24. 20%、30. 92%、27. 73%。从图10 中可看出，在35°C时，虽然从Oh 96h的趋势较为起伏，在培养24h浓度均有明显的降低， 其后又逐渐升高。但总体来说，培养96h乙酸、丙酸和丁酸三种酸浓度有略微的下降，分别降低12.75^^9.76^^10.68 ^木糖是发酵醪液中一种主要的五碳糖，由半纤维素降解得到。通常情况下，微生物更容易直接利用的碳源是葡萄糖，但当木糖作为唯一初级能源物质存在时，从图11中可看出，构巢裸胞壳110也可以通过木糖作为碳源进行共代谢，在35°C 时，三种酸的浓度均有降低，乙酸、丙酸和丁酸的去除率分别为13. 73%、19. 76%,22. 12%.
对醛的去除试验分为以下四组进行，(1)葡萄糖作为碳源，的糠醛加到察氏培养基中；的糠醛加到无葡萄糖的察氏培养基中；C3)葡萄糖作为碳源，的5-羟甲基2-呋喃甲醛加到察氏培养基中；1 %的5-羟甲基2-呋喃甲醛加到无葡萄糖的察氏培养基中；四组培养基中分别接种构巢裸胞壳110进行培养，以上四组实验条件均为 pH5. 5，分别在40°C (SSF工艺温度)和35°C (SHF工艺发酵温度)进行。分别于0h、24h、 48h.72h.96h取样，用液相色谱测定5-羟甲基2-呋喃甲醛浓度，紫外分光光度发测定糠醛浓度。
本实施方式构巢裸胞壳110对糠醛在40°C的共代谢效果如图12所示，构巢裸胞壳 110对糠醛在35°C的共代谢效果如图13所示。由图可见，在以葡萄糖作为碳源的培养基中， 两种温度下，构巢裸胞壳110对于糠醛均有去除作用，在24h会有浓度略微的升高，然后培养基中的糠醛浓度几乎呈直线下降，培养96h，35°C和40°C条件下的去除率分别为56. 52% 和观.10%。这说明构巢裸胞壳110可以在葡萄糖存在条件下代谢糠醛，且在35°C条件下， 更适合构巢裸胞壳110对糠醛的去除。在无葡萄糖的培养体系中，24h糠醛浓度有较大的升高，而后培养中糠醛浓度基本维持恒定，无明显的去除效果，说明在没有可利用的初级能源物质存在的条件下，构巢裸胞壳110不能代谢糠醛。
本实施方式构巢裸胞壳110对羟甲基糠醛(5-羟甲基2-呋喃甲醛)在40°C的共代谢效果如图14所示，构巢裸胞壳110对羟甲基糠醛(5-羟甲基2-呋喃甲醛)在35°C的共代谢效果如图15所示。由图可见，构巢裸胞壳110对于5-羟甲基2-呋喃甲醛的去除效果与对糠醛的去除类似，在含有葡萄糖的培养基中，35°C和40°C条件下的去除率分别为 69. 21%,50. 25%。在无葡萄糖的培养基中无明显的去除效果。
权利要求
1. 一株对蒸汽爆破预处理产物具有解毒作用的构巢裸胞壳，其特征在于对蒸汽爆破预处理产物具有解毒作用的构巢裸胞壳为构巢裸胞壳110 (Emericella nidulans 110)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2010年12月M 日，保藏编号为CGMCC No. 4514。
全文摘要
一株对蒸汽爆破预处理产物具有解毒作用的构巢裸胞壳，涉及一株构巢裸胞壳。本发明提供了一株构巢裸胞壳，能够去除乙酸、糠醛和羟甲基糠醛等蒸汽爆破预处理所产生的发酵抑制物，提高燃料乙醇的得率。本发明对蒸汽爆破预处理产物具有解毒作用的构巢裸胞壳为构巢裸胞壳110，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2010年12月24日，保藏编号为CGMCC No.4514。构巢裸胞壳110对经蒸汽爆破预处理产物具有解毒作用，可以清除抑制纤维素降解和发酵的有毒物质，这些有毒物质包括Ca2+、Mg2+、Al3+、Fe2+、乙酸、丙酸、丁酸、糠醛和5-羟甲基2-呋喃甲醛。
文档编号C12P7/10GK102505000SQ20111033752
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月31日 优先权日2011年10月31日
发明者于艳玲, 冯玉杰, 徐琛, 李冬梅, 李梓木 申请人:哈尔滨工业大学