专利名称：一种培养嗅鞘细胞的培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉 及生物技术领域，尤其涉及一种培养嗅鞘细胞的培养基。
背景技术：
嗅鞘细胞是目前所发现的极少数中枢神经系统可以再生的细胞之一，其特点为终身具有神经再生功能，还能够释放多种神经营养因子、神经粘附分子，被认为是髓鞘化能力最强的胶质细胞，逐渐用于治疗脊髓损伤。嗅鞘细胞与胶质细胞、许旺细胞在表现型上有共同点，它们都能促进轴突的再生，主要区别在于嗅鞘细胞不但存在于中枢神经系统，也存在于外周神经中。嗅黏膜中的神经元是唯一生后才生长并在成年时继续分化的神经元，寿命为4 12周，随着新细胞的生长，又建立了新的神经支配关系。嗅鞘细胞存在于嗅神经及嗅球的神经层上，沿嗅神经的全长，从周围神经系统到中枢神经分布。何首乌主要含三类有效成分二苯乙烯苷类化合物、蒽醌类化合物及聚合原花青素。此外还含有卵磷脂和多种微量元素。二苯乙烯苷类化合物是一类具有显著药理活性的水溶性成分，其代表成分二苯乙烯苷，具有显著的降脂作用。迄今为止，仅报导了几种分离和生长灵长类干细胞的次优方法。例如，使用添加了白血病抑制因子(LIF)的无饲养物(feeder)培养，将鼠科嗅鞘细胞维持在未分化状态。另一方面，当细胞在无饲养物细胞层或来自适宜饲养物细胞系的条件培养基下培养时，即使存在LIF，人嗅鞘细胞也会分化。采用饲养物细胞(或来自饲养物细胞培养物的条件培养基)的系统通常使用来自不同物种的细胞而不是正培养的干细胞，例如在大部分报道的人嗅鞘细胞未分化生长中，小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)会形成饲养层(feeder layer)。而且，无饲养物系统的报道通常需要使用来自DMEM培养物的条件培养基，其不能满足非异种产物/试剂的需要。甚至采用人饲养物细胞的系统具有将未分化细胞暴露于不确定培养条件下的缺陷，因此许多干细胞培养条件通常是不可再现的。此外，对于大多数细胞疗法，治疗需要极大量的多能干细胞。根据使用埃德蒙顿方案的胰岛移植所需的细胞数量，所需的分化细胞估计量在109-1010细胞的数量级。通常，人们利用经筛选、适于人OECs生长的牛血清，作为细胞增殖的主要刺激物，体外培养扩增0ECS。然而，研究表明，在培养过程中，OECS可以吞噬培养体系中的牛蛋白，使异种蛋白内在化，每1080ECS中牛蛋白含量达到10-30mg。因此，使用牛血清培养人OECs用于细胞治疗，不仅将使病人暴露于催患人畜共患病的风险，也可能因移植OECS死亡释放牛蛋白，引起机体免疫反应，造成血清病或其它免疫性疾病。此外，每批次血清的活性是不同的，对批次间收获的细胞的稳定性，有一定影响。因此，利用一种无动物血清成分的培养基，培养扩增0ECS，对治疗的安全性和有效性，都是十分必要的。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种培养嗅鞘细胞的培养基。本发明提供的培养基，包括基础培养基、生物素、谷氨酞胺、碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子。所述培养基还包括胰岛素、硒元素、人血白蛋白、组分I、组分2、组分3、组分4、组分5、组分6和组分7 ；所述组分I为氯化铁、氯化铬、氯化铜、氯化锰、氯化锌和钥酸钠中的至少一种；所述组分2为激活素A、转化生长因子-P、骨形成蛋白-2、白血病抑制因子、干细胞生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子-I、促红细胞生成素、血清素、血小板源生长因子BB、白介素-6中的至少一种；所述组分3为如下组分3-1或组分3-2，所述组分3-1为胆固醇，所述组分3_2为亚油酸、亚麻酸、中链甘油三酯、卵磷脂和大豆油中的至少一种；所述组分4为维生素B、维生素A、维生素C、维生素E中的至少一种； 所述组分5为地塞米松或氢化考的松；所述组分6为转铁蛋白、乙酞辅酶A、辅酶I中至少一种；所述组分7为L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-门冬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、撷氨酸、苏氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、肤氨酸和甘氨酸中的至少一种；所述培养基由基础培养基、生物素、谷氨酞胺、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素、硒元素、人血白蛋白、组分I、组分2、组分3、组分4、组分5、组分6和组分7组成。所述生物素在所述培养基中的终浓度为5-50PM ；所述谷氨酞胺在所述培养基中的终浓度为5-10pM ；所述碱性成纤维细胞生长因子在所述培养基中的终浓度为l-100ng/mL;所述表皮生长因子在所述培养基中的终浓度为l-150ng/mL;所述胰岛素在所述培养基中的终浓度为l-100pg/mL ；所述硒元素在所述培养基中的终浓度为IO-IOOnM;所述人血白蛋白在所述培养基中的终浓度为l-50mg/mL;所述氯化铁在所述培养基中的终浓度为50-1000ng/mL ；所述氯化铬在所述培养基中的终浓度为O. l-10pg/L ；所述氯化铜在所述培养基中的终浓度为O. Ι-lmg/L ；所述氯化锰在所述培养基中的终浓度为O. 01-0. lmg/L ；所述氯化锌在所述培养基中的终浓度为O. l-10pg/L ；所述钥酸钠在所述培养基中的终浓度为lOO-lOOOng/mL;所述激活素A在所述培养基中的终浓度为l-100ng/ml ；所述转化生长因子-p在所述培养基中的终浓度为l-100ng/mL ;所述骨形成蛋白-2在所述培养基中的终浓度为l-100ng/mL ；所述白血病抑制因子在所述培养基中的终浓度为l-100ng/mL;所述干细胞生长因子在所述培养基中的终浓度为l-100ng/mL ；所述肝细胞生长因子在所述培养基中的终浓度为l-100ng/mL ；所述胰岛素样生长因子-I在所述培养基中的终浓度为l_150ng/mL ；所述促红细胞生成素在所述培养基中的终浓度为0. l-50U/mL ；
所述血清素在所述培养基中的终浓度为1-lOOnM/L;所述血小板源生长因子BB在所述培养基中的终浓度为l_50ng/mL ；所述白介素-6在所述培养基中的终浓度为5_50ng/ml ；所述胆固醇在所述培养基中的终浓度为10-100pg/mL;所述亚油酸在所述培养基中的终浓度为l_50mg/L;所述亚麻酸在所述培养基中的终浓度为l-50pg/mL;所述中链甘油三酯在所述培养基中的终浓度为l-500pg/mL;所述卵磷脂在所述培养基中的终浓度为O. l-20pg/mL ；·所述大豆油在所述培养基中的终浓度为l-500pg/mL;所述维生素B在所述培养基中的终浓度为I-IOOpM ；所述维生素A在所述培养基中的终浓度为1_200ρΜ ；所述维生素C在所述培养基中的终浓度为30_100pg/mL ；所述维生素E在所述培养基中的终浓度为10-100pg/mL ；所述地塞米松在所述培养基中的终浓度为O-IOpM ；所述氢化考的松在所述培养基中的终浓度为O-IOpM ；所述转铁蛋白在所述培养基中的终浓度为10-100pg/ml ；所述乙酞辅酶A在所述培养基中的终浓度为0. l-10U/mL ；所述辅酶I在所述培养基中的终浓度为10-1000ng/ml ；所述组分7中的每种氨基酸在所述培养基中的终浓度为1-100ρΜ。所述生物素在所述培养基中的终浓度为5_30pM ；所述谷氨酞胺在所述培养基中的终浓度为5-7. 5pM ；所述碱性成纤维细胞生长因子在所述培养基中的终浓度为5_50ng/mL ；所述表皮生长因子在所述培养基中的终浓度为25-100ng/ml ；所述胰岛素在所述培养基中的终浓度为2. 5-20pg/ml ；所述硒元素在所述培养基中的终浓度为30_50nM ；所述人血白蛋白在所述培养基中的终浓度为2-20mg/ml ；所述氯化铁在所述培养基中的终浓度为100_500ng/mL ;所述氯化铬在所述培养基中的终浓度为2_5pg/L ；所述氯化铜在所述培养基中的终浓度为O. 5-0. 8mg/L ；所述氯化锰在所述培养基中的终浓度为O. 05-0. 08mg/L ；所述氯化锌在所述培养基中的终浓度为l_5pg/L;所述钥酸钠在所述培养基中的终浓度为200_500ng/mL ；所述激活素A在所述培养基中的终浓度为5_50ng/ml ；所述转化生长因子-P在所述培养基中的终浓度为5_50ng/ml ；所述骨形成蛋白-2在所述培养基中的终浓度为5-50ng/ml ；所述白血病抑制因子在所述培养基中的终浓度为5_50ng/ml ；所述干细胞生长因子在所述培养基中的终浓度为5_50ng/ml ；所述肝细胞生长因子在所述培养基中的终浓度为10_50ng/ml ；所述胰岛素样生长因子-I在所述培养基中的终浓度为25-100ng/ml ；
所述促红细胞生成素在所述培养基中的终浓度为O. 5-50U/ml ；所述血清素在所述培养基中的终浓度为20_50nM/L ；所述血小板源生长因子BB在所述培养基中的终浓度为5_20ng/mL ；所述白介素-6在所述培养基中的终浓度为5_20ng/mL ；所述胆固醇在所述培养基中的终浓度为20-50pg/mL ；所述亚油酸在所述培养基中的终浓度为10_50mg/L ； 所述亚麻酸在所述培养基中的终浓度为10-50pg/mL ；所述中链甘油三酯在所述培养基中的终浓度为50_200pg/mL ；所述卵磷脂在所述培养基中的终浓度为5-10pg/mL ；所述大豆油在所述培养基中的终浓度为50-200pg/mL ；所述维生素B在所述培养基中的终浓度为20_50pM ；所述维生素A在所述培养基中的终浓度为20_50pM ；所述维生素C在所述培养基中的终浓度为45_50pM ；所述维生素E在所述培养基中的终浓度为20-50pg/mL ；所述地塞米松在所述培养基中的终浓度为2_5pM ；所述氢化考的松在所述培养基中的终浓度为2_5pM ；所述转铁蛋白在所述培养基中的终浓度为20_50pg/ml ；所述乙酞辅酶A在所述培养基中的终浓度为1-lOU/mL ；所述辅酶I在所述培养基中的终浓度为25_200ng/ml ；所述组分7中的每种氨基酸在所述培养基中的终浓度为20_50pM。所述基础培养基为DMEM培养基(Invitrogen，21041025)；所述硒元素来源于亚硒酸钠。所述的培养基在促进离体嗅鞘细胞增值中的应用也是本发明保护的范围。所述嗅鞘细胞为人嗅鞘细胞。本发明的另一个目的是提供一种培养嗅鞘细胞的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤将离体嗅鞘细胞在所述的培养基中培养，获得增殖嗅鞘细胞。所述培养温度为36°C _38°C，所述培养时间为3-10天；所述培养温度具体为37. 5°C，所述培养时间具体为10天。所述嗅鞘细胞为人嗅鞘细胞。本发明的实验证明，本发明提供的培养基培养灵长类嗅鞘细胞，该培养基基本上无饲养物细胞，培养得到的细胞增殖率高、增值时间短，而同时维持干细胞分化成内胚层、中胚层和外胚层组织衍生物的潜能，并同时维持干细胞的核型。
图I为不同培养基培养的嗅鞘细胞细胞形态(7d)图2为细胞生长曲线
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、嗅鞘细胞的在不同培养基中的培养I、嗅鞘细胞的培养I)预处理利用PBS洗漆液将离体的人嗅鞘细胞(Olfactory Ensheathing Cells, OECs,记载在 Lim F,Martin-Bermejo MJ,Garcia-Escudero V,Gallego-Hernandez MT,Garcia_G0mezAiRabano AiDiaz-Nido J,Avi la JiMoreno-Flores MT. Reversibly immortalized humanolfactory ensheathing glia from an elderly donor maintain neuroregenerativecapacity. Glia. 2010,58(5) =546-58.公众可从北京清美联创干细胞科技有限公司获得。 )清洗，胰蛋白酶消化液消化37. 5°C，3min后，收集细胞、离心、弃去上悬液，收集细胞。PBS 洗漆液,Invitrogen,目录号 10010031 ；胰蛋白酶消化液，Invitrogen,目录号25300054。2)原代培养将步骤I)得到的细胞用细胞培养液I充分吹打成单细胞悬液，接种于细胞培养液I中培养24小时，半量换液，继续培养，以后每3天更换一次细胞培养液1，培养7天即可完成原代培养，得到原代培养细胞。3)传代培养将步骤2)的原代培养产物弃除原代培养的培养混合液，用洗涤液充分清洗细胞，去除悬浮在贴壁细胞表面的圆形细胞，加入胰蛋白酶消化液，待细胞回缩、细胞间隙增大时，加入细胞培养液1，充分吹打、离心(1000rpm，10min，室温)、弃上清液、接种、培养温度为37. 5°C，培养10天，得到实验组传代的细胞。细胞培养液I按照如下步骤制备将DMEM培养基(Invitrogen，21041025)、生物素、谷氨酞胺、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素、硒元素、人血白蛋白、组分I、组分2、组分3、组分4、组分5、组分6和组分7混合，得到细胞培养液I ;所述组分I为氯化铁、氯化铬、氯化铜、氯化锰、氯化锌和钥酸钠；所述组分2为激活素A、转化生长因子-P、骨形成蛋白-2、白血病抑制因子、干细胞生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子-I、促红细胞生成素、血清素、血小板源生长因子BB、白介素-6 ；所述组分3为胆固醇；所述组分4为维生素B、维生素A、维生素C、维生素E ；所述组分5为地塞米松；所述组分6为转铁蛋白、乙酞辅酶A、辅酶I ;所述组分7为L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-门冬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、撷氨酸、苏氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、肤氨酸和甘氨酸；所述生物素在所述培养基中的终浓度为5pM ；所述谷氨酞胺在所述培养基中的终浓度为5pM ；所述碱性成纤维细胞生长因子在所述培养基中的终浓度为5ng/mL ；
所述表皮生长因子在所述培养基中的终浓度为25ng/ml ；所述胰岛素在所述培养基中的终浓度为2. 5pg/ml ；所述硒元素在所述培养基中的终浓度为30nM ；所述人血白蛋白在所述培养基中的终浓度为2mg/ml ；所述氯化铁在所述培养基中的终浓度为100ng/mL ；所述氯化铬在所述培养基中的终浓度为2pg/L ；所述氯化铜在所述培养基中的终浓度为O. 5mg/L ；所述氯化锰在所述培养基中的终浓度为O. 05mg/L ；·
所述氯化锌在所述培养基中的终浓度为lpg/L ；所述钥酸钠在所述培养基中的终浓度为200ng/mL ；所述激活素A在所述培养基中的终浓度为5ng/ml ；所述转化生长因子-P在所述培养基中的终浓度为5ng/ml ；所述骨形成蛋白-2在所述培养基中的终浓度为5ng/ml ；所述白血病抑制因子在所述培养基中的终浓度为5ng/ml ；所述干细胞生长因子在所述培养基中的终浓度为5ng/ml ；所述肝细胞生长因子在所述培养基中的终浓度为10ng/ml ；所述胰岛素样生长因子-I在所述培养基中的终浓度为25ng/ml ；所述促红细胞生成素在所述培养基中的终浓度为O. 5U/ml ；所述血清素在所述培养基中的终浓度为20nM/L ；所述血小板源生长因子BB在所述培养基中的终浓度为5ng/mL ；所述白介素-6在所述培养基中的终浓度为5ng/mL ；所述胆固醇在所述培养基中的终浓度为20pg/mL ；所述维生素B在所述培养基中的终浓度为20pM ；所述维生素A在所述培养基中的终浓度为20pM ；所述维生素C在所述培养基中的终浓度为45pM ；所述维生素E在所述培养基中的终浓度为20pg/mL ；所述地塞米松在所述培养基中的终浓度为2pM ；所述转铁蛋白在所述培养基中的终浓度为20pg/ml ；所述乙酞辅酶A在所述培养基中的终浓度为lU/mL ；所述辅酶I在所述培养基中的终浓度为25ng/ml ；所述组分7中的每种氨基酸在所述培养基中的终浓度为20pM。采用同样的方法，将传代培养中的细胞培养液I替换为DMEM/F12培养基，得到对照的传代细胞。2、检测细胞增殖和计算倍增时间I)分别将上述各种传代培养7天后的实验组传代细胞和对照的传代细胞进行显微镜观察(400倍观察)，结果如图I所示，其中，A为基础培养基DMEM/F12培养的嗅鞘细胞(对照的传代细胞)为本发明培养基培养的嗅鞘细胞(实验组传代的细胞)，从图中看出，两组均有突起细长的嗅鞘细胞，且实验组传代的细胞的数量明显多于对照组。2)检测细胞增殖
用CCK-8试剂盒方法检测(日本同仁化学研究所，CK04-500)细胞增殖，在450nm波长下检测上述传代的实验组传代细胞和对照的传代细胞在10天中的OD值，并绘出细胞增殖曲线，结果如图2所示。按下列倍增时间计算公式计算倍增时间，TD为倍增时间，Λ t为计数间隔天数，Nt为对数生长期任一点的理论观察值，N0为对数生长期理论初始值。计算公式如下
权利要求
1.一种培养嗅鞘细胞的培养基,包括基础培养基、生物素、谷氨酞胺、碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子。
2.根据权利要求I所述的培养基，其特征在于所述培养基还包括胰岛素、硒元素、人血白蛋白、组分I、组分2、组分3、组分4、组分5、组分6和组分7 ； 所述组分I为氯化铁、氯化铬、氯化铜、氯化锰、氯化锌和钥酸钠中的至少一种； 所述组分2为激活素A、转化生长因子-P、骨形成蛋白-2、白血病抑制因子、干细胞生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子-I、促红细胞生成素、血清素、血小板源生长因子BB、白介素-6中的至少一种； 所述组分3为如下组分3-1或组分3-2，所述组分3-1为胆固醇，所述组分3-2为亚油酸、亚麻酸、中链甘油三酯、卵磷脂和大豆油中的至少一种； 所述组分4为维生素B、维生素A、维生素C、维生素E中的至少一种； 所述组分5为地塞米松或氢化考的松； 所述组分6为转铁蛋白、乙酞辅酶A、辅酶I中至少一种； 所述组分7为L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-门冬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、撷氨酸、苏氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、肤氨酸和甘氨酸中的至少一种； 所述培养基由基础培养基、生物素、谷氨酞胺、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素、硒元素、人血白蛋白、组分I、组分2、组分3、组分4、组分5、组分6和组分7组成。
3.根据权利要求I或2所述的培养基，其特征在于 所述生物素在所述培养基中的终浓度为5-50pM ； 所述谷氨酞胺在所述培养基中的终浓度为5-10pM ； 所述碱性成纤维细胞生长因子在所述培养基中的终浓度为Ι-lOOng/mL ； 所述表皮生长因子在所述培养基中的终浓度为l_150ng/mL ； 所述胰岛素在所述培养基中的终浓度为1-lOOpg/mL ； 所述硒元素在所述培养基中的终浓度为IO-IOOnM ； 所述人血白蛋白在所述培养基中的终浓度为l_50mg/mL ； 所述氯化铁在所述培养基中的终浓度为50-1000ng/mL ； 所述氯化铬在所述培养基中的终浓度为O. l-10pg/L ； 所述氯化铜在所述培养基中的终浓度为O. 1-lmg/L ； 所述氯化锰在所述培养基中的终浓度为O. 01-0. lmg/L ； 所述氯化锌在所述培养基中的终浓度为O. l-10pg/L ； 所述钥酸钠在所述培养基中的终浓度为lOO-lOOOng/mL ； 所述激活素A在所述培养基中的终浓度为l-100ng/ml ； 所述转化生长因子-P在所述培养基中的终浓度为Ι-lOOng/mL ； 所述骨形成蛋白-2在所述培养基中的终浓度为l-100ng/mL ； 所述白血病抑制因子在所述培养基中的终浓度为l-100ng/mL ； 所述干细胞生长因子在所述培养基中的终浓度为l-100ng/mL ； 所述肝细胞生长因子在所述培养基中的终浓度为l-100ng/mL ；所述胰岛素样生长因子-I在所述培养基中的终浓度为l-150ng/mL ；所述促红细胞生成素在所述培养基中的终浓度为O. l-50U/mL ；所述血清素在所述培养基中的终浓度为Ι-ΙΟΟηΜ/L ；所述血小板源生长因子BB在所述培养基中的终浓度为l_50ng/mL ；所述白介素-6在所述培养基中的终浓度为5-50ng/ml ；所述胆固醇在所述培养基中的终浓度为10-100pg/mL ； 所述亚油酸在所述培养基中的终浓度为l_50mg/L ；所述亚麻酸在所述培养基中的终浓度为l_50pg/mL ；所述中链甘油三酯在所述培养基中的终浓度为l_500pg/mL ；所述卵磷脂在所述培养基中的终浓度为O. l-20pg/mL ；所述大豆油在所述培养基中的终浓度为l_500pg/mL ；所述维生素B在所述培养基中的终浓度为I-IOOpM ；所述维生素A在所述培养基中的终浓度为1_200ρΜ ；所述维生素C在所述培养基中的终浓度为30-100pg/mL ；所述维生素E在所述培养基中的终浓度为10-100pg/mL ；所述地塞米松在所述培养基中的终浓度为O-IOpM ；所述氢化考的松在所述培养基中的终浓度为O-IOpM ；所述转铁蛋白在所述培养基中的终浓度为10-100pg/ml ；所述乙酞辅酶A在所述培养基中的终浓度为0. l-10U/mL ；所述辅酶I在所述培养基中的终浓度为10-1000ng/ml ；所述组分7中的每种氨基酸在所述培养基中的终浓度为1-100ρΜ。
4.根据权利要求1-3中任一所述的培养基,其特征在于所述生物素在所述培养基中的终浓度为5-30pM ；所述谷氨酞胺在所述培养基中的终浓度为5-7. 5pM ；所述碱性成纤维细胞生长因子在所述培养基中的终浓度为5-50ng/mL ；所述表皮生长因子在所述培养基中的终浓度为25-100ng/ml ；所述胰岛素在所述培养基中的终浓度为2. 5-20pg/ml ；所述硒元素在所述培养基中的终浓度为30-50nM ；所述人血白蛋白在所述培养基中的终浓度为2-20mg/ml ；所述氯化铁在所述培养基中的终浓度为100-500ng/mL ；所述氯化铬在所述培养基中的终浓度为2-5pg/L ；所述氯化铜在所述培养基中的终浓度为0. 5-0. 8mg/L ；所述氯化锰在所述培养基中的终浓度为0. 05-0. 08mg/L ；所述氯化锌在所述培养基中的终浓度为l_5pg/L ；所述钥酸钠在所述培养基中的终浓度为200-500ng/mL ；所述激活素A在所述培养基中的终浓度为5-50ng/ml ；所述转化生长因子-P在所述培养基中的终浓度为5-50ng/ml ；所述骨形成蛋白-2在所述培养基中的终浓度为5-50ng/ml ；所述白血病抑制因子在所述培养基中的终浓度为5-50ng/ml ；所述干细胞生长因子在所述培养基中的终浓度为5-50ng/ml ； 所述肝细胞生长因子在所述培养基中的终浓度为10-50ng/ml ； 所述胰岛素样生长因子-I在所述培养基中的终浓度为25-100ng/ml ； 所述促红细胞生成素在所述培养基中的终浓度为O. 5-50U/ml ； 所述血清素在所述培养基中的终浓度为20-50nM/L ； 所述血小板源生长因子BB在所述培养基中的终浓度为5-20ng/mL ； 所述白介素-6在所述培养基中的终浓度为5-20ng/mL ； 所述胆固醇在所述培养基中的终浓度为20-50pg/mL ； 所述亚油酸在所述培养基中的终浓度为10-50mg/L ； 所述亚麻酸在所述培养基中的终浓度为10-50pg/mL ； 所述中链甘油三酯在所述培养基中的终浓度为50-200pg/mL ； 所述卵磷脂在所述培养基中的终浓度为5-10pg/mL ； 所述大豆油在所述培养基中的终浓度为50-200pg/mL ； 所述维生素B在所述培养基中的终浓度为20-50pM ； 所述维生素A在所述培养基中的终浓度为20-50pM ； 所述维生素C在所述培养基中的终浓度为45-50pM ； 所述维生素E在所述培养基中的终浓度为20-50pg/mL ； 所述地塞米松在所述培养基中的终浓度为2-5pM ； 所述氢化考的松在所述培养基中的终浓度为2-5pM ； 所述转铁蛋白在所述培养基中的终浓度为20-50pg/ml ； 所述乙酞辅酶A在所述培养基中的终浓度为1-lOU/mL; 所述 辅酶I在所述培养基中的终浓度为25-200ng/ml ； 所述组分7中的每种氨基酸在所述培养基中的终浓度为20-50pM。
5.根据权利要求1-3中所述的培养基，其特征在于 所述基础培养基为DMEM培养基； 所述硒元素来源于亚硒酸钠。
6.权利要求1-5中任一所述的培养基在促进离体嗅鞘细胞增值中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述嗅鞘细胞为人嗅鞘细胞。
8.一种培养嗅鞘细胞的方法，包括如下步骤 将离体嗅鞘细胞在权利要求1-5中任一所述的培养基中培养，获得增殖嗅鞘细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述培养温度为36°C_38°C，所述培养时间为3-10天；所述培养温度具体为37. 5°C，所述培养时间具体为10天。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述嗅鞘细胞为人嗅鞘细胞。
全文摘要
本发明公开了一种培养嗅鞘细胞的培养基。本发明提供的培养基，包括组分1-组分10；本发明的实验证明，本发明提供的培养基培养灵长类嗅鞘细胞，该培养基基本上无饲养物细胞，培养得到的细胞增殖率高，而同时维持干细胞分化成内胚层、中胚层和外胚层组织衍生物的潜能，并同时维持干细胞的核型。
文档编号C12N5/079GK102952780SQ20111025153
公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月29日 优先权日2011年8月29日
发明者田杰 申请人:北京清美联创干细胞科技有限公司