新β-半乳糖苷-α2,3-唾液酸转移酶及其编码基因和生产方法

专利名称：新β-半乳糖苷-α2,3-唾液酸转移酶及其编码基因和生产方法
技术领域：
本发明涉及新β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶、编码该酶的基因、生产该酶的微生物和该酶的生产方法。
背景技术：
糖转移酶是与生物体内的糖蛋白、糖脂等的糖链的生物合成相关的酶。而且，其反应生成物即糖蛋白、糖脂等的糖链(以下称复合糖糖链)在生物体内具有非常重要的功能。 例如，已知糖链是一种重要的分子，其主要在哺乳动物细胞中作为处于分化、发育的细胞间及细胞-细胞外基质信号传导、复合糖的靶标而发挥作用。如上述，糖链有着非常重要的功能，与此相应的具体例子是促红细胞生成素。促红细胞生成素是一种糖蛋白，人们制备了增加糖链的数目重组促红细胞生成素，从而提高了其寿命，现在已经实现商品化。今后，像这样利用糖链的医药产品、功能性食品等的开发是可以预期的。因此，作为糖链的合成、生产手段，糖转移酶的重要性正在提高。至今为止，已经从人、小鼠、大鼠和酵母等真核生物中分离出约150种以上的糖转移酶基因，并已进一步在以CHO细胞、大肠杆菌等为宿主细胞的生产系统中表达具有糖转移酶活性的蛋白质。另一方面，从原核生物细菌中也分离出数种糖转移酶基因，并已进一步在使用大肠杆菌的重组生产系统中表达具有糖转移酶活性的蛋白质，还阐明了其底物特性、各种酶化学性质。在构成糖链的糖中，从糖链功能的观点来看，多存在于非还原末端的唾液酸是极其重要的糖，因而，在现在越来越重要的糖转移酶中，唾液酸转移酶是需求最高的酶之一。关于α 2,3-唾液酸转移酶及其基因，已有许多动物特别是哺乳动物来源的产物的报道(例如参见 Harduin-L印ers，A. et al.，Biochem. J.，15 ；352 Ptl :37-48(2000)； Young-Choon Lee et al. , J. Biol. Chem. ,23 ；274 (17) :11958-67(1999) ；Lee, Y-C. et al.， J. Biochem. ,216,377-385 (1993) ；Chang, M-L. et al. , Glycobiology,5,319-325 (1995)； Gillespie, W. et al.，J. Biol. Chem. , 267, 21004-21010 (1999)) 但是，这些动物来源的酶的问题是纯化困难、无法大量获得因此价格非常高，而且作为酶、其稳定性不好。与此相对，有报导称已从属于奈瑟(氏)菌属(Neisseria)、弯曲杆菌属 (Campylobacter)、嗜血杆菌属(Hemophilus)和巴斯德氏菌属(Pasteurella)的微生物中获得了微生物来源的α2，3-唾液酸转移酶及其基因(例如参见W097/047749、 W099/04905U W001/077314, W003/027297)。但是，尚未有从属于弧菌科的微生物获取的报导，也未有属于弧菌科的微生物中存在具有α 2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质的报导。专利文献1 国际公开第W097/047749A号小册子专利文献2 国际公开第W099/049051A号小册子专利文献3 国际公开第W001/077314A号小册子专利文献4 国际公开第W003/027^7A号小册子非专利文献 1 :Harduin-L印ers，A. et al.，Biochem. J.，15 ；352Pt 1 :37-48 (2000)非专利文献 2 =Young-Choon Lee et al.，J. Biol. Chem. ,23 ；274 (17) :11958-67(1999)非专利文献3 :Lee，Y-C. et al.，J. Biochem.，216，377-385 (1993)非专利文献4 :Chang，M-L. et al.，Glycobiology，5，319-325 (1995)非专利文献5 =Gillespie, W. et al.，J. Biol. Chem.，267，21004-21010 (1992)

发明内容
发明要解决的课题本发明的课题是提供来源于弧菌科微生物的新β -半乳糖苷_α 2，3-唾液酸转移酶及其编码基因。此外，本发明的课题是提供利用编码本发明的半乳糖苷_α2，3-唾液酸转移酶的基因采用基因重组技术高效生产该酶的方法。解决课题的方法本发明人等进行了深入研究，结果发现属于弧菌科(Vibrionaceae)的微生物产生一种新酶，该酶使唾液酸以α 2，3键转移到糖链中的半乳糖残基、葡萄糖残基、甘露糖残基、果糖残基、N-乙酰葡萄糖胺残基或N-乙酰半乳糖胺残基上，从而完成了本发明。本发明提供新β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶及其编码核酸、以及生产该唾液酸转移酶的方法。以下，对本发明进行详细说明。
g -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶本发明提供新β -半乳糖苷_α 2，3_唾液酸转移酶。在本说明书中，“β_半乳糖苷-α2，3_唾液酸转移酶”是指具有使唾液酸由一磷酸胞苷(CMP)转移至复合糖糖链或游离糖链中的半乳糖残基的3位，存在于乳糖或N-乙酰乳糖胺等寡糖中的半乳糖残基的3位，或者半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺等可构成复合糖且3位的碳上有羟基的单糖的3位的活性的蛋白质。在本说明书中，“ β -半乳糖苷-α 2，3_唾液酸转移酶活性”指β-半乳糖苷-α 2，3_唾液酸转移酶的上述活性。此外， 这里所述的唾液酸是指属于唾液酸家族的神经氨酸的衍生物。具体地是指N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙醇酰神经氨酸(Neu5Gc)、5_脱氨基-5羟基神经氨酸(KDN)、”〉7义酸寸。本发明的β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶是含有序列号2、序列号四或序列号31的氨基酸序列蛋白质。本发明的β-半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶是由含序列号 1、序列号观或序列号30的碱基序列的核酸编码的蛋白质。在本发明的含有序列号2的氨基酸序列的β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶中，序列号2的氨基酸1-21为信号序列。因此，本发明的β-半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶可以是包含序列号2的氨基酸22-409的氨基酸序列的蛋白质。此外，本发明的β-半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶可以是由包含序列号1中碱基64-1230的碱基序列的核酸编码的蛋白质。在本发明的包含序列号四的氨基酸序列的β -半乳糖苷- α 2，3-唾液酸转移酶中，估计序列号四的氨基酸I-M为信号序列。因此，本发明的半乳糖苷_α2，3-唾液酸转移酶可以是含有序列号四的氨基酸25-409的氨基酸序列的蛋白质。此外，本发明的 β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶可以是由含有序列号观中碱基73-1230的碱基序列的核酸编码的蛋白质。在本发明的含有序列号31的氨基酸序列的β-半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶中，估计序列号31的氨基酸1-22为信号序列。因此，本发明的半乳糖苷_α2，3-唾液酸转移酶可以是含有序列号31的氨基酸23-402的氨基酸序列的蛋白质。此外，本发明的 β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶可以是由包含序列号30的碱基67-1209的碱基序列的核酸编码的蛋白质。本发明还包括上述本发明的β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶的变体，其为具有半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质。这样的变体蛋白也包含于本发明的 β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶中。本发明的变体蛋白可以是含有下述氨基酸序列，且具有β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质所述氨基酸序列在选自序列号2、序列号2的氨基酸22-409、序列号29、序列号四的氨基酸25-409、序列号31和序列号31的氨基酸23-402的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入和/或添加。取代可以是保守取代，即将特定的氨基酸残基替换为具有相似物理化学特征的残基。保守取代的非限定性例子包括含脂肪族基团氨基酸残基之间的取代(例如lie、Val, Leu或Ala间的相互取代)、极性残基之间的取代(例如Lys和Arg、Glu和Asp、Gln和Asn之间的相互取代)等。氨基酸缺失、取代、插入和/或添加而成的突变体可以通过对编码野生型蛋白质的DNA实施例如公知的定点诱变(例如参见Nucleic Acid Research, Vol. 10，No. 20， p. 6487-6500，1982，通过引用其全文引入本说明书)来产生。在本说明书中，“一个或多个氨基酸”指通过定点诱变方法能够缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基酸。就定点诱变方法而言，例如，除希望的变异即特定的不一致之外，还可以使用与要突变的单链噬菌体DNA互补的合成寡核苷酸引物按如下方式进行。S卩，以上述合成寡核苷酸为引物合成与噬菌体互补的链，用得到的双链DNA转化宿主细胞。将转化细菌的培养物铺在琼脂上，由含噬菌体的单个细胞形成噬菌斑。这样，理论上有50%的新菌落含有作为单链的具有突变的噬菌体，其余的50%携带原序列。在合适的温度下，使获得的噬菌斑与通过激酶而标记的合成探针杂交，所述合适的温度指该温度下所述探针与和带有目的突变的 DNA完全一致的噬菌斑杂交，而不与携带原有链的噬菌斑杂交。然后，收集与该探针杂交的噬菌斑，进行培养，回收DNA。另外，在保持其活性的同时对酶等生物活性多肽的氨基酸序列施加一个或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的方法，除了上述的定点突变外，还有用诱变物处理基因的方法，以及选择性地断开基因，删除、然后取代插入或添加选定核苷酸，再进行连接的方法。本发明的变体蛋白可以是由下述核酸编码、且具有β-半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质其中所述核酸包含在严紧条件或高度严紧条件下与选自序列号1、序列号1的碱基64-1230、序列号28、序列号28的碱基73-1230、序列号30和序列号30的碱基67-1209的碱基序列的互补链杂交的碱基序列。这里，严紧的杂交条件例如但不限于在0. 5M磷酸钠pH7. 2UmMEDTA,7% SDSU % BSA中55°C进行杂交，然后在40mM磷酸钠缓冲液pH7. 2、lmM EDTA,5% SDS、0. 5% BSA中 55°C洗涤2次每次15分钟，在40mM磷酸钠缓冲液pH7. 2、ImM EDTAU % SDS中55°C洗涤 2 次每次 15 分钟；或者按 Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第 2 版、第 1 卷、 1. 101-104 页、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)(通过引用将其全文引入本文)等的记载在30%去离子化甲酰胺、0. 6M NaCl、40mM磷酸钠pH7. 4、2. 5mM EDTAU% SDS 中42°C进行杂交后，在2XSSC、0. 1% SDS中室温洗涤2次每次10分钟，再于同样的缓冲液中55°C洗涤1小时。此外，在高度严紧条件下进行的杂交例如按Molecular Cloning(同上) 等的记载在0. 5M磷酸钠pH7. 2、lmM EDTA,7% SDSU % BSA中65°C进行杂交，然后在40mM 磷酸钠缓冲液pH7. 2、ImM EDTA,5% SDS、0. 5% BSA中65°C，在40mM磷酸钠缓冲液pH7. 2、 ImM EDTAU % SDS 中 65 °C 进行洗涤。本发明的变体蛋白还可以是含有下述氨基酸序列、且具有β-半乳糖苷-02， 3-唾液酸转移酶活性的蛋白质所述氨基酸序列与选自序列号2、序列号2的氨基酸 22-409、序列号四、序列号四的氨基酸25-409、序列号31和序列号31的氨基酸23-402的氨基酸序列具有至少60%、优选至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90 %、至少95 %、至少98 %或者至少99 %、更优选至少99. 5 %的氨基酸同源性。此外，本发明的变体蛋白可以是由下述核酸编码、且具有β-半乳糖苷-α 2，3_唾液酸转移酶活性的蛋白质所述核酸与选自序列号1、序列号1的碱基64-1230、序列号28、 序列号28的碱基73-1230、序列号30和序列号30的碱基67-1209的碱基序列具有至少 60%、优选至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或者至少99%、更优选至少99. 5%的同源性。这里，氨基酸序列或核酸碱基序列的同源性可以通过目测或数学计算确定。例如， 2个氨基酸序列的同源性％可以用遗传信息处理软件GENETYXVer. 7(GENETIC制作)等程序或FASTA算法、BLAST算法等，通过比较序列信息来确定。唾液酸转移酶活性可以采用公知方法测定，例如采用J. Biochem.，120， 104-110(1996)(通过引用将其全文引入本文)中记载的方法。例如，以CMP-Neu5Ac (N-乙酰神经氨酸)为糖供体底物、以乳糖为糖受体底物进行酶反应，通过评价反应生成物唾液酸乳糖的量可以评价酶活性。作为确定转移至糖受体底物的唾液酸的结合形式的方法，可以采用任何本领域技术人员公知的方法进行，例如但不限于使用吡啶氨基化糖链的方法、采用核磁共振分光法 (NMR)对反应生成物进行分析等。使用吡啶氨基化糖链的方法中包括以吡啶氨基化糖链为糖受体底物进行酶反应。具体地，以吡啶氨基化乳糖(Gal β l-4Glc-PA,TaKaRa Bio产品) 为糖受体底物、以CMP-NeU5Ac为糖供体底物进行酶反应，对反应生成物进行高效液相色谱 (HPLC)分析，由反应生成物的保留时间判断唾液酸转移的位置。在本发明的一个实施方式中，本发明的酶是源自属于弧菌科的微生物，优选源自属于弧菌属(Vibrio spp.)的微生物、或者优选源自属于发光杆菌属(Wiotobacterium spp.)的微生物、其中更优选源自属于明亮发光杆菌种(Wiotobacterium pho sphoreum)的微生物的酶。本发明的β-半乳糖苷-α 2，3_唾液酸转移酶的酶学性质和理化性质，除以具有上述定义的β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶活性为特征外，并非限定，其最适PH 在 ρΗ5-11、ρΗ5-10、ρΗ5_9 或 ρΗ5_7 的范围，其最适温度为 5_；35 °C、10_；35 °C、20_；35 °C 或 20-30°C，分子量用 SDS-PAGE 分析为 42，000士3000Da 左右。编码β-·ι·-α2，3-,··__本发明提供编码β-半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶的核酸。本发明的核酸是编码含有选自序列号2、序列号2的氨基酸22-409、序列号四、序列号四的氨基酸25-409、序列号31和序列号31的氨基酸23-402的氨基酸序列的蛋白质的核酸。此外，本发明的核酸是含有选自序列号1、序列号1的碱基64-1230、序列号观、序列号28的碱基73-1230、序列号30和序列号30的碱基67-1209的碱基序列的核酸。本发明的核酸可以是上述核酸的变体，所述变体编码具有β -半乳糖苷-α 2， 3-唾液酸转移酶活性的蛋白质。这样的核酸也包含于本发明的编码半乳糖苷-02， 3-唾液酸转移酶的核酸之中。这样的核酸的变体是编码含有下述氨基酸序列且具有β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质的核酸所述氨基酸序列是在选自序列号2、序列号2的氨基酸
22-409、序列号四、序列号四的氨基酸25-409、序列号31和序列号31的氨基酸23-402的氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列。这样的核酸的变体还可以是含有下述碱基序列、且编码具有β -半乳糖苷-α 2， 3-唾液酸转移酶活性的蛋白质的前述核酸所述碱基序列在严紧条件或高度严紧条件下与选自序列号1、序列号1的碱基64-1230、序列号28、序列号观的碱基73-1230、序列号30 和序列号30的碱基67-1209的碱基序列的互补链杂交。这里，严紧条件或高度严紧条件的定义同上。这样的核酸的变体还可以是与如下所述的碱基序列具有至少60 %、优选至少 65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或者至少99 %、更优选至少99. 5%的同源性，且编码具有β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质的前述核酸所述碱基序列选自序列号1、序列号1的碱基64-1230、序列号28、 序列号28的碱基73-1230、序列号30和序列号30的碱基67-1209。这里，核酸碱基序列的同源性可以用前面描述的方法确定。这样的核酸的变体还可以是编码含有如下所述的氨基酸序列且具有β-半乳糖苷-α 2，3_唾液酸转移酶活性的蛋白质的核酸所述氨基酸序列与选自序列号2、序列号2 的氨基酸22-409、序列号四、序列号四的氨基酸25-409、序列号31和序列号31的氨基酸
23-402的氨基酸序列具有至少60%、优选至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少 85 %、至少90 %、至少95 %、至少98 %或者至少99 %、更优选至少99. 5 %的同源性。这里， 氨基酸序列的同源性可以用前面描述的方法确定。表达β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶的微生物本发明人发现，属于弧菌科的微生物表达新的β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶。因而，本发明提供表达半乳糖苷_α 2，3-唾液酸转移酶的微生物。本发明的微生物是属于弧菌科且具有产β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶能力的微生物，其优选为属于弧菌属(Vibrio spp.)的微生物、或者优选为属于发光杆菌属(photobacterium spp.) 的微生物、其中更优选为属于明亮发光杆菌(photobacterium phosphoreum)的微生物。具有产β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶能力的属于弧菌科的微生物例如明亮发光杆菌 JT-ISH-467株(保藏编号NITE ΒΡ-88)、发光杆菌属JT-ISH-2M株(保藏编号NITE ΒΡ-87) 和弧菌属JT-FAJ-16株(保藏编号NITE ΒΡ-98)。而且，上述弧菌科微生物为海洋性细菌，其是从海水中或海产鱼贝类(鱼类和贝类)分离的。例如，本发明的明亮发光杆菌JT-ISH-467 株、发光杆菌属JT-ISH-2M株和弧菌属JT-FAJ-16株分别是从石川县产的乌贼、石川县产的梭子鱼(力- 7 )和福冈县产的竹荚鱼(7^)分离的。本发明的微生物例如可以采用诸如以下说明的筛选方法进行分离。以海水、海砂石、海泥或海产鱼贝类作为微生物源。将海水、海砂石或海泥直接或用灭菌海水稀释后作为接种源。对于海产鱼贝类，可以用接种环擦取其表面粘液等作为接种源，或者以在灭菌海水中磨碎其内脏而得的液体作为接种源。将这些涂布在Marine Broth Agar 2216培养基(Becton · Dickinson 产)、添力口了氣化纳的 Nutrient Agar 培养基(Becton · Dickinson 产)等平板培养基上，获得在各种温度条件下生长的海洋微生物。按常规方法对所得的微生物进行纯培养后，使用Marine Broth 2216培养基(Becton .Dickinson产)、添加了氯化钠的Nutrient Broth (Becton · Dickinson产)等液体培养基对各微生物进行培养。在微生物充分生长后，由培养液通过离心分离收集菌体。向收集的菌体加入含表面活性剂0. 2% TritonX-100 (关东化学产)的20mM卡可基酸盐(力二夕l· 一卜)缓冲液(ρΗ6· 0)，悬浮菌体。在冰冷却条件下对该菌体悬液进行超声波处理，破碎细胞。以此细胞破碎液为酶溶液， 按常规方法测定唾液酸转移酶活性，可以获得具有唾液酸转移酶活性的菌株。本发明的明亮发光杆菌JT-ISH-467株、发光杆菌属JT_ISH_2M株和弧菌属 JT-FAJ-16株也是使用上述的筛选方法获得的。关于所获上述菌株的细菌学性质和生理生化性质以及通过16S rRNA基因的碱基序列分析进行的菌种鉴定将在实施例1中详细描述。上述菌种均保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心 (NPMD :National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary ；日本国千叶县木更津市上总镰足2_5_8)。其中，明亮发光杆菌 (Photobacterium phosphoreum) JT-ISH-467 株的保藏编号为 NITE BP-88，保藏日为 2005 年3月14日；发光杆菌属(Photobacterium sp.) JT-ISH-224株的保藏编号为NITE BP-87， 保藏日为2005年3月11日；弧菌属(Vibrio sp.) JT-FAJ-16株的保藏编号为NITE BP-98, 保藏日为2005年5月23日。生产β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶的方法(ι) mmm^t . β --α 2,3- mmmmMmm^m.rimm^i在本发明的一个实施方式中，本发明的β-半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶来自属于弧菌科的微生物；通过在培养基中培养具有产半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶能力的微生物，使之产生β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶，并将其提取而获得。作为此处使用的微生物，只要是属于弧菌科且具有产β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶能力的微生物，可以使用任何菌株。在弧菌科微生物中优选属于弧菌属的微生物， 或者优选属于发光杆菌属的微生物、其中更优选属于明亮发光杆菌的微生物。在本发明的方法中使用的微生物例如有明亮发光杆菌JT-ISH-467株(保藏编号NITE BP-88)、发光杆菌属(Photobacterium sp.) JT-ISH-2M株(保藏编号NITE BP-87)和弧菌属(Vibrio sp.) JT-FAJ-16 株(保藏编号 NITE BP-98)。作为用于培养上述微生物的培养基，使用含有这些微生物可利用的碳源、氮源、无机物等的培养基。碳源例如蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白分解物、肉浸膏、葡萄糖等，优选使用蛋白胨。作为氮源，优选使用酵母提取物。作为盐类，优选适当组合使用氯化钠、柠檬酸铁、 氯化镁、硫酸钠、氯化钙、氯化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、溴化钾、氯化锶、硼酸钠、硅酸钠、氟化钠、硝酸铵、磷酸氢二钠等。此外，可以使用含上述成分的Marine Broth 2216培养基(Becton ‘ Dickinson 产)。而且，还可以使用适度含有上述盐类的人工海水、及向其中添加了蛋白胨、酵母提取物等的培养基。培养条件因培养基的组成、菌株而多少会有些差别，例如培养明亮发光杆菌JT-ISH-467株时培养温度为1048°C、优选为20_25°C，培养时间为8_48小时、优选为 16-24小时。由于目的酶存在于菌体内，可以采取例如超声波破碎法、弗氏细胞压碎器破碎法、 玻璃珠破碎法、Dyno MilK ^ ^ ^ )破碎法等任何公知的菌体破碎方法，并由菌体破碎物分离纯化目的酶。在本发明的方法中优选的菌体破碎方法是超声波破碎法。例如，通过离心分离从菌体破碎物中除去固形物后，所得的菌体破碎液上清通过适当组合市售阴离子交换柱、阳离子交换柱、凝胶过滤柱、羟基磷灰石柱、⑶P-己醇胺Agarose柱、CMP-己醇胺Agarose柱、疏水柱等柱层析和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(木行-PAGE)等，可以纯化至电泳单一条带。此外，β -半乳糖苷- α 2，3-唾液酸转移酶可以完全纯化，但部分纯化品也有充分的活性，因此本发明的β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶可以是纯化品，也可以是部分纯化品。(2)生产重组β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶的方法本发明提供包含编码β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶的核酸的表达载体以及包含该表达载体的宿主细胞。而且，本发明还提供通过在适合重组蛋白表达的条件下培养包含该表达载体的宿主细胞并回收表达的重组蛋白来生产重组β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶蛋白的方法。为了生产本发明的重组β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶蛋白，根据使用的宿主选择表达载体，在该载体上插入编码β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶的核酸序列，其中所述编码β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶的核酸序列可操作地连接于衍生自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因等的适当的转录或翻译调控核苷酸序列。调控序列例如有转录启动子、操纵基因或增强子、mRNA核糖体结合位点以及调控转录和翻译的起始和终止的适宜序列。插入本发明的载体的编码β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶的核酸序列中可以含有也可以不含有相当于序列号1的碱基1-63、序列号观的碱基1-72或序列号30的碱基 1-66的前导序列，此外上述前导序列还可以替换为其它生物来源的前导序列。通过对前导序列进行替换，可以设计表达系统使得表达的蛋白质分泌至宿主细胞外。此外，本发明的重组β-半乳糖苷-α 2，3_唾液酸转移酶蛋白还可以表达为融合蛋白的形式，这是通过在载体上插入下述核酸而实现的该核酸中在编码该酶的核酸之后连接了编码His标签、FLAG 标签、谷胱甘肽-S-转移酶等的核酸。以这样的融合蛋白的形式表达本发明的酶，可以使该酶易于纯化和检测。适于β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶蛋白的表达的宿主细胞包括原核细胞、 酵母或高等真核细胞。可在细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主中使用的适宜克隆和表达载体记载于例如 Pouwels 等、Cloning Vectors :A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (198 (通过引用将其全部内容并入本文)。原核生物中包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，例如大肠杆菌或枯草杆菌。当用大肠杆菌这样的原核细胞作为宿主时，为了易于原核细胞内表达重组多肽，可以使半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶蛋白包含N末端甲硫氨酸残基。这个N末端甲硫氨酸残基可以在表达后从重组β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶蛋白上切除。在原核宿主细胞内使用的表达载体一般含有1个或2个以上可以进行表型选择的标记基因。可以进行表型选择的标记基因例如赋予抗生素抗性或独立营养缺陷型(独立栄養要求性)的基因。适于原核宿主细胞的表达载体的例子包括pBR322(ATCC37017)这样的商品化质粒或者它们的衍生物。PBR322携带氨苄青霉素抗性和四环素抗性基因，易于对转化细胞进行鉴定。该PBR322载体内可以插入合适的启动子和编码β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶的核酸的DNA序列。其它的商品化载体还包括例如pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden)禾口 pGEMl(Promega Biotech. , Madison,Wisconsin,America)寸。在用于原核宿主细胞的表达载体中通常使用的启动子序列包括tac启动子、 β -内酰胺酶(青霉素酶)启动子、乳糖启动子(Chang等、Nature 275 :615，1978 ；和 Goeddel等、Nature 281 :544，1979 ；通过引用，其全文引入本说明书)等。此外，可以在酵母宿主内表达重组β-半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶蛋白。优选使用酵母属(Saccharomyces，例如酿酒酵母(S. Cerevisiae))，也可以使用毕赤酵母属 (Pichia)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)等其它酵母属。酵母载体大多含有来自2 μ酵母质粒的复制起点序列、自主复制序列(ARS)、启动子区、用于聚腺苷酸化的序列、用于转录终止的序列以及可选择的标记基因。使用酵母α因子前导序列可以促使重组β-半乳糖苷-α 2，3_唾液酸转移酶蛋白分泌。适于用来促进重组多肽从酵母宿主中分泌的其它前导序列也是公知的。转染酵母的方法记载于例如Hinnen等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929-1933,1978 (通过引用将其全部内容并入本文)。使用哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统也可以表达重组β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶蛋白。也可以使用哺乳动物起源的确立细胞系。用于哺乳动物宿主细胞表达载体的转录和翻译调控序列可以从病毒基因组获得。常用的启动子序列和增强子序列源自多瘤病毒、腺病毒2等。可以使用由SV40病毒基因组例如SV40起点、早期和晚期启动子、增强子、剪接位点和聚腺苷酸化位点衍生的DNA序列，赋予哺乳动物宿主细胞内结构基因序列表达所需的其它基因元件。在哺乳动物宿主细胞内使用的载体可以采用例如Okayama和 Berg(Mol. Cell. Biol.，3 :280，1983，通过引用将其全部内容并入本文)的方法构建。生产本发明的β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶蛋白的一种方法包括在该蛋白质得以表达的条件下培养用表达载体转化的宿主细胞，其中所述表达载体包含编码半
1乳糖苷-α 2，3_唾液酸转移酶蛋白的核酸序列。然后，根据使用的表达系统，由培养培养基或细胞提取液回收β-半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶蛋白。纯化重组β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶蛋白的操作根据使用的宿主的形式以及本发明的蛋白质是否分泌至培养基中等重要因素适宜地选择。例如纯化重组半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶蛋白的操作包括阴离子交换柱、阳离子交换柱、凝胶过滤柱、羟基磷灰石柱、⑶P-己醇胺Agarose柱、CMP-己醇胺Agarose柱、疏水柱等柱层析和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等，或者它们的组合。此外，当与易化重组半乳糖苷_α 2，3-唾液酸转移酶纯化的标签等融合表达时，可以利用采用亲和层析的纯化方法。例如，当与组氨酸标签、FLAG 标签或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等融合时，可以分别使用Ni-NTA(次氨基三乙酸)柱、结合有抗FLAG抗体的柱子或结合有谷胱甘肽的柱子等、通过亲和层析进行纯化。重组β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶可以纯化至电泳单一条带，但由于部分纯化品也具有充分的活性，所以本发明的β -半乳糖苷_α 2，3_唾液酸转移酶可以是纯化品，也可以是部分纯化品。Si^本发明提供抗本发明的半乳糖苷_α2，3-唾液酸转移酶蛋白的抗体。本发明的抗体可以针对本发明的半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶蛋白或其片段进行制备。这里，本发明的β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶的片段是具有下述序列的片段所述序列包含该酶的氨基酸序列中至少6个氨基酸、至少10个氨基酸、至少20个氨基酸或至少30
个氨基酸。抗体可以用本发明的β-半乳糖苷-α 2，3_唾液酸转移酶或其片段免疫本技术领域中用于抗体制备的动物进行制备，所述动物例如但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、山羊等。 抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。抗体可以基于本领域技术人员公知的抗体制备方法进行制备。 本发明的抗体可以用于亲和纯化回收本发明的β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶蛋白。本发明的抗体可以用于在Western印迹、ELISA等测定法中检测本发明的β-半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶蛋白。唾液酸糖链的生产方法在本发明的一个实施方式中，本发明提供利用本发明的唾液酸转移酶生产唾液酸糖链的生产方法。本发明的方法是唾液酸糖链的生产方法，所述方法包括(i)制备含有本发明的β-半乳糖苷-α 2，3_唾液酸转移酶、糖供体底物和糖受体底物的溶液；(ii)在该溶液中进行唾液酸转移反应；(iii)从反应溶液中获取生成的唾液酸糖链。在本说明书中，唾液酸糖链是指具有唾液酸的糖链。在本发明的方法中，借助本发明的酶进行唾液酸转移反应，通过该反应将糖供体底物的唾液酸转移至糖受体底物，得到唾液酸糖链。可以在本发明的方法中使用的糖供体底物没有特别的限制，只要其是可以成为通过本发明的唾液酸转移酶进行的唾液酸转移反应的糖供体的底物。优选的可以在发明的方法中使用的糖供体底物是CMP-唾液酸，更优选的是CMP-Neu5Ac。
可以在本发明的方法中使用的糖受体底物没有特别的限制，可以是具有半乳糖残基、葡萄糖残基、甘露糖残基、岩藻糖残基、N-乙酰葡萄糖胺残基或N-乙酰半乳糖胺残基等的复合糖糖链或寡糖，或者是半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺等单糖。这里，“复合糖”是含糖生物分子的统称，包括糖蛋白、蛋白聚糖、糖脂。在本说明书中，“复合糖糖链”可以指糖蛋白、蛋白聚糖、糖脂等复合糖本身，也可以指其糖链部分。“寡糖”是指2个或2个以上的单糖通过糖苷键连接而成的糖。对于构成寡糖的单糖的数目没有特别的限制。此外，单糖或寡糖的还原末端可以用烷基、吡啶氨基、苯甲酰基、苄基、对硝基苯基、4-甲基伞形酮基(4- > f A々> ^」7工-j A基)等修饰。在本发明的方法中，含有本发明的酶、糖供体底物和糖受体底物的溶液是缓冲液， 例如包括但不限于醋酸缓冲液、卡可基酸缓冲液、磷酸缓冲液、TAPS缓冲液、Bis-Tris缓冲液、iTris缓冲液、CHES缓冲液、CAPS缓冲液、MOPS缓冲液、MES缓冲液、ADA缓冲液、PIPES 缓冲液、ACES缓冲液、MOPSO缓冲液、HEPES缓冲液等。本发明的方法中含有本发明的酶、糖供体底物和糖受体底物的溶液的PH只要是本发明的酶具有酶活性的pH，没有特别限制，优选为 pH5-ll、pH5-10、pH5-9、pH5-7。在本发明的方法中，进行唾液酸转移反应的温度只要是本发明的酶具有酶活性的温度，没有特别限制，优选在5-35 °C、10-35 °C、20-35 °C、20-30 °C的范围内进行。本发明的方法中的从反应溶液中获取生成的唾液酸糖链的步骤，可以采用本领域技术人员公知的纯化复合糖糖链、寡糖的方法进行。例如，层析有反相层析、凝胶过滤层析、 离子交换层析、羟基磷灰石层析、亲和层析、凝集素层析、活性碳层析、硅胶层析等，其它方法有采用超滤对糖链进行分级 浓缩、糖链的结晶等，或者这些方法的组合，但不限于上述。如后述的实施例4、11、12和13所示，本发明的酶可以通过α2，3键使唾液酸转移到多种糖受体底物。采用本发明的唾液酸糖链的生产方法，可以容易地生产一般使用高底物特异性的公知唾液酸转移酶无法生产的糖链。特别是由于尚未发现具有高效地向α-吡喃半乳糖苷、α -吡喃葡萄糖苷、α -吡喃甘露糖苷、α -吡喃岩藻糖苷、β -吡喃岩藻糖苷等糖转移唾液酸的活性的酶，本发明的方法提供容易地生产在这些糖上添加了唾液酸的糖链的方法。发明的效果本发明提供新的β -半乳糖苷- α 2，3-唾液酸转移酶及其编码核酸，在提供已逐渐明确在生物体内具有重要功能的糖链的合成 生产手段的观点上做出了贡献。特别是唾液酸在生物体内多存在于复合糖糖链中的非还原末端，从糖链功能的观点来看是极为重要的糖，因此唾液酸转移酶是糖转移酶中需求最高的酶之一，而本发明提供新的唾液酸转移酶正回应了这样的高需求。本发明还涉及如下方面1. 一种分离的蛋白质，其含有选自序列号2、序列号2的氨基酸残基22-409、序列号四、序列号四的氨基酸残基25-409、序列号31和序列号31的氨基酸残基23-402的氨基酸序列。2. 一种分离的蛋白质，其含有在选自序列号2、序列号2的氨基酸残基22-409、序列号29、序列号四的氨基酸残基25-409、序列号31和序列号31的氨基酸残基23-402的氨基酸序列中发生1个或多于1个氨基酸缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，且具有β-半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶活性。3. 一种分离的蛋白质，其含有如下所述的氨基酸序列，且具有β-半乳糖苷-α 2， 3-唾液酸转移酶活性该氨基酸序列与选自序列号2、序列号2的氨基酸残基22-409、序列号四、序列号四的氨基酸残基25-409、序列号31和序列号31的氨基酸残基23-402的氨基酸序列具有至少60%的氨基酸同源性。4. 一种分离的蛋白质，其由含有选自序列号1、序列号1的碱基64-1230、序列号观、序列号28的碱基73-1230、序列号30和序列号30的碱基67-1209的碱基序列的核酸编码，且具有半乳糖苷_α 2，3-唾液酸转移酶活性。5. 一种分离的蛋白质，其由含有如下所述的碱基序列的核酸编码，且具有β-半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶活性该碱基序列在严紧条件下与选自序列号1、序列号1的碱基64-1230、序列号观、序列号观的碱基73-1230、序列号30和序列号30的碱基67-1209 的碱基序列的互补链杂交。6.项1-5任一项的分离的蛋白质，其来自弧菌科微生物。7. 一种分离的核酸，其编码如下所述的蛋白质该蛋白质含有选自序列号2、序列号2的氨基酸残基22-409、序列号四、序列号四的氨基酸残基25-409、序列号31和序列号 31的氨基酸残基23-402的氨基酸序列。8. 一种分离的核酸，其编码如下所述的具有β-半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质该蛋白质含有在选自序列号2、序列号2的氨基酸残基22-409、序列号四、 序列号四的氨基酸残基25-409、序列号31和序列号31的氨基酸残基23-402的氨基酸序列中发生1个或多于1个氨基酸缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列。9. 一种分离的核酸，其编码含有如下所述的氨基酸序列，且具有β-半乳糖苷-α 2，3_唾液酸转移酶活性的蛋白质该氨基酸序列与选自序列号2、序列号2的氨基酸残基22-409、序列号四、序列号四的氨基酸残基25-409、序列号31和序列号31的氨基酸残基23-402的氨基酸序列具有至少60%的同源性。10. 一种分离的核酸，其含有选自序列号1、序列号1的碱基64-1230、序列号28、 序列号28的碱基73-1230、序列号30和序列号30的碱基67-1209的碱基序列。11. 一种分离的核酸，其含有如下所述的碱基序列，并且编码具有半乳糖苷-α2，3_唾液酸转移酶活性的蛋白质该碱基序列在严紧条件下与选自序列号1、序列号1的碱基64-1230、序列号观、序列号28的碱基73-1230、序列号30和序列号30的碱基 67-1209的碱基序列的互补链杂交。12.含有项7-11任一项所述核酸的重组载体。13.用项12所述的重组载体转化的宿主细胞。14. 一种弧菌科的分离的微生物，其表达项1-6任一项的蛋白质。15.项14所述的微生物，其为明亮发光杆菌JT-ISH-467株(保藏号ΝΙΤΕΒΡ-88)、 发光杆菌属(Photobacterium sp.) JT-ISH-2M 株(保藏号 NITE BP-87)或弧菌属(Vibrio sp.) JT-FAJ-16 株(保藏号 NITE BP-98)。16. 一种生产具有β-半乳糖苷-α 2，3_唾液酸转移酶活性的蛋白质的方法，包括以下步骤1)培养产生β-半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶的微生物；
2)从培养的微生物或培养上清分离半乳糖苷_α 2，3-唾液酸转移酶。17. 一种生产具有β-半乳糖苷-α 2，3_唾液酸转移酶活性的重组蛋白质的方法，包括以下步骤1)用含有项7-11任一项的核酸的重组载体转化宿主细胞；2)培养经过转化的所述宿主细胞；3)从培养的宿主细胞或培养上清分离具有β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质。18. —种生产唾液酸糖链的方法，包括(i)制备含有项1-6任一项的蛋白质、糖供体底物及糖受体底物的溶液；(ii)在该溶液中进行唾液酸转移反应；(iii)从反应溶液获得生成的唾液酸糖链。


(图1-1)图1-1为显示JT-ISH-467株来源的重组β-半乳糖苷-α 2，3_唾液酸转移酶的酶活性确认实验中的标准品(失活的粗酶液、吡啶氨基化乳糖和吡啶氨基化α 2， 3-唾液酸乳糖(吡啶氨基化3’ -唾液酸乳糖)的混合物)的HPLC分析结果的图。(图1-2)图1-2为显示JT-ISH-467株来源的重组β-半乳糖苷- α 2，3_唾液酸转移酶的酶活性确认实验的HPLC分析结果的图。(图1-3)图1-3为显示JT-ISH-467株来源的重组β-半乳糖苷- α 2，3_唾液酸转移酶的酶活性确认实验中的对照实验(使用不含糖供体即CMP-唾液酸的反应液进行的反应)的HPLC分析结果的图。(图2)图2为显示明亮发光杆菌JT-ISH-467株来源、发光杆菌属JT_ISH_2M株来源和弧菌属JT-FAJ-16株来源的α 2,3-唾液酸转移酶(分别为序列号2、9、31)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)的α2，6_唾液酸转移酶(JC5898)以及多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)多杀亚种Pm70株的假设蛋白PM0188 (AKK02272)的氨基酸序列间的比对的图。JT-ISH-467株来源的α 2，3-唾液酸转移酶的下划线显示由纯化蛋白测定的氨基酸序列。(图3-1)图3-1为显示JT-ISH-467株产生的β-半乳糖苷-α 2，3_唾液酸转移酶的酶活性中反应PH的影响的图表。图中，黑方块、黑圆圈、黑三角、黑菱形、白方块和白圆圈的图线(plot)分别表示在醋酸缓冲液、卡可基酸缓冲液、磷酸缓冲液、TAPS缓冲液、CHES 缓冲液和CAPS缓冲液中的测定结果。(图3-2)图3-2为显示重组β-半乳糖苷-α 2，3_唾液酸转移酶的酶活性中反 SpH的影响的图表。图3-2a、图3- 和图3-2c分别为显示针对JT-ISH-467株来源、 JT-ISH-2M株来源和11^^1-16株来源的重组0-半乳糖苷-0 2，3-唾液酸转移酶的结果的图表。图中，黑方块、黑圆圈、黑三角、黑菱形、白方块和白圆圈的图线分别表示在醋酸缓冲液、卡可基酸缓冲液、磷酸缓冲液、TAPS缓冲液、CHES缓冲液和CAPS缓冲液中的测定结^ ο(图4-1)图4-1为显示JT-ISH-467株产生的β-半乳糖苷-α 2，3_唾液酸转移酶的酶活性中反应温度的影响的图表。
(图4-2)图4-2为显示重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的酶活性中反应温度的影响的图表。图4-2a、图4-2b和图4-2c分别为显示关于JT-ISH-467株来源、 JT-ISH-2M株来源和JT-FAJ-16株来源的重组β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶的结果的图表。下面通过实施例对本发明做更具体的说明，但本发明的技术范围不受这些实施例的限制。
实施例实施例1 表汰β_半乳糖苷_α 2, 3-睡液酸转移酶的微牛物的筛诜及菌株的鉴定以海水、海砂、海泥或海产鱼贝类作为接种源。将该接种源涂布在由Marine Broth Agar 2216培养基(Becton · Dickinson产)构成的平板培养基上，获取在15°C、25°C或 30°C生长的微生物。按常规方法对所得的微生物进行纯培养后，使用由Marine Broth 2216 培养基(Becton · Dickinson产)构成的液体培养基对各微生物进行培养。在微生物充分生长后，由培养液通过离心分离收集菌体。向收集的菌体加入含表面活性剂0. 2% Triton X_100(关东化学产)的20mM卡可基酸缓冲液(pH6.0)，悬浮菌体。在冰冷却条件下对该菌体悬液进行超声波处理，破碎细胞。以此细胞破碎液为酶溶液测定唾液酸转移酶活性， 得到具有唾液酸转移酶活性的菌株JT-ISH-467株、JT-ISH-2M株和JT-FAJ-16株。此外， JT-ISH-467株、JT-ISH-224株和JT-FAJ-16株分别是从乌贼的表皮、梭子鱼的内脏和竹荚鱼的内脏获得的。唾液酸转移酶活性采用J. Biochem.，120，104-110 (1996)(通过引用将其全部内容并入本文)中记载的方法测定。具体地说，使用反应溶液(30μ1)进行酶反应，所述反应溶液中添加了糖供体底物CMP-Neu5Ac (70nmol、含25000cpm用14C标记NeuAc的 CMP-NeuAc、356cpm/nmol。NeuAc表示N-乙酰神经氨酸)、糖受体底物乳糖(1.25 μ mol) 和终浓度为0. 5M的NaCl，并含有依照前文所述方法制备的酶。酶反应在25°C进行10-30 分钟。反应结束后，向反应溶液中加入5mM磷酸缓冲液(pH6. 8) 1.97ml，所得溶液上样于 Dowexl X 8 (Po/—型、0.2 X 2cm、BIO-RAD产)柱。测定该柱的洗脱液中所含的反应生成物， 即唾液酸乳糖中所含的放射活性，可以计算出酶活性。(i).TT-ISH-467 株获得的JT-ISH-467株的性质如下(细菌学性质)(1)细胞形态为杆菌，大小为0. 7 0. 8μπιΧ1. 5 2. Ομπι。(2)运动性-(3)革兰氏染色性-(4)有无孢子_(生理生化性质)(1)生长温度 4°C为 +、25°C为 +、30°C为-(2)菌落颜色不产生特征性菌落色素(3)0/F 检验+/-0146](4)过氧化氢酶试验-0147](5)氧化酶试验+0148](6)由葡萄糖产酸_0149](7)由葡萄糖产气-0150](8)发光性+0151](9)硝酸盐还原+0152](10)产吲哚+0153](11)葡萄糖酸化-0154](12)精氨酸双水解酶+0155](13)脲酶-0156](14)七叶苷水解-0157](15)明胶水解性-0158](16) β-半乳糖苷酶+0159](17)葡萄糖同化性_0160](18仏-阿拉伯糖同化性-0161](19)D-甘露糖同化性-0162]00) D-甘露醇同化性-0163](21) N-乙酰-D-葡糖胺同化性-0164](22)麦芽糖同化性_0165](23)葡糖酸钾同化性_0166](24)正癸酸同化性-0167](25)己二酸同化性-0168]苹果酸同化性-0169](27)柠檬酸钠同化性-0170](28)乙酸苯酯同化性_0171](29)细胞色素氧化酶+0172](30)菌体内DNA的GC含量(摩尔％ ) 39. 7 %0173](通过16S rRNA基因碱基序列分析和DNA-DNA杂交进行种的鉴定)0174]以采用常规方法从JT-ISH-467株提取的基因组DNA为模板，通过PCR扩增16S
rRNA基因的全碱基序列，并测定碱基序列。该碱基序列示于序列号3。将该碱基序列与明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)模式株ATCCl 1040株的16S rRNA基因的碱基序列相比较，显示同源率为100%的高同源性。该结果表明，JT-ISH-467株属于发光杆菌属。然而，16S rRNA基因仅为细菌全基因组的一部分，据称对于种水平的极近亲生物间的距离，根据16S rRNA基因的碱基序列的鉴定分析在很大的误差。因而，采用在属内菌株亲缘关系定量评定中一般采用的DNA-DNA杂交试验法进行了种的鉴定。提取JT-ISH-467株和明亮发光杆菌模式株通81282株(与41011040株为同一株)的全DNA，用于试验。其结果，获得了 84. 7%的高同源值(DNA-DNA亲缘性)。一般地，同种间DNA-DNA同源值为60% 以上，因此JT-ISH-467株被鉴定为明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)。此外， DNA-DNA杂交试验按《微生物的分类·鉴定实验方法》(铃木健一郎平石明横田明编著*工/ U >力一 · 7工7，一夕东京株式会社，2001年9月；将其全部内容引入本文)采用使用微量滴定板的光生物素标记法进行。
0175](ii) .TT-ISH-224 株0176]获得的JT-ISH-2M株的性质如下0177](细菌学性质)0178](1)细胞形态为杆菌，大小为0. 7-0. 8 μ mX 1. 0-1. 5 μ m。0179](2)运动性+0180](3)革兰氏染色性-0181](4)有无孢子-0182](生理生化性质)0183](1)生长温度 4°C为 _、25°C为 +、30°C为 +、37°C为-0184](2)菌落颜色不产生特征性菌落色素0185](3)0/F 检验 +/-0186](4)过氧化氢酶试验+0187](5)氧化酶试验+0188](6)由葡萄糖产酸+0189](7)由葡萄糖产气+0190](8)发光性-0191](9)硝酸盐还原+0192](10)产吲哚+0193](11)葡萄糖酸化-0194](12)精氨酸双水解酶+0195](13)脲酶-0196](14)七叶苷水解-0197](15)明胶水解性-0198](16) β-半乳糖苷酶+0199](17)葡萄糖同化性_0200](18仏-阿拉伯糖同化性-0201](19)D-甘露糖同化性-0202]00) D-甘露醇同化性-0203](21) N-乙酰-D-葡糖胺同化性-0204](22)麦芽糖同化性_0205](23)葡糖酸钾同化性_0206](24)正癸酸同化性-0207](25)己二酸同化性-0208]苹果酸同化性-0209](27)柠檬酸钠同化性-0210](28)乙酸苯酯同化性_0211](29)细胞色素氧化酶+
(30) 0/129 敏感性 10 μ g-、15 μ g+(31)菌体内DNA的GC含量(摩尔％ )39.4%(16S rRNA基因碱基序列分析)以采用常规方法从JT-ISH-2M株提取的基因组DNA为模板，通过PCR扩增16S rRNA基因的全碱基序列，并测定碱基序列。该碱基序列示于序列号32。JT-ISH-2M株在Marine Agar上的生长性、杆菌、革兰氏染色性、葡萄糖发酵分解性、0/1 敏感性等形态学观察和生理生化性状试验结果显示，其属于弧菌科。更进一步， 明确了 JT-ISH-2M株的16S rRNA基因的DNA碱基序列对明亮发光杆菌(Wiotobacterium phosphoreum)模式株ATCCl 1040的16S rRNA基因序列的同源性最高，其同源率为99. 2%; 其次是对 Photobacterium iliopiscarium 模式株 ATCC51760 的 16S rRNA 基因的序列的同源性较高，其同源率为99. 1%。由这些结果，可以明确JT-ISH-2M株是属于发光杆菌属 (Photobacterium sp.)的微生物。(iii) .TT-FA.T_16 株
获得的JT-FAJ-16株的性质如下
(细菌学性质)
(1)细胞形态为杆菌，大小为0. 7 0. 8 μ mX 1. 2 -
(2)运动性-
(3)革兰氏染色性-
(4)有无孢子-
(生理生化性质)
(1)生长温度 4°C为 +w、25°C为 +、30°C为 +、37°C为
(2)菌落颜色淡黄色 奶油色
(3)0/F 检验 +/+
(4)过氧化氢酶试验+
(5)氧化酶试验+
(6)由葡萄糖产酸+
(7)由葡萄糖产气-
(8)硝酸盐还原+
(9)产吲哚-
(10)葡萄糖酸化+
(11)精氨酸双水解酶-
(12)脲酶-
(13)七叶苷水解+
(14)明胶水解性-
(15) β-半乳糖苷酶+
(16)葡萄糖同化性_
(17仏-阿拉伯糖同化性-
(18)D-甘露糖同化性-
(19) D-甘露醇同化性-
1
(20) N-乙酰-D-葡糖胺同化性-麦芽糖同化性_02)葡糖酸钾同化性_(23)正癸酸同化性-(24)己二酸同化性-(25) dl-苹果酸同化性-06)柠檬酸钠同化性_07)乙酸苯酯同化性-(28)细胞色素氧化酶+09) 0/129 敏感性-(30) 7 X卜一卟发酵性+(31)肌醇发酵性+(32)阿拉伯糖发酵性+(33)鼠李糖发酵性-(34)蔗糖发酵性-(35)生长性(NaCl) 3% NaCl+,4% NaCl+,6% NaCl+(36)淀粉水解-(37)Tween80 分解-(38)产
(39)产3_羟基丁酮(VP检验)-(16S rRNA基因碱基序列分析)以采用常规方法从JT-FAJ-16株提取的基因组DNA为模板，通过PCR扩增16S rRNA基因的全碱基序列，并测定碱基序列。碱基序列示于序列号33。JT-FAJ-16株在Marine Agar上的生长性、杆菌、革兰氏染色性、葡萄糖发酵分解性、0/1 敏感性等形态学观察和生理生化性状试验结果显示，其属于弧菌科。更进一步， 明确了 JT-FAJ-16株的16S rRNA基因的DNA碱基序列对Vibrio rumoiensis模式株的16S rRNA基因的序列的同源性最高，其同源率为99.5%。由这些结果，可以明确JT-FAJ-16株是属于弧菌属(Vibrio sp.)的微生物。实施例2 由明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum) JT-ISH-467 株提取和 ^ β - - α 2,3- ^mmwum由在Marine Agar 2216平板培养基上传代培养的明亮发光杆菌JT_ISH_467株的菌落用接种环采取菌体，接种在IOml Marine Broth 2216液体培养基中，25°C、180转/分振荡培养8小时。主培养按以下程序进行。向容积为IOOOml的带挡板烧瓶(二 <付7，力二)中注入 300ml 含 20g/L Bacto P印tone 禾口 4g/L Bacto Yeast Extract 的 Marine Broth 2216 培养基，用高压灭菌器灭菌(121°C、15分钟)。共准备36瓶(合计10. 8L)培养基。向各烧瓶中接种IOml前培养液，25°C、180转/分振荡培养M小时。离心分离培养液，收集菌体。 获得的菌体湿重约为60g。将该菌体悬浮于990ml的含0. 2% TritonX-IOO和3M氯化钠的20mM卡可基酸缓冲液(pH6. 0)中，在冰冷却条件下进行超声波破碎。4°C、100，000 X g离心分离菌体破碎液 1小时，获得上清。将所得的上清装入透析袋中，在含0.2% TritonX-IOO的20mM卡可基酸缓冲液(PH6.0)中于4°C透析至氯化钠浓度为20mM左右。透析后，由于溶液中出现沉淀， 4°C、100，000Xg离心1小时，除去沉淀。使该粗酶液吸附于用含表面活性剂即0. 2% TritonX-IOO的20mM卡可基酸缓冲液(pH6. 0)平衡的 HiPr印 16/10DEAE FF(Amersham Biosciences 产)阴离子交换柱，从含 0. 2% Triton X-100的20mM卡可基酸缓冲液(pH6. 0)至另含IM氯化钠的相同缓冲液用直线浓度梯度法进行洗脱。其结果，收集氯化钠浓度0. 25M附近处洗脱的具有酶活性的级分。收集的级分用20mM磷酸缓冲液(pH6. 0)稀释，使之吸附于预先用含0. 2% Triton X-100的20mM磷酸缓冲液(pH6. 0)平衡的羟基磷灰石(Bio-Rad产)，从含0. 2% Triton X-100 的 20mM 磷酸缓冲液(pH6. 0)至含 0. 2% TritonX-IOO 的 500mM 磷酸缓冲液(pH6. 0) 用直线浓度梯度法进行洗脱。其结果，收集磷酸缓冲液浓度125mM左右洗脱的具有酶活性的级分。使该级分吸附于MonoQ 5/50GL (Amersham Biosciences产)阴离子交换柱，从含 0. 2% Triton X-100的20mM卡可基酸缓冲液(pH6. 0)至另含IM氯化钠的相同缓冲液用直线浓度梯度法进行洗脱。其结果，收集氯化钠浓度300mM左右洗脱的具有酶活性的级分。将该级分用含0. 2% Triton X-100的20mM卡可基酸缓冲液(pH7. 0)稀释10倍， 使之吸附于Mono Q 5/50GL(Pharmacia产)阴离子交换柱。从含0.2% Triton X-100的 20mM卡可基酸缓冲液(pH7. 0)至另含IM氯化钠的相同缓冲液用直线浓度梯度法进行洗脱。 收集氯化钠浓度300mM左右洗脱的具有酶活性的级分。将该级分用含0. 2 % Triton X-100和0. 2M氯化钠的20mM卡可基酸缓冲液 (ρΗ7· 0)稀释 2 倍，用 HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade (Amersham Biosciences 产)凝胶过滤柱进行分级。用含0. 2% Triton X-100和0. 2M氯化钠的20mM卡可基酸缓冲液(ΡΗ7· 0)进行洗脱。将有活性的级分进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(丙烯酰胺的浓度为12. 5% )，结果表明，目的酶显示单一条带，分子量约39，000。与菌体破碎时的比活性相比，该级分的比活性约提高了 350倍(表1)。表1显示了由粗酶液纯化JT-ISH-467株来源的α 2，3_唾液酸转移酶，经过上述各纯化步骤后的样品的酶活性。酶活性采用与前述实施例1中相同的J. Biochem.，120， 104-110(1996)中记载的方法测定。此外，蛋白质的定量使用Coomassie Protein Assay Reagent(PIERCE产)，按其中的说明书进行蛋白质的定量。酶的1个单位(IU)设定为在1 分钟内转移1微摩尔唾液酸的酶量。表1从粗酶液纯化JT-ISH-467株来源的α 2，3_唾液酸转移酶的纯化表
权利要求
1.一种分离的蛋白质，其包含选自序列号2和序列号2的第22-409位氨基酸残基的氨基酸序列。
2.一种分离的蛋白质，其由选自序列号2及序列号2的第22-409位氨基酸残基的氨基酸序列组成。
3.一种具有半乳糖苷_α2，3-唾液酸转移酶活性的分离的蛋白质，其包含如下所述的氨基酸序列该氨基酸序列与选自序列号2和序列号2的第22-409位氨基酸残基的氨基酸序列具有至少99%的氨基酸同源性。
4.一种具有β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的分离的蛋白质，其由包含选自序列号1和序列号1的第64-1230位碱基的碱基序列的核酸编码。
5.一种具有β-半乳糖苷-α2，3_唾液酸转移酶活性的分离的蛋白质，其由下述核酸编码所述核酸由选自序列号1和序列号1的第64-1230位碱基的碱基序列组成。
6.一种具有β-半乳糖苷_α2，3-唾液酸转移酶活性分离的蛋白质，其由包含如下所述的碱基序列的核酸编码该碱基序列在0. 5Μ磷酸钠pH7. 2UmMEDTA,7% SDSU % BSA中 65V的杂交条件，以及40mM磷酸钠缓冲液pH7. 2、ImM EDTA, 1 % SDS中65°C的洗涤条件下可与选自序列号1及序列号1的第64-1230位碱基的碱基序列的互补链杂交。
7.权利要求1-6任一项的分离的蛋白质，其来自弧菌科微生物。
8.一种分离的核酸，其编码如下所述的蛋白质该蛋白质包含选自序列号2以及序列号2的第22-409位氨基酸残基的氨基酸序列。
9.一种分离的核酸，其编码由选自序列号2以及序列号2的第22-409位氨基酸残基的氨基酸序列组成的蛋白质。
10.一种分离的核酸，其编码包含如下所述的氨基酸序列，且具有半乳糖苷_α 2， 3-唾液酸转移酶活性的蛋白质该氨基酸序列与选自序列号2和序列号2的第22-409位氨基酸残基的氨基酸序列具有至少99%的同源性。
11.一种分离的核酸，其包含选自序列号1和序列号1的第64-1230位碱基的碱基序列。
12.—种分离的核酸，由选自序列号1和序列号1的第64-1230位碱基的碱基序列组成。
13.一种分离的核酸，其编码具有半乳糖苷_α 2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质， 该核酸包含如下所述的碱基序列该碱基序列在0. 5Μ磷酸钠ρΗ7. 2、ImM EDTA,7% SDSU % BSA中65°C的杂交条件，以及40mM磷酸钠缓冲液pH7. 2、ImM EDTA, 1 % SDS中65°C的洗涤条件下可与选自序列号1及序列号1的第64-1230位碱基的碱基序列的互补链杂交。
14.包含权利要求8-13任一项所述核酸的重组载体。
15.用权利要求14所述的重组载体转化的宿主细胞。
16.一种弧菌科的分离的微生物，其表达权利要求1-7任一项所述的蛋白质。
17.权利要求16所述的微生物，其为明亮发光杆菌JT-ISH-467株(保藏号NITE BP-88)。
18.—种生产具有半乳糖苷-α 2，3_唾液酸转移酶活性的蛋白质的方法，包括以下步骤1)培养产生半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶的微生物，所述半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶是权利要求1-7中任一项所述的分离的蛋白质；和2)从培养的微生物或培养上清分离半乳糖苷_α 2，3-唾液酸转移酶。
19.一种生产具有β-半乳糖苷-α 2，3_唾液酸转移酶活性的重组蛋白质的方法，包括以下步骤1)用包含权利要求8-13任一项所述的核酸的重组载体转化宿主细胞；2)培养经过转化的所述宿主细胞；和3)从培养的宿主细胞或培养上清分离具有半乳糖苷-α2，3_唾液酸转移酶活性的蛋白质。
20.一种生产唾液酸糖链的方法，包括(i)制备包含权利要求1-7任一项所述的蛋白质、糖供体底物及糖受体底物的溶液； ( )在该溶液中进行唾液酸转移反应；和 (iii)从反应溶液获得生成的唾液酸糖链。
全文摘要
本发明涉及新β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶及其编码基因和生产方法，具体的本发明提供新β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶及编码该唾液酸转移酶的核酸。本发明还在提供生产该唾液酸转移酶的微生物的同时，提供使用这样的微生物生产该唾液酸转移酶的方法。本发明进一步提供含有编码该唾液酸转移酶的核酸的载体和用该载体转化的宿主细胞，同时本发明还提供生产重组β-半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶的方法。本发明进一步提供利用本发明的唾液酸转移酶生产唾液酸糖链的方法。
文档编号C12R1/63GK102409031SQ20111025142
公开日2012年4月11日 申请日期2006年3月31日 优先权日2005年4月15日
发明者塚本浩史, 山本岳, 高仓由光 申请人:日本烟草产业株式会社