专利名称：用于检测亚铜离子的荧光传感器蛋白、质粒或细胞、编码该蛋白的dna及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测亚铜离子的荧光传感器蛋白、质粒或细胞、编码该蛋白的DNA及制备方法。
背景技术：
作为多种有着催化功能的蛋白的辅助因子，亚铜离子对在整个生命过程中起到很大的作用。然而过量的亚铜离子却会与其他的金属结合蛋白发生误结合，同时自由的亚铜离子也可以催化一些反应，产生反应活性很高的氧自由基。如果体内的亚铜离子不能够很好的调控，会引发一些致命的疾病，如Wilson病和Menkes卷发综合征等。因而检测体内的亚铜离子非常重要。构造可用于体内亚铜离子检测的传感器的主要技术难点主要在以下几个方面1、探测器必须有较好的生物相容性和低毒性；2、探测器必须比较容易进入体内；3、探测器的信噪比较高，较容易地进行检测；4、检测专一性强，不受其他金属离子的干扰。而目前已有的两类方法，化学标记法和荧光共振能量转移法(FRET)。它们在上述4个方面或多或少都有着不可弥补的缺陷。化学方法的缺点是较低的生物相容性和其潜在的毒性。所以一直没有有效的应用到体内。荧光能量共振转移的方法基于荧光蛋白和能够结合亚铜离子的蛋白域。这种传感器能够直接在细胞内表达，因而可以克服上述I和2两项技术难点，但在3和4两方面还存在不足。目前仅有的一种报道的FRET传感器，它将青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白用一段亚铜离子结合蛋白连接起来，构成一个复合蛋白质。通过两种荧光蛋白的FRET信号来表征中间段蛋白在结合亚铜离子前后的构象变化。但目前该方法的信号还是会受到锌离子的微弱干扰，并且整体上信号在结合前后的变化幅度很小(低于10% )，需要复杂的信号处理。
发明内容
本发明提供一种用于检测亚铜离子的荧光传感器蛋白，检测时信号变化明显，同时可减少锌离子对亚铜离子检测的干扰。本发明还提供表达上述荧光传感器蛋白的质粒或细胞，可以用于检测亚铜离子。本发明还提供编码上述荧光传感器蛋白的DNA及其制备方法。所述用于检测亚铜离子的荧光传感器蛋白，在增强绿色荧光蛋白内插入对亚铜离子响应的蛋白域，得到所述荧光传感器蛋白，使得在单一时间所述荧光传感器蛋白中的荧光蛋白和亚铜离子结合蛋白只有一个能够正确折叠。作为优选方案，在增强绿色荧光蛋白(以下简称EGFP)中的第6个和第7个beta片间的环状区域插入亚铜离子结合蛋白Amtl，得到所述荧光传感器蛋白。所述荧光传感器蛋白的序列为MVSKGEELFTGVVPILVELD⑶VNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNIgRGRPPTTCDHCKDMRKTKNVNPSGSCNCSKLEKIRQEKGITIEEDMLMSGNMDMCLCVRGEPCRCHARRKRTQKSIgYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPI⑶GPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK。 编码所述荧光传感器蛋白的DNA。所述DNA的序列为ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACCTCGGGCGTGGTCGTCCGCCGACCACCTGCGACCACTGCAAAGACATGCGTAAAACCAAAAACGTTAACCCGTCTGGTTCTTGCAACTGCTCTAAACTGGAAAAAATCCGTCAGGAAAAAGGTATCACCATCGAAGAAGACATGCTGATGTCTGGTAACATGGACATGTGCCTGTGCGTTCGTGGTGAACCGTGCCGTTGCCACGCTCGTCGTAAACGTACCCAGAAATCTCTCGGGTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG。所述DNA的制备方法为，将限制性内切酶aval酶切位点特异性的引入绿色荧光蛋白EGFP中连接第6个和第7个beta片中间的环形区域,再用Aval去酶切,纯化出线性部分后与两端有Aval黏性末端的Amtl DNA做连接反应，即可得到编码荧光传感器蛋白的DNA。具体的步骤优选为所述绿色荧光蛋白基因在pUC19质粒的BamHl和Kpnl多克隆位点中，分别用引物 5 ’ CCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACCTCGGGTACAACAGCCACAACGTCTATATC3’ 和 5’ GATATAGACGTTGTGGCTGTTGTACCCGAGGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGG3’ 进行突变PCR反应，将限制性内切酶aval酶切位点特异性的引人绿色荧光蛋白中连接第6个和第7个beta片中间的环形区域,得到质粒pUC19_GFPAvalin,再进行Aval酶切,纯化出线性的pUC19-GFPAvalin后与两端有Aval黏性末端的Amtl DNA做连接反应，即可得到处于克隆质粒pUC19的BamHl和Kpnl位点当中的编码荧光传感器蛋白的DNA。表达所述荧光传感器蛋白的表达质粒或细胞。本发明通过将一个亚铜离子结合蛋白特异性的放到一个单一的荧光蛋白内部，构建出一个传感器蛋白。荧光蛋白被亚铜离子结合蛋白在序列上被一分为二，当没有亚铜离子存在的时候，亚铜离子结合蛋白处于无规卷曲状态，荧光蛋白能够很好的折叠，发出荧光。但当亚铜离子存在的时候，中间插入的蛋白变得有序，它的折叠会引起荧光蛋白的解折叠，从而引发荧光的淬灭。在单一时间荧光蛋白和亚铜离子结合蛋白只有一个能够正确折叠，相当于这个复合蛋白的两个部分的折叠是互相具有排斥性的，即所述荧光传感器蛋白为“自排斥蛋白”。我们所选择的亚铜离子结合蛋白为Amtl，而荧光蛋白为EGFP。通过DNA重组技术我们把Amtl插入到绿色荧光蛋白中的第6个和第7个beta片间的环状区域中，构建成一个单一的复合荧光蛋白作为新的亚铜离子传感器。该传感器能够在多种原核和真核细胞内表达，并且用于亚铜离子的探测。
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实验结果表明，该传感器蛋白能够在较低亚铜离子浓度时(< I微摩)就有荧光响应，荧光强度的变化在50%以上，同时较好地克服了锌离子的干扰，对其他常见离子均无响应。另外，本发明最大的好处就是能够应用于体内的亚铜离子的探测与成像。比如，本发明的研究者对于哺乳动物细胞体内的亚铜离子做了实时的观测，通过观测细胞荧光的改变，可以了解细胞内部亚铜离子浓度的改变，响应速度快。本发明利用“自排斥蛋白”设计亚铜离子荧光传感器蛋白的构建思路对于构建探测其它金属离子或者小分子的荧光传感器具有一定的指导意义。这种“自排斥蛋白”在单一时间内，总是只有其中一部分能够正确折叠。其折叠行为可以受金属离子或者小分子调控。
图I :传感器分子对亚铜离子浓度的响应。a、b、c、d、e、f分别代表探测器分子和亚铜离子摩尔浓度比为I : 0，1 : 1，1 : 2，1 : 3，1 : 4，1 : 5时的荧光光谱。图2 :该亚铜离子传感器对不同金属离子的响应。图3 :细胞体内实验，在哺乳动物细胞中表达探测器蛋白，36小时之后，在细胞培养基中加入硫酸铜，经细胞代谢，培养基中的铜离子会进入细胞内部，并有生物学机理将其部分转化为亚铜离子，可以看到，与体外实验相一致，细胞内的荧光强度大幅度下降，这表明亚铜离子已经生成，其变化的速度与亚铜离子的浓度有关。
具体实施例方式(I)初始时亚铜离子结合蛋白Amtl在pcDNA3. I (+)质粒当中，我们分别用上下游引物 5，TCCCTCGGGCGTGGTCGTCCGCCGACCAC 3，和 5，TCCCCCGAGAGATTTCTGGGTACGTTTACGACG3’通过聚合酶链式反应扩增出来，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后割胶回收，纯化出Amtl片段，因为此时Amtl DNA的5’端和3’端分别有Aval的酶切位点，然后对此Amt IDNA进行Aval酶切，然后用DNA片段纯化试剂盒纯化出两端有Aval黏性末端的Amtl DNA.作为 Insert DNA 备用。(2)绿色荧光蛋白基因(GFP)初始时在pUC19质粒的BamHl和KpnI多克隆位点中，分别用引物 5’ CCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACCTCGGGTACAACAGCCACAACGTCTATATC3’ 和 5’ GATATAGACGTTGTGGCTGTTGTACCCGAGGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGG3’ 进行突变 PCR 反应，将限制性内切酶aval酶切位点特异性的引人绿色荧光蛋白中连接第6个和第7个beta片中间的环形区域，称这个质粒为pUC19-GFPAvalin。再用Aval去酶切pUC19_GFPAvalin，然后再进行琼脂糖凝胶电泳，割胶回收纯化出线性的pUC19-GFPAvalin。然后将有Aval黏性末端的Amtl和线性的pUC19-GFPAvalin做连接反应。即可得到编码荧光传感器蛋白的DNA，此时DNA是处于克隆质粒pUC19的BamHl和Kpnl位点当中，我们称此DNA质粒为pUC19_sensor。(3)体外试验下面我们用BamHl和Kpnl去酶切pUC19_sensor和表达质粒PQE80L，将黏性末端为BamHl和Kpnl的sensor DNA和线性pQE80L分别割胶纯化出来。再将它们做连接反应，即可得到将编码传感器蛋白放置于PQE80L中的表达质粒，我们称之为pQE80L-sensor。将这个质粒转化到BL21大肠杆菌中，涂平板，37摄氏度培养过夜，第二天挑取单克隆于IOmL含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37摄氏度培养12个小时。将这IOml菌液加入到IL含有100 μ g/ml氨苄青霉素的LB中，37摄氏度培养2到3个小时，待其O. D.值为O. 6-0. 8之间，加入终浓度为lmmol/L的IPTG，将温度降到28摄氏度，再培养5个小时。之后离心收集菌体，再用结合缓冲液(20mM Na3PO4, 500mM NaCl,4mM DTTpH 7.4)悬浮,之后超声破碎菌体,然后将超声后的悬浮液置于离心管中12000rpm离心30分钟，取上清液。然后将上清液与镍柱填料均匀混合，用洗涤缓冲液(20mM Na3PO4, 500mMNaCl,4mM DTT pH 7.4)冲洗15个柱的体积。最后用洗脱缓冲液(20mM Na3PO4, 500mMNaCl,4mM DTT,500mM imidazole,pH 7.4)洗脱两次。此组分既是我们需要的传感器蛋白。将传感器蛋白置于保存缓冲液中QOmM Tris-HCl, 300mM NaCl, 4mM DTT，pH 7.4)中透析，_80°C下保存备用。该传感器在该储存条件下可以稳定保存I年以上。为了观察传感器蛋白对于亚铜离子浓度的反应，配置6份溶液。溶液中的传感器蛋白浓度都控制在luM，6份溶液中亚铜离子浓度依次为OuM，IuM, 2uM, 3uM, 4uM, 5uM.因为一个亚铜离子结合蛋白Amtl最多能够结合4个亚铜离子，所以当浓度为4uM亚铜离子存在于浓度为IuM的传感器蛋白体系中时，这时传感器蛋白结合的亚铜离子已近于饱和。将这6份样品分别用荧光光度仪器测量其400nm波长激发光所产生的发射光谱。结果如图I所示，发现随着亚铜离子浓度的提高，传感器蛋白的荧光强度会有明显的降低，直至传感器蛋白结合了饱和浓度的亚铜离子。此时加入更高浓度的亚铜离子，荧光强度将不会再继续降低。为了确定传感器蛋白对其他金属离子的响应情况，分别取CuSO4, ZnCl2, CaCl2,MgCl2, MnCl2, CdCl2, CoCl2和AgNO3化合物，配置成在IuM传感器蛋白中分别存在4uMCu(II)，Zn(II)，Ca(II)，Mg(II)，Mn(II)，Cd(II)，Co(II)和 Ag⑴金属离子。将这 9 份样品分别用荧光光度仪器测量其400nm波长激发光所产生的发射光谱，用这时的发射光谱值减去没有离子存在时的原始光谱值，这个值再除以原始光谱值，用这个值的绝对值来表示传感器蛋白对这些金属离子的响应情况。结果如图2所示。(4)在体内实验中，把哺乳动物表达质粒pCDNA3. I㈠和pUC19-sensor分别用BamHl和Kpnl酶切，然后割胶回收线性的p⑶NA3. I (-)和编码传感器蛋白的DNA。之后，将编码传感器蛋白的DNA连接到P⑶NA3. 1(_)上面，构成了哺乳动物的亚铜离子传感器表达质粒，P⑶NA3. l(-)-SenSor.将这个质粒转染到哺乳动物细胞CHO中，36小时之后，传感器蛋白已经稳定表达。此时，我们在细胞培养基中加入ImM的CuS04，可以在显微镜下面看到随着细胞代谢，亚铜离子浓度升高，而导致了荧光强度在细胞内的降低(如图3所示)。
权利要求
1.一种用于检测亚铜离子的荧光传感器蛋白，其特征在于，在增强绿色荧光蛋白内插入对亚铜离子响应的蛋白域，得到所述荧光传感器蛋白，使得在单一时间所述荧光传感器蛋白中的荧光蛋白和亚铜离子结合蛋白只有一个能够正确折叠。
2.如权利要求I所述的用于检测亚铜离子的荧光传感器蛋白，其特征在于，在增强绿色荧光蛋白中的第6个和第7个beta片间的环状区域插入亚铜离子结合蛋白Amtl，得到所述荧光传感器蛋白。
3.如权利要求所述的用于检测亚铜离子的荧光传感器蛋白，其特征在于，所述荧光传感器蛋白的序列为MVSKGEELFTGVVPILVELD⑶VNGHKFSVSGEGE⑶ATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNlgRGRPPTTCDHCKDMRKTKNVNPSGSCNCSKLEKIRQEKGITIEEDMLMSGNMDMCLCVRGEPCRCHARRKRTQKS1gYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPI⑶GPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK。
4.编码权利要求I或2所述荧光传感器蛋白的DNA。
5.如权利要求3所述DNA，其特征在于，其序列为ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACCTCGGGCGTGGTCGTCCGCCGACCACCTGCGACCACTGCAAAGACATGCGTAAAACCAAAAACGTTAACCCGTCTGGTTCTTGCAACTGCTCTAAACTGGAAAAAATCCGTCAGGAAAAAGGTATCACCATCGAAGAAGACATGCTGATGTCTGGTAACATGGACATGTGCCTGTGCGTTCGTGGTGAACCGTGCCGTTGCCACGCTCGTCGTAAACGTACCCAGAAATCTCTCGGGTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG。
6.权利要求3或4所述DNA的制备方法，其特征在于，将限制性内切酶aval酶切位点特异性的引入绿色荧光蛋白EGFP中连接第6个和第7个beta片中间的环形区域，再用Aval去酶切，纯化出线性部分后与两端有Aval黏性末端的Amtl DNA做连接反应，即可得到编码荧光传感器蛋白的DNA。
7.如权利要求5所述DNA的制备方法，其特征在于，所述绿色荧光蛋白基因在PUC19质粒的 BamHl 和 Kpnl 多克隆位点中，分别用引物 5’CCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACCTCGGGTACAACAGCCACAACGTCTATATC3 ’和 5 ’ GATATAGACGTTGTGGCTGTTGTACCCGAGGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGG3’进行突变PCR反应，将限制性内切酶aval酶切位点特异性的引人绿色荧光蛋白中连接第6个和第7个beta片中间的环形区域,得到质粒pUC19-GFPAvalin,再进行Aval酶切，纯化出线性的pUC19-GFPAvalin后与两端有Aval黏性末端的AmtlDNA做连接反应，即可得到处于克隆质粒PUC19的BamHl和Kpnl位点当中的编码荧光传感器蛋白的DNA。
8.表达权利要求I或2所述荧光传感器蛋白的表达质粒或细胞。
全文摘要
本发明涉及用于检测亚铜离子的荧光传感器蛋白，检测时信号变化明显，同时可减少锌离子对亚铜离子检测的干扰。本发明还涉及表达上述荧光传感器蛋白的质粒或细胞，以及编码上述荧光传感器蛋白的DNA及其制备方法。所述用于检测亚铜离子的荧光传感器蛋白，在增强绿色荧光蛋白内插入对亚铜离子响应的蛋白域，得到所述荧光传感器蛋白，使得在单一时间所述荧光传感器蛋白中的荧光蛋白和亚铜离子结合蛋白只有一个能够正确折叠。实验结果表明，该传感器蛋白能够在较低亚铜离子浓度时(＜1微摩)就有荧光响应，荧光强度的变化在50％以上，同时较好地克服了锌离子的干扰，对其他常见离子均无响应。
文档编号C12N15/11GK102952181SQ20111025062
公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月26日 优先权日2011年8月26日
发明者王炜, 梁俊毅, 秦猛, 曹毅 申请人:南京大学