一种基于金属有机骨架材料荧光传感器检测尿素的方法
【专利摘要】一种基于金属有机骨架材料荧光传感器检测尿素的方法，包括下列步骤：步骤1：制备锆金属有机骨架材料UiO?66?NH2；步骤2：将上述锆金属有机骨架材料UiO?66?NH2均匀研磨，称取研磨后的粉末超声振荡分散在蒸馏水中，得到UiO?66?NH2材料溶液，避光贮存在4℃下备用；步骤3：取脲酶溶于羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲溶液中，制得脲酶溶液，避光贮存在4℃下备用；步骤4：分别取UiO?66?NH2材料溶液和脲酶溶液，将两溶液充分混合后，于37℃下保持10分钟，检测荧光信号；步骤5：加入不同浓度的尿素，于37℃下孵育30分钟，检测不同浓度尿素存在下的荧光信号；步骤6：根据荧光信号和工作曲线对样品中尿素进行定性、定量分析。本发明是一种快速、准确可靠、灵敏、特异性高的尿素检测方法。
【专利说明】
一种基于金属有机骨架材料荧光传感器检测尿素的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及食品安全、水质监控等分析检测领域，尤其涉及利用金属有机骨架材 料荧光特性检测尿素的方法。
【背景技术】
[0002] 尿素是氨基酸代谢的最终产物，当尿素的含量超过自身的吸收能力之后，将会对 机体的肝、肾、肺泡等造成危害。近年来在牛奶、豆芽等食品加工生产中为增产增收而非法 添加尿素的问题层出不穷，在牛、羊等家畜饲料中非法添加尿素造成牲畜死亡的事件也时 有发生，同时环境中也存在尿素超标的问题，海滨浴场和游泳池中尿素浓度偏高也会影响 人们健康。因此，尿素的检测在临床诊断、食品科学和水质监控等方面具有重要的意义。
[0003] 目前尿素常用检测技术主要有直接比色法、间接比色法、色谱法、中红外光谱法 等。（1)直接比色法即用某种特殊试剂与尿素直接反应(41^15^;^3〇1；[111；^3 4(^3,2007， 591(2) :239)，产生显色物质，在特定波长下测定其吸光度，再换算为尿素浓度。该法成本 低，易操作，但灵敏度不高，适合常量尿素的检测，在检测尿素浓度较低的样品时有一定局 限性，所用试剂有些具有毒性和腐蚀性，易污染环境。（2)间接比色法是基于脲酶水解尿素 (Trends in Analytical Chemistry，2002,21(5):389)，产生二氧化碳和铵离子，通过铵离 子与多种化学试剂反应产生颜色等参数变化，利用分光光度法间接测定尿素的含量的方 法。与直接比色法相比，间接比色法特异性高、快速、结果准确精密，但所用试剂价格昂贵， 脲酶的活性受样品中共存物质的干扰较大。采用比色法测定，样品溶液的颜色和浑浊易造 成假阳性。（3)高效液相色谱法与荧光法或质谱法联用检测尿素(色谱，2015,33(1):80;分 析测试学报，2012,31(5):593)，具有高速、高效、高灵敏等特点，但有些需要对尿素进行复 杂的衍生化处理，且色谱设备昂贵，操作复杂，对分析人员要求较高，不适合现场检测。（4) 中红外光谱法检测尿素(Food Chemistry，2013，138(l): 19)，无需对样品进行预处理，试样 用量少，但准确度方面有较大缺陷，只能定性或半定量检测。也有酶电极法(Journal of Biochemical and Biophysical Methods,2008,70(6): 1145)，基于尿素和脈酶反应使溶液 电导率发生改变，对尿素进行定量分析。这种方法需要将脲酶固定在传感材料上，酶电极 的重现性和稳定性较难控制。另有专利技术（中国专利，申请号:201510091353.1)利用石墨 烯量子点检测尿素，由于边缘状态和量子局限，石墨烯量子点的形状和大小将决定它们的 电学、光学、磁性和化学特性，获取特定边缘形状和均匀尺寸的石墨烯量子点是个难题。
[0004] 金属有机骨架材料是由金属离子或金属簇和有机配体通过自组装而形成的一类 新型纳微结构功能材料，具有结构可设计性与可调控性、低晶体密度以及高比表面积等特 征，其中，镧系金属、镉、锌、铪、钇、锆等金属有机骨架材料具有优越的荧光性质，多应用在 气体储存、手性分离和催化、分子磁体、光电材料等领域，金属有机骨架材料在分子传感以 及临床诊断、环境污染、食品安全分析中的应用有待进一步深入研究。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题在于:克服现有尿素检测技术共存物质干扰大、灵敏度 低、操作烦琐耗时、假阳性率高等不足，将金属有机骨架材料应用于食品安全及水质监控等 分析领域，利用金属有机骨架材料的荧光随酸度改变的特性，结合蛋白质脲酶的特异性识 别能力，提供一种快速、准确可靠、灵敏、特异性高的尿素检测方法。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提出以下技术方案：一种基于金属有机骨架材料 荧光传感器检测尿素的方法，其包括下列步骤：
[0007] 步骤1:制备锆金属有机骨架材料Ui〇-66-NH2,包括下列步骤la和步骤lb:
[0008] 步骤la:Ui〇-66-NH2的合成：在室温下，将0.322g~1.29g即lmmol~4mmol的八水 氧氯化错Zr0Cl2 · 8H2〇,0.181g~0.724g即lmmol~4mmol的2-氨基-1，4_苯二甲酸二甲酯 BDC-NH2，1 · 221g~9 · 77g即 lOmmol ~80mmol 的苯甲酸和0 · 174mL~0 · 70mL 浓度为 12mol/L 的 浓盐酸超声溶解在17mL~68mL的N，N-二甲基甲酰胺中，溶解后，将溶液转移到100mL聚四氟 乙烯内衬的高压反应釜中，将其放入烘箱中，在1 〇〇°C~150°C温度下反应16小时~24小时， 再冷却至室温，将产物过滤，得到黄色粉末状产物，分别用10mL~40mL的N，N-二甲基甲酰胺 和1 OmL~40mL的丙酮淋洗三次，80 °C~120 °C烘干，备用；
[0009] 步骤lb，Ui〇-66_NH2材料的活化:采用溶剂交换法，将步骤la得到的固体粉末放在 10mL~50mL的N，N-二甲基甲酰胺中离心浸洗12小时，每4小时更换一次溶剂，除去残留在材 料孔道及表面没有反应的配体和金属离子，接着用10mL~40mL乙醇浸泡1天~2天，每8小时 更换一次溶剂，然后在真空干燥箱中于80 °C~120°C下干燥18小时~36小时，除去低沸点的 溶剂及水分，即得到活化后的Ui〇-66-NH2材料；
[0010] 步骤2:将上述制得的锆金属有机骨架材料Ui〇-66-NH2均匀研磨，称取研磨后的粉 末超声振荡分散在蒸馏水中，得到Ui〇-66-NH 2材料溶液，避光贮存在4°C下备用；
[0011] 步骤3:取脲酶溶于羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲溶液中，制得脲酶溶液，避光贮存在4 °(：下备用；
[0012] 步骤4:分别取Ui〇-66-NH2材料溶液和脲酶溶液，将两溶液充分混合后，于37°C下 保持10分钟，检测荧光信号；
[0013] 步骤5:在上述混合溶液中加入不同浓度的尿素，于37°C下孵育30分钟，检测不同 浓度尿素存在下的焚光信号。
[0014] 步骤6:上述步骤5中所测的荧光信号与尿素浓度在一定范围内成线性，根据荧光 信号和工作曲线可以对样品中尿素进行定性、定量分析。
[0015] 本发明中，当体系中没有目标物尿素时，体系的pH不发生改变，只能测到金属有机 骨架材料的背景荧光；当体系中存在目标物尿素时，尿素与脲酶发生反应生成铵离子，使溶 液的pH增大，金属有机骨架材料分子发生聚集导致荧光信号增强，据此实现对尿素的分析 检测。以Ui〇-66-NH 2材料为例，检测原理如图1所示。
[0016] 上述基于金属有机骨架材料荧光传感器检测尿素的方法中，所述的金属有机骨架 材料不仅能够发射荧光，而且其荧光与体系pH具有较强的依赖性，可通过溶剂热法、微波 法、超声法、固相合成及电化学合成等方法制备得到。
[0017] 本发明所述的金属有机骨架材料并不仅限于上述步骤中制得的锆金属有机骨架 材料Ui〇-66_NH2，也包含镧系金属、镉、锌、铪、钇等金属有机骨架材料，在本发明技术构思 范围内的金属有机骨架材料均属于本发明的保护范围。
[0018] 与现有尿素检测技术相比，本发明的显著优点为：
[0019] (1)利用金属有机骨架材料荧光随酸度改变的特性，将金属有机骨架材料应用于 食品安全、水质监控、临床诊断等分析领域，结合蛋白质脲酶的特异性识别能力，为尿素的 快速检测与鉴定提供有效手段，有望形成新的分子传感分析方法。
[0020] (2)本发明方法是一种共性的检测方法，不仅可广泛用于尿素的检测，还可应用于 生物大分子(核酸、蛋白质)和小分子(食品和环境中化学污染物等)的检测。
[0021] (3)本发明基于金属有机骨架材料荧光传感器检测尿素的方法，利用金属有机骨 架材料荧光随酸度改变的特性，结合蛋白质脲酶的特异性识别能力，提供一种快速、准确可 靠、灵敏、特异性高的尿素检测方法。当体系中没有目标物尿素时，体系的pH不发生改变，只 能测到金属有机骨架材料的背景荧光；当体系中存在目标物尿素时，尿素与脲酶发生反应 生成铵离子，使溶液的pH增大，金属有机骨架材料分子发生聚集导致荧光增强，基于此构建 了对尿素快速检测的传感器。以锆金属有机骨架材料Ui〇-66-NH 2为例，Ui〇-66-NH2荧光强度 与尿素浓度在0.4~8.0mg/L范围内呈良好的线性关系，检出限达0.3173mg/L(S/N = 3)，加 标实验的相对标准偏差(RSD)介于2.0%~5.4%，回收率在93.3%~106.7%范围内。本发 明用于尿素的检测具有准确、灵敏、特异性高等优点。
【附图说明】
[0022]图1基于金属有机骨架材料Ui〇-66_NH2荧光传感器检测尿素的示意图。
[0023]图2A和图2B分别是金属有机骨架材料Ui〇-66-NH2荧光传感器不同浓度尿素的荧 光光谱图及工作曲线图，其中尿素浓度a~h分别是:0 · 4mg/mL，0 · 6mg/mL，1 · Omg/mL，1 · 2mg/ mL，2·Omg/mL，4·Omg/mL，6·Omg/mL，8·Omg/mL 〇
[0024] 图3金属有机骨架材料Ui〇-66-NH2荧光传感器检测尿素及其它常见共存物质的信 号对比图，其中尿素的浓度为6.0mg/L，其它物质的浓度均为300mg/L。
【具体实施方式】
[0025] 本发明提出一种基于金属有机骨架材料荧光传感器检测尿素的方法，其包括下列 步骤：
[0026] 步骤1:制备锆金属有机骨架材料Ui〇-66_NH2,包括下列步骤la、lb:
[0027] 步骤la:Ui〇-66-NH2的合成：在室温下，将八水氧氯化锆（ZrOCl 2 · 8H20,0.322g~ 1 · 29g，lmmol~4mmol)、2_氛基-1，4_苯二甲酸二甲酯（BDC-NH2，0 · 181g~0 · 724g，1 mmol ~ 4mmo 1)、苯甲酸（1 · 221g~9 · 77g，lOmmol~80mmol)和浓盐酸（12mol/L，0 · 174mL~0 · 70mL) 超声溶解在17mL~68mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，溶解后，将溶液转移到100mL聚四氟乙 烯内衬的高压反应釜中，将其放入烘箱中，在1 〇〇 °C~150 °C温度下反应16小时~24小时，再 冷却至室温，将产物过滤，得到黄色粉末状产物，分别用10mL~40mL DMF和10mL~40mL丙酮 淋洗三次，80 °C~120 °C烘干，备用。
[0028] 步骤lb，Ui〇-66_NH2材料的活化:采用溶剂交换法，将步骤la得到的固体粉末放在 10mL~50mL的DMF中离心浸洗12小时(每4小时更换一次溶剂），除去残留在材料孔道及表面 没有反应的配体和金属离子，接着用10mL~40mL乙醇浸泡1天~2天(每8小时更换一次溶 剂），然后在真空干燥箱中于80°C~120 °C下干燥18小时~36小时，除去低沸点的溶剂及水 分，即得到活化后的Ui〇-66-NH2材料；
[0029]步骤2:将上述制得的锆金属有机骨架材料Ui〇-66-NH2均匀研磨，称取研磨后的粉 末超声振荡分散在蒸馏水中，得到Ui〇-66-NH2材料溶液，避光贮存在4°C下备用；
[0030] 步骤3:取脲酶溶于HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)缓冲溶液中，制得脲酶溶液，避光 贮存在4°C下备用；
[0031] 步骤4:分别取Ui〇-66-NH2材料溶液和脲酶溶液，将两溶液充分混合后，于37°C下 保持10分钟，检测荧光信号；
[0032] 步骤5:在上述混合溶液中加入不同浓度的尿素，于37°C下孵育30分钟，检测不同 浓度尿素存在下的焚光信号。
[0033] 步骤6:上述步骤5中所测的荧光信号与尿素浓度在一定范围内成线性，根据荧光 信号和工作曲线可以对样品中尿素进行定性、定量分析。
[0034]实施例1(本发明方法检测尿素）
[0035]先合成含锆有机骨架材料Ui〇-66_NH2,流程如下：
[0036]步骤 1:将 ZrOCl2 · 2.5出0(0.6458,2111111〇1)、80(：-冊2(0.3628,2111111〇1)、苯甲酸 (4.885g，40mmo)和浓盐酸（12mol/L，0.347mL)超声溶解在34mL DMF中，溶解后，将溶液转移 到lOOmL聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，将其放入烘箱中，在120°C下反应24小时，再冷却 至室温，将产物过滤，得到黄色粉末状产物，分别用20mL DMF和10mL丙酮淋洗三次，80 °C °C 烘干，备用。
[0037]步骤2:将步骤1得到的固体粉末放在20mL DMF中离心浸洗12小时(每4小时更换一 次溶剂），接着用10mL乙醇浸泡1天(每8小时更换一次溶剂），然后在真空干燥箱中于80°C下 干燥20小时，即得到活化后的Ui〇-66-NH 2材料。
[0038]将上述制得的含锆有机骨架材料Ui〇-66-NH2均匀研磨，称取研磨后的粉末5.0mg 超声振荡分散在100.0 mL蒸馏水中，得到0.05mg/mL Ui〇-66-NH2材料溶液，避光贮存在4°C 下备用。
[0039] 取脲酶10 · Omg溶于1 · OmL HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸，20mmo 1 /L，pH7 · 4)缓冲溶 液中，制得浓度为10mg/mL脲酶溶液，避光贮存在4°C下备用。
[0040]分别取3 · 0mL(0 · 05mg/mL)Ui0-66-NH2材料溶液和0 · lmL( 10mg/mL)脲酶溶液，将两 溶液充分混合后中，于37 °C下保持10分钟，检测荧光信号。
[0041 ] 在上述混合溶液中加入10yL不同浓度的尿素，于37°C下孵育30分钟，检测不同浓 度尿素存在下的焚光信号。
[0042]结果显示，当尿素浓度在0.4~8.0mg/L浓度范围时，体系荧光强度与浓度呈线性 相关(7 = 74.12义+136.55，1? = 0.9987)，检出限达0.317311^/1(5/^=3)，如图2所示。
[0043] 实施例2(本发明方法在检测尿素及其它常见共存物质中的应用）
[0044] 为评价本发明方法的特异性，选取食品中常见的共存物质如钙离子Ca2+、钾离子K +、钠离子Na+、谷氨酸Glu、牛血清蛋白BSA、乳糖Lac和酪蛋白Casein，按照实施例1所述的检 测步骤对这些物质进行测定，记录各自的荧光信号并加以对比，结果如图3所示。由于脲酶 的目标物是尿素，因此尿素(6.0mg/L)的荧光信号最强，而其它共存物质（300mg/L)浓度50 倍于尿素的情况下，荧光强度是尿素信号的三分之一甚至更低。该结果表明基于金属有机 骨架材料Ui〇-66-NH 2荧光传感器检测尿素的方法具有高度特异性和选择性。
[0045] 实施例3(本发明方法应用于白酒中尿素的检测）
[0046] 五份白酒样品购自当地超市，分别取五份酒样25mL加入五个圆底烧瓶中，置于旋 转蒸发仪上，于温度80 °C，转速70~80r/min条件下蒸干，将烧瓶中酒样完全蒸发干后，取下 烧瓶，冷却至室温，加入5mL蒸馏水，充分振荡将残留物洗出，洗出液通过0.22μπι水相滤膜过 滤，得到处理后样液五份。每个样品平行检测三次。
[0047]按照实施例1所述的分析步骤分别检测五份处理后的白酒样液，五份白酒样品均 检出尿素，结果如表1所示。
[0048]向五份白酒样液中分别添加不同浓度(0. lmg/L~0.3mg/L)尿素，按照实施例1所 述的分析步骤再检测五份白酒样液，检测结果如表1所示，加标实验的相对标准偏差(RSD) 介于2.0%~5.4%，回收率在93.3%~106.7%范围内。由此可见，本发明方法具有较高的 准确度和精密度，适合实际样品分析。
[0049] 表1含锆有机骨架材料Ui〇-66_NH2荧光传感器检测白酒中尿素
[0051] a.平行测定三次取平均值；
[0052] b.平均值土标准偏差，n = 3。
【主权项】
1. 一种基于金属有机骨架材料荧光传感器检测尿素的方法，其特征在于，其包括下列 步骤： 步骤1:制备锆金属有机骨架材料Ui〇-66-NH2，包括下列步骤la和步骤lb: 步骤la:Ui〇-66-NH2的合成:在室温下，将0.322g ~ 1.29g即lmmol~4mmol的八水氧氯 化错ZrOCl2· 8H2〇,0 · 181g ~0 · 724gBP lmmol ~4mmol 的2-氛基-1，4_苯二甲酸二甲酯 BDC-NH2，1.221g ~9.77g即lOmmol ~80mmol的苯甲酸和0.174mL ~0.70mL浓度为 12mol/ L的浓盐酸超声溶解在17mL~68mL的N，N-二甲基甲酰胺中，溶解后，将溶液转移到100mL 聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，将其放入烘箱中，在100°0 150°C温度下反应16小时~ 24小时，再冷却至室温，将产物过滤，得到黄色粉末状产物，分别用10mL~40mL的N，N-二 甲基甲酰胺和10mL~40mL的丙酮淋洗三次，80°〇 120°C烘干，备用； 步骤lb，Ui〇-66-NH2材料的活化:采用溶剂交换法，将步骤la得到的固体粉末放在10mL ~50mL的N，N-二甲基甲酰胺中离心浸洗12小时，每4小时更换一次溶剂，除去残留在材料 孔道及表面没有反应的配体和金属离子，接着用10mL~40mL乙醇浸泡1天~2天，每8小时 更换一次溶剂，然后在真空干燥箱中于80°〇 120°C下干燥18小时~36小时，除去低沸点 的溶剂及水分，即得到活化后的Ui〇-66-NH2材料； 步骤2:将上述制得的锆金属有机骨架材料Ui〇-66-NH2均匀研磨，称取研磨后的粉末超 声振荡分散在蒸馏水中，得到Ui〇-66-NH2材料溶液，避光贮存在4°C下备用； 步骤3:取脲酶溶于羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲溶液中，制得脲酶溶液，避光贮存在4 °C下 备用； 步骤4:分别取Ui〇-66-NH2材料溶液和脲酶溶液，将两溶液充分混合后，于37°C下保持10 分钟，检测焚光信号； 步骤5:在上述混合溶液中加入不同浓度的尿素，于37°C下孵育30分钟，检测不同浓度 尿素存在下的焚光信号； 步骤6:上述步骤5中所测的荧光信号与尿素浓度在一定范围内成线性，根据荧光信号 和工作曲线可以对样品中尿素进行定性、定量分析。2. 根据权利要求1所述的基于金属有机骨架材料荧光传感器检测尿素的方法，其特征 在于， 上述步骤1:制备锆金属有机骨架材料Ui〇-66-NH2,包括下列步骤la、lb: 步骤la:将0.645g即2mmol 的ZrOCl2' 2.5出0,0.36288口2臟〇1的80(：-順2,4.8858即 40mmol苯甲酸和0 · 347mL浓度为12mo 1/L的浓盐酸超声溶解在34mL N，N-二甲基甲酰胺中， 溶解后，将溶液转移到l〇〇mL聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，将其放入烘箱中，在120°C下 反应24小时，再冷却至室温，将产物过滤，得到黄色粉末状产物，分别用20mL N，N-二甲基甲 酰胺和1 OmL丙酮淋洗三次，80 °C °C烘干，备用； 步骤lb:将步骤la得到的固体粉末放在20mL N，N-二甲基甲酰胺中离心浸洗12小时，每 4小时更换一次溶剂，接着用10mL乙醇浸泡1天，每8小时更换一次溶剂，然后在真空干燥箱 中于80°C下干燥20小时，即得到活化后的仍0-66-順 2材料； 上述步骤2中，将上述制得的含锆有机骨架材料Ui〇-66-NH2均匀研磨，称取研磨后的粉 末5.Omg超声振荡分散在100.OmL蒸馏水中，得到0.05mg/mL Ui〇-66-NH2材料溶液，避光贮 存在4°C下备用； 上述步骤3中，取脲酶10.Omg溶于1 .OmL羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲溶液中，该羟乙基哌 嗪乙硫磺酸缓冲溶液的浓度是20mmol/L、pH值7.4，制得浓度为10mg/mL脲酶溶液，避光贮存 在4°C下备用； 上述步骤4中，分别取3. OmL浓度为0.05 mg/mL的Ui〇-66-NH2材料溶液和0. lmL浓度为 10mg/mL的脲酶溶液，将两溶液充分混合后中，于37°C下保持10分钟，检测荧光信号； 上述步骤5中，在上述混合溶液中加入lOyL不同浓度的尿素，于37°C下孵育30分钟，检 测不同浓度尿素存在下的荧光信号； 步骤6:上述步骤5中所测的荧光信号与尿素浓度在一定范围内成线性，根据荧光信号 和工作曲线可以对样品中尿素进行定性、定量分析。
【文档编号】G01N21/64GK106018360SQ201610319801
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】蒋晓华, 丁文捷
【申请人】深圳职业技术学院