专利名称：三角褐指藻的双层平板固体培养方法
技术领域：
本发明涉及三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum, PT)的培养，尤其是涉及一种三角褐指藻的双层平板固体培养方法，以获得三角褐指藻的固体藻平板。
背景技术：
溶藻微生物，诸如溶藻的细菌、放线菌、病毒、真菌和原生动物的不断发现，为赤潮的微生物防治开拓了广阔的前景，而溶藻微生物的分离是赤潮微生物防治的基础。溶藻微生物的分离和筛选通常有两种途径一种是通过液体感染的方式，另一种是通过固体感染的方式。液体感染的方法是通过监测藻的生长是否受抑制来判断体系中是否存在溶藻微生物，包括用普通光学显微镜观察藻细胞是否发生裂解(l.Takao，Y.， K. Nagasaki, K. Mise, Τ.Okuno, D. Honda, Isolation and characterization of a novel single-stranded RNA virus infectious to a marine fungoid protist，Schizochytrium sp(Thraustochytriaceae, labyrinthulea). Applied and Environmental Microbiology, 2005. 71 (8) :4516-4522.)，或通过肉眼观察藻液颜色是否发生变化(2. Tomaru, Y.，Y. Shirai, H. Suzuki, Τ. Nagumo, K. Nagasaki, Isolation and characterization of a new single-stranded DNA virus infecting the cosmopolitan marine diatom Chaetoceros dehilis. Aquatic Microbial Ecology,2008. 50(2) :103-112 ；3. Imamura, N.，I. Motoike, N. Shimada, Μ. Nishikori, H. Morisaki, H. Fukami, An efficient screening approach for anti-Microcystis compounds based on knowledge of aquatic microbial ecosystem. Journal of Antibiotics，2001. 54(7) :582-587.)，或检测藻荧光值是否下降(4. Bettarel, Y.，J.Kan，K. Wang, K. Ε. Williamson, S. Cooney, S. Ribblett, F. Chen, K. Ε. Wommack, D. W. Coats, Isolation and preliminary characterisation of a small nuclear inclusion virus infecting the diatom Chaetoceros cf.gracilis. Aquatic Microbial Ecology, 2005. 40(2) :103-114 ；5. Su, J. Q. ， X. R. Yang, T. L. Zheng, Y. Tian, N. Z. Jiao,L. Z. Cai,H. S. Hong, Isolation and characterization of a marine algicidal bacterium against the toxic dinoflagellate Alexandrium tamarense. Harmful Algae, 2007. 6 (6) :799-810.)，来判断是否存在溶藻微生物，该方法适用于各种大小的藻类溶藻微生物的分离和筛选。但该方法存在很多缺点例如，有时需要每天通过显微镜观察对照组和处理组的藻细胞是否裂解，工作量大，且有些藻类的细胞较小在光学显微镜下不容易判断是否裂解；有时一些非生物因素也会导致藻细胞裂解或生长受抑制，易产生假阳性结果；有时虽然体系中存在溶藻微生物但并不能明显的抑制藻的生长，易产生假阴性结果。固体感染的方法是通过肉眼观察藻平板上是否出现空斑来判断体系中是否存在溶藻微生物(6. Bellec, L，N. Grimsley, Y. Desdevises, Isolation of Prasinoviruses of the Green Unicellular Algae Ostreococcus spp. on a Worldwide Geographical Scale. Applied and Environmental Microbiology,2010.76 (1) :96-101 ；7. Kim, J. D.， J. Y. Kim, J.K.Park,C. G. Lee,Selective Control of the Prorocentrum minimum HarmfulAlgal Blooms by a Novel Algal-Lytic Bacterium Pseudoalteromonas haloplanktis AFMB-008041. Marine Biotechnology, 2009. 11(4) :463-472.)，仅适合能在固体培养基上生长的藻类的溶藻微生物的分离和筛选，但其相对液体感染的方法更简单、直观。
发明内容
本发明的目的是提供一种三角褐指藻的双层平板固体培养方法。本发明所述三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum, PT)的双层平板固体培养方法，包括以下步骤1)将f/2培养基倒入平板中，自然凝固，用作下层培养基；2)将f/2培养基装入离心管中，自然凝固，使用时将其煮沸融化，用作上层培养基；3)取生长至对数期的三角褐指藻藻液10 20mL，离心，弃上清，f/2培养基重悬藻细胞，得浓缩藻液；4)将步骤幻所得上层培养基倒入步骤幻所得的浓缩藻液中，再铺于步骤1)所得的下层培养基上，自然凝固；5)将平板倒置，光照下培养。 在步骤1)中，所述f/2培养基的量可为20mL，所述f/2培养基含1 %琼脂，所述平板可采用直径为9cm平板。在步骤2)中，所述f/2培养基的量可为3. 5mL，所述f/2培养基含0. 7%琼脂，所述离心管可为IOmL离心管；所述使用时将其煮沸融化并置于50°C水浴。在步骤3)中，所述三角褐指藻藻液的藻密度可为3\106 10\106沈118/!^，所述离心可6000rpm离心5min ；所述f/2培养基重悬藻细胞，可用ImL f/2培养基重悬藻细胞。在步骤4)中，所述上层培养基的温度可为50°C。在步骤5)中，所述光照下培养可于20°C光照下培养。所述三角褐指藻的双层平板固体培养方法可应用于三角褐指藻溶藻微生物的分离。所述三角褐指藻的双层平板固体培养方法可应用于三角褐指藻溶藻微生物的溶藻活性检测。用于制备三角褐指藻双层平板的最适藻量范围可为10 20mL。本发明涉及的目标藻三角褐指藻，是一种细胞相对比较小的单细胞藻类，具有卵形、梭形和三出放射形三种不同的形态，这三种形态在不同的环境条件下可以转变。如在正常的液体培养的条件下，多是三出放射形细胞和少量的梭形细胞，这两种形态都没有硅质的细胞壁。三出放射形细胞长度约为10 18μπι(两臂间垂直距离)，梭形细胞长22μπι， 中部宽5 μ m，两臂末端较钝，卵形细胞长8 μ m，宽3 μ m，有一个硅质壳面，缺少另一个壳面。 生长至对数期的三角褐指藻藻液(按10 %接种，培养2周后的新鲜藻液，藻密度为3 X IO6 10X106cells/mL)浓缩10 20倍后与上层培养基混合倒平板，可直接用于后续实验；制备较高藻含量的双层平板会加大工作量，且平板上藻之间的营养竞争和空间竞争压力大，不利于实验；而较低浓度的藻在平板上不能生长，或者需要较长时间才能达到实验需要的藻密度，但这时的藻已经不新鲜，不适合用于实验。
图1为含藻量40mL的三角褐指藻双层平板。图2为含藻量30mL的三角褐指藻双层平板。图3为含藻量20mL的三角褐指藻双层平板。图4为含藻量IOmL的三角褐指藻双层平板。图5为含藻量5mL的三角褐指藻双层平板。图6为不含三角褐指藻的双层平板空白对照。图7为溶藻微生物裂解三角褐指藻形成的空斑结果。图8为双层平板-最大可能数法检测溶藻微生物活性的结果。
具体实施例方式本发明的三角褐指藻双层平板参见图1 5，它们分别为401^、301^、201^、101^和 5mL对数期的藻液(藻密度5.0X106cellS/mL)浓缩至ImL后制备的双层平板的结果。图 1和图2藻平板呈较深的黄褐色，含藻量大，需要用IOmL离心管进行多次离心，操作较繁琐； 图3和图4藻平板呈淡黄褐色，用肉眼能清楚的观察藻的生长状况，且藻量适中，用IOmL离心管离心1至2次即可；图5藻平板的颜色太淡，用肉眼较难观察藻的生长状况，且由于含藻量太低，藻的生长状况不稳定，有时藻甚至会死掉，因此不适合用于后续实验。三角褐指藻可以在双层平板上存活1个多月(随着时间延长，平板变干，藻就死亡了)。溶藻微生物裂解三角褐指藻形成的空斑见图7，在图7中，A代表藻，P代表空斑， 结果说明通过双层平板固体感染法可以成功的分离到三角褐指藻的溶藻微生物。利用双层平板-最大可能数法检测溶藻微生物活性，结果见图8，黑点为滴加溶藻微生物的位置，可以看到培养2周后有些蓝点位置出现了空斑，即呈阳性，记录阳性的稀释度和相应的重复数，查最大可能数表，得出溶藻微生物的浓度为4600CellS/mL。这里注意要用新鲜制备的藻平板O天之内)，否则实验结果会不太好。实验结果表明可以利用固体双层平板培养三角褐指藻，并通过双层平板固体感染法成功的分离到三角褐指藻的溶藻微生物，且可以用藻双层平板检测三角褐指藻溶藻微生物的活性。本发明涉及双层培养基，它们由f/2藻培养基添加一定比例的琼脂配制而成，下层培养基较厚，琼脂浓度较高，为藻的生长提供营养和基质，上层培养基为薄薄的一层，琼脂浓度较低，藻在这层培养基中生长。以下具体实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于下述实施例。实施例1 用于制备三角褐指藻双层平板的藻量确定(l)20mL f/2培养基(含琼脂)倒平板(直径为9cm)，自然凝固，用作下层培
养基；(2)3. 5mL f/2培养基(含0.7%琼脂)装到IOmL离心管中，自然凝固，使用时将其煮沸融化，并置于50°C水浴，用作上层培养基；(3)取生长至对数期的三角褐指藻藻液(藻密度5.0XlO6ceIlsAiL) 5 40mL， 6000rpm离心5min，弃去上清，用ImL f/2培养基重悬藻细胞；
(4)将50°C的上层培养基倒入上述浓缩的藻液中，迅速混勻并均勻地铺于下层培养基上，自然凝固，ImL f/2培养基与上层培养基倒平板作为空白对照；(5)将平板倒置，于20°C光照下培养；(6)用于制备三角褐指藻双层平板的最适藻量范围10 20mL。含不同藻量的双层平板见图1 6。实施例2 利用双层平板法分离三角褐指藻的溶藻微生物(1)采集厦门海域表层海水，保存于4°C，立即用于溶藻微生物的分离；(2)20mL f/2培养基(含琼脂)倒平板(直径为9em)，自然凝固，用作下层培
养基；(3)3. 5mL f/2培养基(含0.7%琼脂)装到IOmL离心管中，自然凝固，使用时将其煮沸融化，并置于50°C水浴，用作上层培养基；(4)取生长至对数期的三角褐指藻藻液(藻密度6. 0 X 106cells/mL) IOmL, 6000rpm离心5min，弃去上清，ImL海水样品重悬藻细胞，做3个重复；(5)将50°C的上层培养基倒入上述浓缩的藻液中，迅速混勻并均勻地铺于下层培养基上，自然凝固；(6)将平板倒置，于20°C光照下培养2周，观察藻板上是否出现空斑；(7)实验结果见图7。实施例3 双层平板-最大可能数法检测溶藻微生物活性(l)20mL f/2培养基(含琼脂)倒平板(直径为9em)，自然凝固，用作下层培
养基；(2)3. 5mL f/2培养基(含0.7%琼脂)装到IOmL离心管中，自然凝固，使用时将其煮沸融化，并置于50°C水浴，用作上层培养基；(3)取生长至对数期的三角褐指藻藻液(藻密度4. 8XlO6ceIlsAiL) 10mL， 6000rpm离心5min，弃去上清，ImL f/2培养基重悬藻细胞；(4)将50°C的上层培养基倒入上述浓缩的藻液中，迅速混勻并均勻地铺于下层培养基上，自然凝固；(5)溶藻微生物样品用f/2培养基稀释10倍和100倍，分别取10 μ L原液和稀释液滴于藻平板上，每个浓度3个重复，待液体被藻平板吸收后，将平板倒置，于20°C光照培养2周；(6) 2周后，记录出现空斑的稀释度及相应的重复数，查最大可能数表，得出溶藻微生物的浓度为4600cells/mL。结果见图8。
权利要求
1.三角褐指藻的双层平板固体培养方法，其特征在于包括以下步骤1)将f/2培养基倒入平板中，自然凝固，用作下层培养基；2)将f/2培养基装入离心管中，自然凝固，使用时将其煮沸融化，用作上层培养基；3)取生长至对数期的三角褐指藻藻液10 20mL，离心，弃上清，f/2培养基重悬藻细胞，得浓缩藻液；4)将步骤幻所得上层培养基倒入步骤幻所得的浓缩藻液中，再铺于步骤1)所得的下层培养基上，自然凝固；5)将平板倒置，光照下培养。
2.如权利要求1所述的三角褐指藻的双层平板固体培养方法，其特征在于在步骤1) 中，所述f72培养基的量为20mL。
3.如权利要求1或2所述的三角褐指藻的双层平板固体培养方法，其特征在于在步骤1)中，所述f/2培养基含琼脂。
4.如权利要求1所述的三角褐指藻的双层平板固体培养方法，其特征在于在步骤1) 中，所述平板采用直径为9cm平板。
5.如权利要求1所述的三角褐指藻的双层平板固体培养方法，其特征在于在步骤2) 中，所述f/2培养基的量为3. 5mL。
6.如权利要求1或5所述的三角褐指藻的双层平板固体培养方法，其特征在于在步骤2)中，所述f/2培养基含0.7%琼脂。
7.如权利要求1所述的三角褐指藻的双层平板固体培养方法，其特征在于在步骤2) 中，所述使用时将其煮沸融化并置于50°C水浴。
8.如权利要求1所述的三角褐指藻的双层平板固体培养方法，其特征在于在步骤3) 中，所述三角褐指藻藻液的藻密度为3 X IO6 10 X 106cells/mL,所述离心是6000rpm离心 5min ；所述f72培养基重悬藻细胞，是用ImL f/2培养基重悬藻细胞。
9.如权利要求1所述的三角褐指藻的双层平板固体培养方法，其特征在于在步骤4) 中，所述上层培养基的温度为50°C。
10.如权利要求1所述的三角褐指藻的双层平板固体培养方法，其特征在于在步骤5) 中，所述光照下培养于20°C光照下培养。
全文摘要
三角褐指藻的双层平板固体培养方法，涉及三角褐指藻的培养。将f/2培养基倒入平板中，自然凝固，用作下层培养基；将f/2培养基装入离心管中，自然凝固，使用时将其煮沸融化，用作上层培养基；取生长至对数期的三角褐指藻藻液10～20mL，离心，弃上清，f/2培养基重悬藻细胞，得浓缩藻液；将所得上层培养基倒入浓缩藻液中，再铺于下层培养基上，自然凝固；将平板倒置，光照下培养。
文档编号C12R1/89GK102296031SQ20111025068
公开日2011年12月28日 申请日期2011年8月29日 优先权日2011年8月29日
发明者张帮周, 郑天凌, 郑小伟, 黄丽萍 申请人:厦门大学