富含蜡酯的裸藻属藻体的生产方法及蜡酯制造方法

专利名称：富含蜡酯的裸藻属藻体的生产方法及蜡酯制造方法
技术领域：
本发明涉及富含蜡酯的裸藻属藻体的生产方法及蜡酯制造方法，所述富含蜡酯的裸藻属藻体的生产方法能够以低能量、低成本生产富含成为生物燃料的原料的蜡酯的微藻类的裸藻属藻体。
背景技术：
近年来，全球暖化问题日益严重，抑制作为温室效应气体之一的二氧化碳气体的排放量、通过固定二氧化碳而降低大气中的二氧化碳浓度成为大的课题。
这样的情况下，使用含有被固定的二氧化碳的化石燃料作为能源会导致将固定的二氧化碳再次释放到大气中，而成为环境问题。另外，由于化石燃料为有限的资源，因此也存在枯竭的问题。
为了解决如上述那样的问题，需要除化石燃料以外的燃料源，对以高等植物或藻类为原料的生物燃料的开发的期待升高。
作为成为生物燃料原料的候选的高等植物，已知有大豆、玉米、棕榈等，但在以可食用作物为原料的情况下，有可能导致粮食不足而成为问题。另一方面，利用麻风树、亚麻荠等非食用植物的生产也正在推进，但是存在每单位面积的生产量低的问题。
另一方面，普遍栖息于湖或沼泽中的光合微生物或原生动物具有与植物相同的光合能力，从水与二氧化碳生物合成碳水化合物和脂质，在细胞内蓄积几十质量％。已知，与植物相比，其生产量以每单位面积计，为被认为其生产量高的棕榈的10倍以上。
但是，作为一种光合微生物的微藻类的裸藻属藻体为鞭毛虫的一组，包括作为有运动性的藻类有名的 眼虫藻(日文$ K 'J ^ ) 0大部分的裸藻属藻体具有叶绿体，进行光合作用，而进行独立营养生活，也有的捕食或者吸收营养。裸藻属(Euglena)为分类到动物学与植物学的双方的属。
在动物学中，有属于原生动物门(Protozoa)的鞭毛虫纲(Mastigophorea)、植鞭亚纲(Phytomastigophorea)的目中的眼虫目(Euglenida),其由三个亚目、即眼虫亚目 (Euglenoidina)、Peranemoidina、Petalomonadoidina 组成。
在眼虫亚目中，包括眼虫属(Euglena)、壳虫藻属(Trachelemonas)、陀螺藻属 (Strombonas)、扁裸藻属(Phacus)、鳞孔藻属(Lepocinelis)、变胞藻属(Astasia)、柄裸藻属(Colacium)作为属。在植物学中，有裸藻门(Euglenophyta),其下面有裸藻纲 (Euglenophyceae)、裸藻目(Euglenales),作为包括在该目中的属，除了裸藻属(Euglena) 以外，与动物分类表相同。
裸藻属藻体在细胞内蓄积裸藻淀粉(Paramylon)作为碳水化合物。裸藻淀粉为约 700个葡萄糖通过β-1，3-键聚合的高分子体粒子。
裸藻属藻体如果被置于厌氧状态，则分解储备多糖、即裸藻淀粉而进行以由脂肪酸和脂肪醇形成的蜡酯为最终产物的蜡酯发酵。
在非专利文献I中记载了，将裸藻属藻体在光照射下培养后，在置换成无氮源的培养基的实验区，每I个细胞的裸藻淀粉蓄积量增加，但在置换成添加了氮源的培养基的实验区，每I个细胞的裸藻淀粉含量降低。
在专利文献I中记载了，通过将裸藻属藻体好氧培养后置于厌氧条件下，从而使储备多糖裸藻淀粉发酵并转换成蜡酯。
在专利文献2中记载了如下方法通过将微藻类的裸藻属藻体好氧培养，添加不饱和脂肪酸后，置于厌氧条件下，从而使储备多糖裸藻淀粉发酵并转换成蜡酯，由此生产不饱和蜡酯，该不饱和蜡酯成为用作优质润滑油的抹香鲸油的代替原料。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特公平3-65948号公报
专利文献2 :日本特公平5-27384号公报
非专利文献
非专利文献1:Sumida et al. , Ammoni a-and Linght-1nduced Degradationof Paramylum in Euglena gracilis. Plant Cell Physiol.28 (8).P1587-1592 (1987)发明内容
发明所要解决的课题
但是，在非专利文献I中，仅对裸藻淀粉的分解控制有记载，并未暗示与蜡酯发酵的组合。
另外，在专利文献I中，作为好氧培养的方法，仅公开了添加葡萄糖等有机物作为碳源、或者在通常的光合条件下进行培养等通常的方法。
在生物燃料的制造中，使用葡萄糖等碳源的培养法并不划算，与二氧化碳的固定也无关。
此外，专利文献2中所公开的技术的目的在于，以高收量得到不饱和蜡酯，但作为生物燃料的原料，饱和蜡酯更为理想。
本发明的目的在于解决上述各问题，提供富含蜡酯的裸藻属藻体的生产方法及蜡酯制造方法，所述富含蜡酯的裸藻属藻体的生产方法通过利用光合作用以二氧化碳为碳源将微藻类的裸藻属藻体好氧培养后，在氮饥饿状态下进一步进行培养，从而增加每一个细胞的裸藻淀粉蓄积量，然后置于厌氧状态下，由此能够生产富含蜡酯的裸藻属藻体。
用于解决课题的手段
上述课题是根据本发明的富含蜡酯的裸藻属藻体的生产方法，通过包括如下工序来解决的 第I工序，将微藻类的裸藻属藻体好氧培养；第2工序，使培养有所述微藻类的裸藻属藻体的培养基为氮饥饿状态后进一步进行培养;第3工序，将细胞保持在厌氧状态下。
如此，通过实施好氧培养一在氮饥饿状态下进一步进行培养一将细胞保持在厌氧状态下这样的一系列工序，能够有效生产蜡酯的含量高的裸藻属藻体。
S卩，通过工序2的氮饥饿状态下的培养，能够使裸藻属藻体充分蓄积碳水化合物。
因此，在工序3中，通过将在工序2中培养的细胞置于厌氧状态，使在工序2中充分蓄积的碳水化合物转换为蜡酯，因此结果是在工序3中的蜡酯蓄积量飞跃性增加。
换言之，通过组合这些工序I —工序2 —工序3，产生蜡酯的蓄积量飞跃性增加这样的有益效果。
另外，在氮饥饿状态下培养的裸藻属藻体的细胞即使在刚刚厌氧处理后也呈现与培养时同样的绿色，几乎没有死亡细胞，细胞的大小也与厌氧处理前没有变化。
S卩，当在不含氮源的培养基中进行厌氧处理时，还产生与含有氮源的培养基的情况相比裸藻属藻体的细胞的生存率大幅改善这样的有益效果。
另外，此时，所述氮饥饿状态如果通过将上述培养基置换成氮源缺乏培养基来创建，则能够有效创建氮饥饿状态，因此优选。
如此，通过实施好氧培养一置换成氮源缺乏培养基进一步进行培养一将细胞保持在厌氧状态下这样的一系列工序，能够有效生产蜡酯的含量高的裸藻属藻体。
具体地说，优选地在所述第I工序中，在将所述微藻类的裸藻属藻体用不含氮源的培养基开始好氧培养的同时，适宜地调节流加量而加入氮源，进行持续且好氧的培养，当细胞浓度达到一定水平时停止氮源的流加，在所述第2工序中，置于氮饥饿状态下进一步进行培养。
进而，具体地说，在所述第I工序中，通过通入二氧化碳气体，而赋予混有二氧化碳源的氧气源，所述二氧化碳气体更优选为从发电厂排放的二氧化碳气体。
通过这样构成，可以将培养过程确定而进行工业化，而 能够进行大量生产。
进而，能够有效利用作为排放气体可得到的二氧化碳气体，因此成为在成本方面上有利、且在环境方面也非常有用的技术。
另外，就工序2的氮饥饿状态而言，由于在工序I中停止氮源的流加，因此产生裸藻属藻体同化全部氮源的结果。
此外，优选在所述第3工序中，利用从通入不活泼气体、静置处理、借助离心分离的浓缩中选择的至少一种方法，进行厌氧处理。
可以选择其中一种方法，也可以组合多种方法。
另外，上述课题是根据本发明的蜡酯制造方法，通过使用富含蜡酯的裸藻属藻体， 该裸藻属藻体利用方案I至方案5中任一项所述的富含蜡酯的裸藻属藻体的生产方法来生产，并实施如下工序来解决的用有机溶剂提取油组份而得到提取液，将该提取液浓缩而得到蜡成分的工序；利用柱从所述蜡成分中分离蜡酯而进行第I精制的工序。
如此，在本发明中，可以利用培养后的裸藻属藻体，简易地精制蜡酯成分。
该裸藻属藻体可以利用上述方案I至方案6中所述的方法，以富含蜡酯的状态简易且大量培养。
因此，根据本发明，可以利用大量培养的裸藻属藻体，稳定地供给优质且清洁的燃料。
具体地说，所述浓缩优选在50°C 土 10°C的范围内实施。
如果低于该温度，则因蜡成分的粘性而突沸，无法消除蜡成分喷出到浓缩器、即蒸发器内的可能性。
更具体地说，优选实施如下的工序作为后续工序对通过所述进行第I精制的工序而得到的所述蜡酯进行水解，进行第2精制的工序。
如果这样构成，则可以将在第I精制中粗制的物质通过第2精制进一步精制，而可以提供更优质的燃料。
即，通过在进行第I精制的工序后，在第2精制中进行水解，从而碳链变短，挥发性增加，作为燃料的价值升高。
另外，在所述进行第I精制的工序中，作为适用于所述柱的洗脱溶剂，优选使用己烷或者将醚以10体积％以下混合后的己烷和醚的混合溶剂。
如果这样构成，则可以有效分离叶绿素，并且可以有效排除其他色素，因而优选。
因此，可以提供更优质的燃料。
另外，利用上述蜡酯制造方法由裸藻属藻体制造的蜡酯成为优质的生物燃料，这些生物燃料可以大量且稳定地提供。
此外，其为清洁能源，大大有助于改善环境问题等。
如上所述，为了解决上述课题，本发明的蜡酯制造方法的最大特征在于，包括将裸藻属藻体好氧培养的培养工序；通过在培养工序后、在氮饥饿状态下进一步进行培养使碳水化合物蓄积的培养工序；通过将培养的细胞置于厌氧状态而使碳水化合物转换为蜡酯的厌氧发酵工序。
发明效果
根据本发明，可以由通过光合作用而固定的二氧化碳廉价地提供油脂含量多的生物质原料。
另外，如果根据本发明来制造生物燃料，则也带来能源自给率的提高。


图1为示出本发明的第I实施方式涉及的富含蜡酯的裸藻属藻体的生产方法的工序图。
图2为示出本发明的第2实施方式涉及的富含蜡酯的裸藻属藻体的生产方法的流程图。
图3为示出本发明的一实施方式涉及的蜡酯的制造方法的工序图。
具体实施方式
下面，基于附图，说明本发明的一实施方式。
需要说明的是，下面说明的构成并不限定本发明，而在本发明的主旨的范围内能够进行各种改变。
本实施方式涉及一种裸藻属藻体的生产方法,其通过在好氧条件下培养裸藻属藻体后，在氮饥饿状态下进一步进行培养，然后置于厌氧状态，从而使裸藻属藻体富含蜡酯。
(第I实施方式)
根据图1，对本发明涉及的富含蜡酯的裸藻属藻体的生产方法的第I实施方式进行说明。
本生产方法包括工序1(相当于第I工序)，将裸藻属藻体用添加了氮源的培养基进行好氧培养；工序2 (相当于第2工序)，置换成不含氮源的培养基而进行好氧培养；工序3 (相当于第3工序)，进行厌氧处理，使碳水化合物发酵成蜡酯。
首先，工序I中的裸藻属藻体的培养也可以通过将大气通入培养基中作为二氧化碳源来进行，但为了提高培养效率，优选将二氧化碳气体通入培养基中。
S卩，由于在大气或二氧化碳气体中还含有氧气，由此进行好氧培养。
二氧化碳气体的通入可以通过利用例如从工厂或发电厂等排放的燃烧排气来进行。此时，优选利用集尘机、脱硝装置、脱硫装置等预先去除燃烧排气中的尘埃、NOx和S0X。 另外，搅拌可以采用借助通气的气升(airlift)方式、或使用搅拌叶片的方法等通常的技术。
对于光而言，可以通过照射荧光灯等人工光进行培养，但为了以更低能量、更低成本进行培养，优选仅用太阳光进行培养。
另外，培养基的水温优选控制在29± 1°C。
但是，为了对水温控制不投入能量而不进行温度控制，或者若进行水温控制，则优选进行如下的最小限度的控制按照不会达到裸藻属藻体死亡那样的高温的方式进行冷却、按照在冬季或夜间水温不会下降过低的方式加热等。
作为裸藻属藻体的培养基组成，例如可以使用改良Cramer-Myers培养基 ((NH4)2HPO41. Og/L, KH2PO41. Og/L、MgSO4 · 7H20 O. 2g/L、CaCl2 · 2H20 0. 02g/L、EDTA · 2Na 0. 05g/L、Fe2 (SO2)3 · 7H20 3mg/L、MnCl2 · 4H201. 8mg/L、CoSO4 · 7H201. 5mg/L、ZnSO4 · 7H20 0. 4mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 02g/L、盐酸硫胺素(维生素 B1) 0. lmg/L、 氰钴胺素(维生素B12)、(ρΗ3·5))。另外，(NH4)2HPO4可以改变为(NH4)2S04或NH3aq。
需要说明的是，培养基组成当然并不限于此。
培养基的pH只要在2 7. 5的范围内即可，但优选调节到3. 5或5. 5。特别是，通过使pH为4. 5以下的酸性，能够有效抑制动物性浮游生物或细菌等的污染。
接着，在工序2中，置换成不含氮源的培养基，进一步进行培养。
工序2中的不含氮源的培养基组成例如可以使用Resting培养基、I %甘露醇、 O. 2% MgCl2 · 6Η20、0· 14% ΚΗ2Ρ04。
需要说明的是，培养基组成只要不含氮源则当然并不限于此。
接着，在工序3中，进行培养后的裸藻属藻体的厌氧处理。
厌氧处理通常通过向培养后的培养基中通入氮气等不活泼气体来进行。此外，厌氧处理也可以通过将培养基静置来进行。这是因为，如果将培养基不搅拌而静置则细胞会沉淀，形成高密度，结果导致缺氧。也可以通过利用离心分离制造高密度状态来进行厌氧处理。
此时的pH只要不是极度低或高的值即可，光照射的有无对蜡酯发酵没有影响。保持温度只要不是裸藻属藻体死亡那样的高温、培养基冻结那样的低温即可。通常在6小时 72小时内蜡酯发酵结束。
另外，通过在工序2的氮饥饿状态下的培养，能够使碳水化合物充分蓄积在裸藻属藻体内。
因此，在工序3中，通过将在工序2中培养后的细胞置于厌氧状态，使在工序2中充分蓄积的碳水化合物转换为蜡，因此结果是工序3中的蜡酯蓄积量飞跃性增加。
换言之，通过将这些工序I —工序2 —工序3组合，产生蜡酯的蓄积量飞跃性增加这样的、由各单独工序得不到的有益效果。
另外，在下述实施例中会进行详述，在氮饥饿状态下培养的裸藻属藻体的细胞在刚刚厌氧处理后也呈现与培养时同样的绿色，几乎没有死亡的细胞，细胞的大小也与厌氧处理前没有变化。
S卩，如果用不含氮源的培养基进行厌氧处理，则还产生与含有氮源的培养基相比裸藻属藻体的细胞的生存率大幅改善这样的有益效果。
如上所述，通过将这些工序I —工序2 —工序3组合，可以得到与以往相比含有显著多的蜡酯的细胞活性高的裸藻属藻体。
(第2实施方式)
根据图2，对本发明涉及的富含蜡酯的裸藻属藻体的生产方法的第2实施方式进行说明。
需要说明的是，由于培养基组成、培养条件等与第I实施例相同，因此省略同样的说明，仅对不同点进行说明。
工序I中的好氧培养工序中，使用从第I实施方式的工序I中的改良 Cramer-Myers培养基中去掉氮源的培养基。
S卩，在开始阶段，用不含氮源的培养基开始裸藻属藻体的好氧培养。
工序I中，首先，在步骤SI中，向接种了裸藻属藻体的培养基流加氮源。
然后，由步骤S2进行好氧培养。
接着，在步骤S3中，判定能否终止氮源添加。
在步骤3中，如果判定为不终止氮源添加(步骤S3 :否)，则处理返回至步骤SI而流加氮源。
另外，在步骤3中，如果判定为可以终止氮源添加(步骤S3 :是)、则处理推进至步骤S4，终止氮源添 加。
S卩，在工序I中，逐渐流加氮源，进行含氮源的好氧培养。
该氮源的流加量等依赖于气候、气温等条件，通过考虑这些条件来适宜地调节。
另外，作为终止氮源添加的大概标准，本实施方式中，在考虑上述条件等的同时， 选择例如细胞浓度达到一定水平的时期等。
接着，在工序2(步骤S5)中，继续进行必要期间的好氧培养。
此时，虽然在初始阶段残留有氮源，但随着时间的推移氮源被裸藻属藻体同化，形成氮源饥饿状态。
由此，实现所谓工序2的“好氧培养工序、无氮源”这样的培养工序。
接着，在步骤S6中，实施工序3的厌氧发酵工序，该工序与第I实施方式相同。
另外，作为添加氮源的方法，还可以考虑将氮源在培养开始时一次性投入的方法。
该情况下，虽然在初始阶段残留有氮源，但随着时间的推移氮源被裸藻属藻体吸收，形成氮源饥饿状态。
由此，实现氮饥饿状态下的好氧培养、即“好氧培养工序、无氮源”这样的培养工序。
上述第2实施方式涉及的富含蜡酯的裸藻属藻体的生产方法在对工业化生产线进行放大时有效。
S卩，可通过连续操作进行培养，而不需要用于置换培养基的离心分离作业等。
因此，减少培养所需的能源用量，有效应用于富含蜡酯的裸藻属藻体的大量生产。
接着，参照图3，对本实施方式涉及的由裸藻属藻体制造蜡酯的方法的工序进行说明。
首先，在工序i中培养裸藻属藻体。这是上述第I实施方式或第2实施方式涉及的生产工序中的培养。
接着，在工序2中提取蜡酯。
然后，将工序2中所得到的成分在工序3中进行第I精制，接着，在工序4中进行第2精制，得到蜡酯。
在第I精制中，利用有机溶剂由裸藻属藻体提取蜡酯，在第2精制中，利用柱进行蜡酯的分离精制。
这样精制的蜡酯有效用作含有该蜡酯的生物燃料。
实施例
(关于富含蜡酯的裸藻属藻体的生产方法)
下面，对本发明涉及的富含蜡酯的裸藻属藻体，示出一实施例而进行具体说明。
在该实施例中，使用了 Euglena graclilis Z株。
培养基通过对改良Cramer-Myers 培养基((NH4) 2HP041. Og/L、KH2PO4L Og/L、 MgSO4 · 7H20 0. 2g/L、CaCl2 · 2H20 0. 02g/L、EDTA · 2Na 0. 05g/L、Fe2(SO2)3 · 7H20 3mg/L、 MnCl2 · 4H201. 8mg/L、CoSO4 · 7H201. 5mg/L、ZnSO4 · 7H20 0. 4mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 2mg/L、 CuSO4 · 5H20 0. 02g/L、 盐酸硫胺素(维生素B1W. lmg/L、氰钴胺素(维生素B12)、(ρΗ5· 5)) 进行高压锅灭菌来制备。
(工序1:好氧培养)
将制备的培养基880ml放入IL容量的振荡培养瓶内后，以初始浓度为约O. 05g/ L的方式接种裸藻属藻体的种藻体，在设定为29°C的人工气候箱(SANYO公司制、GROWTH CABINET)内振荡培养9天。光照射强度设为约100 μ mol/(m2 · s)，光照射时间设为24小时连续进行。向培养瓶中，供给二氧化碳气体至其浓度为10%。
(工序2:缺氮培养)
培养9天后，将培养液分成2份，分别置换成不含氮源的培养基、含有氮源的培养基。
具体地说，从880ml的培养液分盛各420ml的培养液，分别离心分离舍弃上清液后，向一方沉淀中加入去掉氮源的改良Cramer-Myers培养基(以下,称为氮源缺乏培养基，KH2PO41. 0g/L、MgSO4 · 7H20 0. 2g/L、CaCl2 · 2H20 0. 02g/L、EDTA · 2Na 0. 05g/L、 Fe2 (SO2) 3 · 7H20 3mg/L、MnCl2 · 4H201. 8mg/L、CoSO4 · 7H201. 5mg/L、ZnSO4 · 7H20 0. 4mg/ UNa2MoO4 · 2H20 0. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 02g/L、盐酸硫胺素(维生素 B1) 0. lmg/L、氰钴胺素(维生素B12)、(ρΗ5· 5) 420ml，向另一方沉淀中，加入新的CM培养基(包含氮源)420ml， 并将沉淀混悬。
将置换成氮源缺乏培养基的培养液作为样品1，将置换成新的CM培养基的培养液作为样品2。
替换培养基后，在设定为29°C的人工气候箱内进一步将样品I与样品2同时进行振荡培养48小时。光照射强度设为约100 μ mol/(m2 · s)，光照射时间设为24小时连续进行。向培养瓶中，供给通入浓度为10%的二氧化碳气体。
(工序3:厌氧处理)
进行培养基置换培养后，测定样品I和样品2的干燥重量(表1A)，在设定为29°C 的人工气候箱内遮光密封培养瓶，静置，由此将细胞置于厌氧状态。
培养液中的裸藻属藻体细胞的干燥重量的测定方法如下。
在干燥机内、于105°C，预先干燥30分钟，用测定了重量的具有约I μ m的孔径的玻璃纤维滤纸GS-25(ADVANTEC公司制)过滤培养液1ml。接着，将玻璃纤维滤纸放入设定为 105 °C的干燥机内，干燥I小时。其后，在真空干燥器内一边进行减压一边进行20分钟的脱湿、冷却，然后用精密天平秤测定重量。将过滤前后的滤纸的重量之差作为每Iml的干燥重量。
进行厌氧处理48小时后，回收两个样品。使用离心分离机(K0KUSAN公司制、 H-103FN)，在常温下，以3000rpm将回收的400ml的培养液离心分离5分钟后，舍弃上清液， 回收沉淀的藻体。将回收的藻体冷冻后，进行冷冻干燥。
(脂质的提取)
将50ml容量的茄型烧瓶在真空干燥器内干燥约I小时，测定茄型烧瓶本身的重量。将冷冻干燥后的裸藻属藻体粉末用抹刀等破碎，将该粉末称量并放入50ml容量的三角培养瓶中。此时，样品I的重量为O. 693g、样品2的重量为O. 480g(表1B)。
接着，在各样品中加入20ml的己烧，进彳丁混悬。为了进一步破碎粉末块，进彳丁 30秒钟的超声波破碎。将自然沉淀后的上清液用巴斯德吸管转移到50ml容量的带盖玻璃制离心管中，以3000rpm离心分离10分钟,上清液通过滤纸(Advantec公司、NO. 2)进行过滤。
提取操作在更换溶剂的条件下反复进行计9次。
S卩，使用己烷将上述的提取操作反复进行3次后，将有机溶剂更换为丙酮而同样地进行提取操作3次，最后使用将己烷与丙酮以1:1混合的溶剂进行提取操作3次。
其后，使用旋转蒸发器(东京理化器械公司制、ROTARY VACCUUMEVAP0RAT0R)，将含有滤液的茄型烧瓶在40 50°C下进行热水浴，使己烷、丙酮蒸发。使用少量的己烷，一边刷洗茄型烧瓶内，一边转移到已秤量的茄型烧瓶内。将该操作反复进行4次后，与上述同样地蒸发己烷。
用铝箔盖住茄型烧瓶，放入真空干燥器内，使剩余的己烷蒸发，并干燥30分钟 I 小时左右。
测定从裸藻属藻体粉末提取脂质后的茄型烧瓶的重量，减去最初测定的茄型烧瓶本身的重量，而计算出脂质重量(表1C)。
需要说明的是，利用本提取方法来提取的脂质的绝大部分由蜡酯构成。
本实验的结果，就最终的粗脂质的提取量而言，用氮源缺乏培养基培养的样品I 为O. 188g，用含有氮源的CM培养基培养的样品2为O. 157g，用氮源缺乏培养基培养的样品的粗脂质的收量多O. 031g(表1C)。
另外，就相对于厌氧处理前的干燥重量的粗脂质的含有率而言，用氮源缺乏培养基培养的样品I为23%，用含有氮源的CM培养基培养的样品2为16%，用氮源缺乏培养基培养的样品的脂质含有率也高7% (表1C/A)。
进而，样品I在厌氧处理的前后细胞重量减少约O. 120g，在样品2中细胞重量也减少了 O. 507g(表1B)。刚刚厌氧处理后的样品2的培养液变为茶色，进行显微镜观察的结果，死亡的细胞多，生存的细胞的大小也变小。另一方面，样品I在刚刚厌氧处理后也呈现与培养时同样的绿色，进行显微镜观察的结果，几乎没有死亡的细胞，细胞的大小也与厌氧处理前没有变化。由以上的结果可知，如果用不含氮源的培养基进行厌氧处理，则与含有氮源的培养基相比细胞的生存率大幅改善。
将结果总结于表I。
[表 I]
AB.CCxA厌氧处理前干燥重量 (g /'400ml)厌氧处理后干燥重量 (g / 4 O Oml)粗脂质提取量 (g / 4 0 0ml'}脂质含有率 ■%；样品I (氮源缺乏培养基)O. 8 13O. 6 9 3O18 82 3样品2 (CM 培养基)O 9 8 7O. 4 8 0O, I 5 7I b
由以上结果可知，与用含氮源的培养基培养的实验区相比，在被置于氮饥饿状态的实验区中，不仅最终的脂质的收量增加，而且厌氧处理前后的细胞的生存率也显著改善。
(关于蜡酯的分离精制)
接着，对于从裸藻属藻体提取蜡酯并精制的步骤的一实施例进行说明。
本实施方式中，使用粉末化的裸藻属藻体，提取贮藏于裸藻属藻体体内的蜡酯并精制(工序2)。
(材料)
裸藻属藻体粉末I Okg己烷60L乙醚ILWakogel C-300300g
1.提取及过滤
(I)秤量裸藻属藻体Ikg,混悬于2. 5L己烧中
(2)用搅拌机剧烈搅拌
30 秒钟 X3 次
(3)在室温下放置10分钟，使裸藻属藻体粉末自然沉淀
(4)将上清液用滤纸抽滤
(5)将沉淀物转移到布氏漏斗中，挤出附着于沉淀物的油成分
(6)将(4)的滤液和(5)的回收液转移到茄型烧瓶中，用旋转蒸发仪浓缩(浓缩条件温度50°C 土 10°C、减压度IOOmmHg 150mmHg)。以下将该浓缩液记作“浓缩样品”。
2.分离精制(工序3)
(I)向玻璃柱(I 00φ)内填充30厘米左右(填充约300g)的用己烷混悬的Wakogel C-300
(2)流过I个柱容积的己烷使柱平衡
(3)将约500g左右的浓缩样品投入柱内
(4)用洗脱溶剂从保持在柱上的浓缩样品分离蜡成分，其中所述洗脱溶剂使用如下3种溶剂
a.己烷乙醚=100 0(以下，记作“洗脱溶剂a”)
b.己烷乙醚=95 5 (以下，记作“洗脱溶剂b”)
c.己烷乙醚=90 10 (以下，记作“洗脱溶剂c”)
(5)通过对分离的蜡成分进行酸水解来进行第2精制(工序4)。
结果
示出利用上述方法来实施的蜡酯的提取结果。
(I)由裸藻属藻体IOKg提取到约3L左右的蜡成分。
根据最终的回收率可认为，通过一次的己烷提取能够将蜡成分几乎全部回收。
(2)进行过滤时，过滤性不良，因此在滤纸上散撒硅藻土后进行过滤。
(3)进行浓缩时，如果在30°C左右进行浓缩，则因挥发热而浓缩液冷却，从表面开始蜡成分的粘性变高，因突沸 而喷出到蒸发器内。为了避免该现象，如果在50°C左右进行浓缩，则蜡成分的粘性下降，能够避免因突沸喷出到蒸发器内。
(4)流过I个柱容积的己烷使柱平衡后，将约500g左右的浓缩样品投入柱内，但 280g左右未得到保持，而直接洗脱下来。因此，流过2个柱容积的洗脱溶剂a，将未保持的成分洗脱而浓缩。
(5)然后，流过3个柱容积的洗脱溶剂b，进行洗脱及浓缩，结果可知，蜡成分与黄色的色素一起被洗脱下来。
(6)接着，为了完全洗脱蜡成分，流过3个柱容积的洗脱溶剂C，进行洗脱及洗脱。
此时，能够回收约240g(300mL)左右的蜡成分。
另外，虽然能够分离出叶绿素成分，但若干色素虽然浓度很低但残留下来。
考察
根据上述的结果，用于保持240g左右的蜡成分所需的柱容量为约2L(约Ikg)，洗脱所需的溶剂的量为9个柱容积(约18L)。
可知，在蜡成分为2. 5kg的情况下，所需的柱容量为约24L(约12kg)，洗脱所需的溶剂的量为约200L左右。
如上所述，通过在分离后，进行水解，从而蜡酯的碳链变短，挥发性增加，作为燃料的价值升高。
并且，该蜡酯可以有效使用作为生物燃料。
裸藻属藻体在健康食品等中也使用，如此，其是容易获得的微生物，并且能够大量培养。
通过从这样的微生物、即裸藻属藻体回收优质的蜡酯，能够稳定地供给清洁的能量。
需要说明的是，本例中，虽然用有机溶剂进行提取，但提取方法并不限于此，例如， 也可以使 用这样的方法用水分离、使用二氧化碳流体的方法、压榨等物理方法。
权利要求
1.一种富含蜡酯的裸藻属藻体的生产方法，其包括第I工序将微藻类的裸藻属藻体好氧培养；第2工序将培养有所述微藻类的裸藻属藻体的培养基设为氮饥饿状态后进一步进行培养；以及第3工序将细胞保持在厌氧状态下。
2.根据权利要求1所述的富含蜡酯的裸藻属藻体的生产方法，其特征在于，所述氮饥饿状态通过将所述培养基置换成氮源缺乏培养基来创建。
3.根据权利要求1所述的富含蜡酯的裸藻属藻体的生产方法，其特征在于，所述第I工序中，在将所述微藻类的裸藻属藻体用不含氮源的培养基开始好氧培养的同时，适宜地调节流加量而加入氮源，进行持续且好氧的培养，当细胞浓度达到一定水平时停止氮源的流加，所述第2工序中，置于氮饥饿状态下进一步进行培养。
4.根据权利要求1或权利要求3所述的富含蜡酯的裸藻属藻体的生产方法，其特征在于，所述第I工序中，通过通入二氧化碳气体，而赋予混有二氧化碳源的氧气源。
5.根据权利要求4所述的富含蜡酯的裸藻属藻体的生产方法，其特征在于，所述二氧化碳气体为从发电厂排放的二氧化碳气体。
6.根据权利要求1所述的富含蜡酯的裸藻属藻体的生产方法，其特征在于，所述第3工序中，利用选自通入不活泼气体、静置处理、借助离心分离的浓缩中的至少一种方法，进行厌氧处理。
7.一种蜡酯的制造方法，其特征在于，使用利用权利要求1 6中任一项所述的富含蜡酯的裸藻属藻体的生产方法所生产的富含蜡酯的裸藻属藻体，并实施如下工序用有机溶剂提取油组份而得到提取液，将该该提取液浓缩而得到蜡成分的工序；利用柱从所述蜡成分中分离蜡酯而进行第I精制的工序。
8.根据权利要求7所述的蜡酯的制造方法，其特征在于，所述浓缩在50°C±10°C的范围内实施。
9.根据权利要求7所述的蜡酯的制造方法，其特征在于，实施如下的工序作为后续工序对通过所述进行第I精制的工序而得到的所述蜡酯进行水解而进行第2精制的工序。
10.根据权利要求7所述的蜡酯的制造方法，其特征在于，所述进行第I精制的工序中， 使用己烷或将醚以10体积％以下混合后的己烷和醚的混合溶剂作为适用于所述柱的洗脱溶剂。
全文摘要
本发明提供富含蜡酯的裸藻属藻体的生产方法及蜡酯制造方法，所述裸藻属藻体的生产方法通过利用光合作用以二氧化碳为碳源将微藻类的裸藻属藻体好氧培养后，在氮饥饿状态下进一步进行培养，从而增加每一个细胞的裸藻淀粉蓄积量，然后置于厌氧状态下，由此能够生产富含蜡酯的裸藻属藻体。本发明涉及富含蜡酯的裸藻属藻体的生产方法，其包括第1工序，将微藻类的裸藻属藻体好氧培养；第2工序，将培养基设为氮饥饿状态后进一步进行培养；第3工序，将细胞保持在厌氧状态下。
文档编号C12N1/12GK103003413SQ201180035039
公开日2013年3月27日 申请日期2011年7月13日 优先权日2010年7月20日
发明者岚田亮, 莎拉巴妮·米特拉 申请人:优瑞纳股份有限公司