专利名称：影响仔猪F4ac腹泻易感/抗性的MUC13基因关键标记位点及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物遗传育种领域，尤其是涉及一种影响仔猪F4ac腹泻易感/抗性的 MUC13基因关键标记位点及其在种猪遗传改良中的应用。
背景技术：
仔猪腹泻是养猪生产中的常见传染病，给世界养猪业造成了巨大经济损失。产肠毒素大肠杆菌F4(Enterotoxigenic Escherichia coli F4，ETEC F4)是引发新生和断奶前仔猪腹泻病的最主要致病菌。以我国和丹麦为例，分别有约35%和40%的仔猪腹泻病是因 ETEC F4侵染而引起的。在我国，其致死率在10%-30%之间，在个别地方甚至比这个比例更高，导致养猪出栏率、商品猪质量严重下降，经济效益受损。ETEC F4的致病性取决于其是否与猪小肠上皮细胞表面刷状缘的受体特异性结合。这种结合发生后，ETEC F4大量繁殖产生肠毒素，致使肠上皮细胞分泌功能亢进，大量水和电解质进入肠腔，造成肠腔中大量液体积蓄，超过了肠壁重吸收能力而引起腹泻。因此， 仔猪小肠上皮细胞有无ETEC F4受体是仔猪被ETEC F4感染时是否发病的关键。无受体猪表现为抵抗型，有受体猪则表现为易感型。分离和鉴别猪ETEC F4受体基因及其抗性位点因而成为猪ETEC F4腹泻抗病育种的关键。已有的研究表明猪ETEC F4受体是单基因控制的，呈显隐性遗传模式。携带显性基因S的猪对ETEC F4的粘附易感，隐性基因s纯合子猪则表现为抵抗型。常见西方商业猪种中，如大白、长白和杜洛克，均有一定比例的易感个体。ETEC易感性可以通过小肠刷状缘的体外黏附实验来判定，黏附的个体表现为易感，不黏附的个体表现为抵抗。ETEC F4根据免疫学特征分为ab，ac和ad三种亚型，其中F4ac在西方猪群中是最主要的致病菌。因而F4ac受体基因的定位和鉴别得到了国内外多个研究小组的重视。1995年，瑞典Leif Andersson小组利用欧洲野猪X大白猪资源家系群体为材料，经过三代系谱的连锁分析，首次将ETEC F4ac受体定位于13号染色体，与Tf基因紧密连锁，并发现F4ab和F4ac受体位点紧密连锁，认为这两个受体是由同一受体控制的。2002 年，瑞士 Peter Vogeli小组以大白猪和大白X长白三代家系为材料，利用13号染色体更多的微卫星标记信息，将ETEC F4ac受体进一步定位于S0068和Swl030之间，与其中的 S0075和Sw225高度连锁(θ = 0. 00)。这一结果在1年后瑞典Leif Andersson小组和丹麦j0rgensen小组联合开展的基因定位研究中得到了验证，他们还利用FISH和辐射杂种细胞克隆板技术揭示ETEC F4ac受体位于13号染色体q41区(SSC13q41)，分别与人3 号染色体的q28-29和q21区同源。2009年，瑞典Leif Andersson小组、丹麦j0rgensen 小组和瑞士 Peter Vogeli小组联合开展的精细定位将ETEC F4ac受体基因进一步缩小至 SSC13q41的SW207与S0075之间。并提出该受体基因最有可能位于Sw207与MUC4之间的 14Mb区域。鉴别SSC13q41区域的位置候选基因是当前ETEC F4ac受体研究的重点。大量的免疫生化特性研究表明，黏蛋白型唾液糖蛋白(IMTGP)，74kDa的转铁蛋白(GV74)和小肠中性糖鞘H(mLad)符合ETEC F4ac受体的理化特征，其中黏蛋白型唾液糖蛋白与F4ab和F4ac 结合，但不与F4ad结合，且该糖蛋白的存在与新生仔猪对ETEC F4ab或F4ac的敏感性高度相关，因而成为ETEC F4ac受体候选基因选择的重要依据。国内外研究小组在获得了 ETEC F4ac受体基因初步的染色体定位信息后，选择了黏附素糖蛋白编码基因(MUC基因家族)和转铁蛋白受体基因(TFRC)进行了研究，瑞士 Peter Vogeli小组对TFRC、B3GnT5、B4GALT4 和B4GALT4等4个基因进行了研究，但没有发现与F4ac黏附表型显著相关的候选基因和标记；丹麦J0rgensen小组在欧洲野猪X大白猪资源家系群体中，发现了 Mucin 4基因内含子7的一个SNP标记与ETEC F4ac的黏附表型共分离，由此申请了一项国际发明专利。申请人就该位点的影响效应在自身构建的白色杜洛克X 二花脸资源家系中开展了研究，发现该标记在始祖动物中没有多态性，而该资源家系的F2个体中有着充分分离的ETEC F4ac 的黏附表型，这表明该SNP标记只是与ETECF4ac受体基因因果突变(causative mutation) 呈一定连锁不平衡的分子标记，不能解释所有群体的ETEC F4ac受体遗传基础。因此，尽管国内外其他研究小组在ETEC F4ac受体基因鉴别方面取得了一定的进展，但仍未有重大的突破，迄今没有鉴别到真正的ETEC F4ac受体基因及其关键变异位点。
发明内容
本发明的第一个目的是提供影响新生和断奶前仔猪ETEC F4ac腹泻易感性/抗性的MUC13基因关键标记位点；通过现代分子生物学技术检测该基因关键标记位点，利用标记辅助选择(MAQ选择有利的等位基因型个体留种，可以显著提高种群新生和断奶前仔猪的抗腹泻病能力，大大减少仔猪死亡率。本发明的第二个目的是影响仔猪F4ac腹泻易感性/抗性的MUC13基因关键标记位点在种猪抗腹泻病性状遗传改良中的应用。本发明的第一个目的是这样实现的1、实验动物与易感/抗性表型判定1.1实验动物本发明用于目的基因定位的家系动物均来自申请人所构建的白色杜洛克X 二花脸猪资源家系群体。该资源家系以2头白色杜洛克公猪和17头二花脸母猪为祖代繁殖F1 代，选59头F1母猪与9头F1公猪自交产生F2代，在此基础上再选择62头F2公猪149头F2 母猪自交产生F3代个体。每个资源家系F2/F3群体个体均在对0士3日龄屠宰。本发明所使用的用于目的基因精细定位的远缘群体为292头纯种仔猪，其中代表我国6个生态类型(包括华南、华中、华北、江海、西南、高原型等)的12个地方猪种(含二花脸、金华猪、姜曲海猪、沙子岭猪、玉山黑猪、杭猪、通城猪、蓝塘猪、巴马香猪、莱芜猪、荣昌猪、藏猪)148头，每个猪种选取至少3个父系家系，每个家系选择3-4个6-8周龄个体； 另外从5个不同省份大型商业种猪场购买144头杜洛克、长白、大白猪种，每个猪种同样选取至少3个父系家系，每个家系选择3-4个6-8周龄个体。1.2易感/抗性表型判定猪只屠宰后，取小肠空肠部分，提取小肠上皮细胞刷状缘，利用E. coliF4ac菌株黏附猪小肠上皮细胞刷状缘，通过相差显微镜检测细菌的黏附结果。每个样品检测20个以上的刷状缘，若有10%以上的刷状缘上至少有2个细菌黏附，判该样品为黏附型，若至少有 2个细菌黏附的刷状缘不到10%，但有1-2个细菌黏附的刷状缘多于10%，判该样品为弱黏附型，否则判为不黏附型。黏附效果图如附
图1所示。2、全基因组扫描初步定位ETEC F4ac受体基因本发明首先选用覆盖19条染色体的来自美国肉畜中心(MARC)网站公开的151个微卫星标记，在申请人所构建的白色杜洛克X 二花脸资源家系200个F2代个体以及全部的Ftl与F1个体中进行全基因组扫描。具体如下2. 1微卫星标记PCR扩增条件微卫星标记聚合酶链式反应(PCR)反应体系为15μ 1，其中包含40ng基因组 DNA (脱氧核糖核酸)，0. 2mM dNTPs (合成DNA的四种脱氧核苷酸底物)，0. 2 μ M引物，1. 5mM Mg2+，IXPCR buffer (缓冲液)和 IU DNA 聚合酶(Taq 酶)。PCR 的扩增程序为 94. 0°C 4min ； 40 循环(94. O0C 30sec, 55-65°C 20sec, 72. 0°C 30sec) ；72. 0°C 5min。2. 2微卫星标记扩增产物电泳及分析PCR条件优化好之后，使用资源家系F1代个体基因组DNA进行微卫星多态性检测， 并根据微卫星引物荧光标记颜色以及片段大小等因素对微卫星进行优化组合以提高毛细管电泳效率。PCR扩增后产物首先用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，然后用凝胶成像系统进行凝胶成像检测PCR产物的质量并确定PCR产物上样稀释倍数，然后对PCR产物进行适量稀释，取1μ 1组合稀释产物，加入10 μ 1缓冲液(由购自美国ABI公司的Hi_Di 去离子甲酰胺与GeneScan -400HD ROX以100 1比例混合而成)，进行混合、振荡和离心后，上样于 ABI3130XL自动遗传分析仪(3130XL Genetic Analyzer，ABI公司，美国)进行毛细管电泳。 经美国ABI公司提供的公用的Data Collection Software V. 30收集PCR产物电泳检测后的原始荧光信号，采用美国ABI公司提供的公用的Genemapperf. 7读取微卫星片段的大小， 并校正错误数据后，将Excel格式的数据转换成CRIMAP (2. 4)软件要求的数据格式，再次检验所有个体的基因型。根据家系记载，确保所有个体的数据符合家系分离规律。然后利用公用的CRIMAP软件进行连锁分析，结果如图2所示。从图中可知，ETEC F4ac受体基因被初步定位于猪13号染色体(SSC13)的SW207与S0075之间，这个区域大约17cM。3、目的区域精细定位ETEC F4ac受体基因申请人:在ETEC F4ac受体位点初步定位的区域(SW207-S0075)及其两翼附近区域新增分子标记至51个(含33个微卫星和18个单核苷酸多态性标记)，各标记引物信息见表1。将这些标记在白色杜洛克X 二花脸资源家系群体755个F2代个体及全部Ftl与F1个体中进行基因分型。33个微卫星标记的检测方法与上述全基因组扫描中的微卫星标记检测方法相同。18个单核苷酸多态性标记(SNP)的检测方法采用SNaPshot方法进行，具体如下3. ISNP标记的PCR扩增条件在25 μ 1 的 PCR 反应体系中，包括 25ng 猪基因组 DNA，1. OmM MgCl2, IOOmM dNTP, 正反向引物各IOpmol，2单位Taq酶及IXPCR buffer (上海生物工程公司，中国)。扩增条件为94°C 4min ；94°C 30s, 56-65°C 30s, 72°C 30s，共；35 个循环；最后在 72°C延伸 lOmin。 PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。取3 μ 1 PCR产物，加入1 μ 1 ExoSAP-IT酶 (上海国药集团公司，中国)37°C孵育15min，然后80°C处理15min灭活酶。PCR产物纯化后稀释4倍备用。3. 2SNaPshot反应及产物纯化SNaPshot 反应体系为 SNaPshot 反应混合物(Multiplex Ready Reaction Μ χ)2μ 1 ；SNaPshot延伸引物0. 5μ 1(引物终浓度为0. 2ymol/L)；上述纯化稀释PCR产物 1. 5μ 1 ；去离子水 1μ 1。SNaPshot 循环参数为 96°C 10s，50°C 5s，60°C 30s，共 25 循环。取 5 μ 1 SNaPshot 反应产物加入 0. 57 μ 1 IOXbuffer 禾Π 0. 1 μ 1 CIP (SNaPshot 反应产物纯化酶)在37°C下孵育lh，然后75°C处理15min灭活酶达到产物纯化效果，_20°C保存备用。3. 3遗传分析仪电泳及判型电泳混合体系包括9· 25 μ 1 Hi-Di formamide (甲酰胺变性剂)；0. 5 μ 1上述经纯化后的 SNaPshot 反应产物；0. 25 μ 1 GeneScan 120 LIZ size standard (电泳分子内标)。体系混合后于95°C变性5min，然后立即置于冰上处理aiiin。离心上样。具体判型方法如附图3所示。表1用于ETEC F4ac受体基因精细定位的微卫星和SNP标记引物信息
权利要求
1.一种影响仔猪F4ac腹泻易感/抗性的核苷酸序列，其序列如SEQID N02，并且第 104660bp处为C或T ；或者第97!350bp处为C或T ；
2.一种影响仔猪F4ac腹泻易感/抗性的核苷酸序列，其序列如SEQID N02，并且第 94436bp处为A或C ；或者第97583bp处为A或G ；
3.一种影响仔猪F4ac腹泻易感/抗性的核苷酸序列，其序列如SEQID N02，并且第 98183bp处为A或G ；或者第84443bp处为C或T ；
4.一种影响仔猪F4ac腹泻易感/抗性的核苷酸序列，其序列如SEQID N02，并且第 84473bp处为A或G ；或者第61069bp处为C或T ；
5.一种影响仔猪F4ac腹泻易感/抗性的核苷酸序列，其序列如SEQID N02，并且第 61395bp处为C或T ；或者第8^69bp处为A或G ；
6.一种影响仔猪F4ac腹泻易感/抗性的核苷酸序列，其序列如SEQID N02，并且第 73825bp处为C或T ；或者第75000bp处为A或C ；
7.一种影响仔猪F4ac腹泻易感/抗性的核苷酸序列，其序列如SEQID N02，并且第 67131bp处为C或T ；或者第73106bp处为A或G ；
8.一种影响仔猪F4ac腹泻易感/抗性的核苷酸序列，其序列如SEQID N02，并且第 73359bp 处为 C 或 G。
9.权利要求1-8中任意一项所述的核苷酸序列在选育改良种猪抗腹泻病性状中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种影响仔猪F4ac腹泻易感/抗性的MUC13基因关键标记位点及其在种猪遗传改良中的应用，它是利用大规模白色杜洛克×二花脸资源群体和15个中外猪种的远缘群体，通过全基因组扫描连锁定位、目的区域高密度SNP多点连锁精细定位、断点重组分析、基于连锁不平衡的远缘群体关联性分析、最后锁定了编码ETEC F4ac受体的目的基因-MUC13基因，并分离克隆了MUC13基因。在MUC13基因中鉴别到15个关键性突变位点。这15个突变位点在来自5个省份核心群的144头纯种杜洛克、长白、大白仔猪中与ETEC F4ac体外黏附表型基本共分离，最强相关的标记判定抗性/易感个体的准确性达97％(P＝1.59×10-21)。本发明为种猪ETEC F4ac腹泻病的抗病育种提供了一种新方法。
文档编号C12N15/11GK102286480SQ20111024994
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月20日 优先权日2011年8月20日
发明者任军, 张志燕, 晏学明, 艾华水, 黄路生 申请人:江西农业大学