专利名称：荧光定量pcr检测新型甲型h1n1病毒试剂盒及非诊断检测方法
技术领域：
本发明涉及一种新型的甲型Hmi流感病毒的荧光定量PCR检测方法及检测引物和特异性探针。
背景技术：
自09年4月以来，包括墨西哥、美国和加拿大在内的许多国家发生了人感染甲型 Hmi流感病毒疫情，这是一种新的甲型流感病毒。随着感染甲型Hmi流感的人群不断的增加，疫情愈来愈严重，世界卫生组织已于09年6月将流感大流行警戒级别提升到6级，世界处在09年流感大流行的开端。甲型Hmi流感病毒属正黏液病毒科甲型流感病毒属的单股 RNA病毒。根据其外部糖蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(nneuraminidase， ΝΑ)的不同抗原特性可将甲型流感病毒分为多个亚型。HA和NA具有高度变异性，但对于该流感病毒其它片段相比又极其保守。因此，HA、NA基因片段成为检测流感病毒的重要考察对象。面对这突如其来的流感病毒，如何快速准确的检测已成为世界各国疾病预防控制中心最关心的问题。实时荧光定量法显然已经成为各国公认的检测标准。实时荧光定量RT-PCR(rRT-PCR)法检测新型甲型Hmi的方案是用一组寡核苷酸引物和双重标记的 TaqMan 探针，对呼吸道样本或体外培养的甲流感病毒进行定量检测鉴定。世界卫生组织较早公布了用实时定量RT-PCR来检测甲流感的操作步骤。其中， InfA引物和探针组合是通用于检测A型流感病毒，swInfA引物和探针组合是特异性检测所有甲型流感A型病毒，swHl引物和探针组合是特异检测猪Hl型流感病毒。但是，由于当时NCBI公布的相关序列有限，世界卫生组织所公布的引物和探针对此次暴发的新型甲型 HlNl流感病毒的检测特异性、灵敏度有限。本发明就是针对于目前设计并公布的引物及探针存在的灵敏度检测相对较低，检测费用较高进行改进。
发明内容
本发明提供一种对新型甲型Hmi流感病毒的荧光定量PCR检测方法，本发明的方法包括利用一对新的引物和探针组合对病毒样本进行实时荧光定量监测。本发明的检测方法检测特异性好，灵敏度高，尤其适用于此次暴发的新型甲型 Hmi流感，与禽流感、猪流感以及普通季节性流感无交叉反应。本发明还在于设计且仅有一对引物和探针组合，由此降低检测成本，实现了快速准确检测Hmi流感病毒。本发明提供一种检测新型甲型Hmi流感病毒的引物和探针的方法，该方法包括 (1)筛选新型甲型Hmi流感HA全长序列，进行同源性比对，在其保守区设计引物并提交 GENEBANK验证引物的特异性；( 根据PCR扩增区域内的核苷酸序列设计特异性探针，并提交GENEBANK验证探针的特异性；(3)待检测样本进行荧光定量PCR实时定量分析。
本发明还提供一种检测新型甲型Hmi病毒试剂盒，其中，包括引物和探针，引物和探针序列见表1。在本发明上述方法中，所筛选的新型甲型Hmi流感可以是NCBI公布的所有新型的甲型Hmi流感HA全长序列。另外，本发明的方法中，可以利用DNASTAR软件进行序列的同源性比对。比对结果见
图1。图中阴影部分为HA基因序列保守区。在本发明引物和探针设计中，首先在比对后序列保守区设计引物和探针，根据引物设计原理，在保守区617bp-760bp之间设计上游引物YHAF和下游引物YHAR。探针 YHAProbe在上游弓|物YHAF和下游弓|物YHAR之间设计。引物YHAF中第M位含有兼并碱基 R，探针YHAProbe中第1位含有兼并碱基W，第30位含有兼并碱基K。探针在合成时5'端连接FAM荧光基团3'端连接BHQl非荧光基团。引物和探针组合的特异性增强。序列见表 1。表1引物和探针序列
权利要求
1. 一种新型甲型Hmi流感病毒的荧光定量PCR非诊断检测方法，该方法包括设计了一对引物和探针对待检样本进行实时定量监测，引物和探针序列如下
2.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述探针连接的荧光基团可为FAM-BHQ1， FAM-TAMARA 等。
3.如权利要求1所述的检测方法，其中，该方法包括步骤1)待检测样本核酸的提取；2)RT-PCR反应，配制一定组分浓度的25 μ L PCR反应体系。
4.如权利要求3中所述的检测方法，其中，所述RT-PCR反应可使用的仪器包括ABI实时PCR系统、BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪。
5.一种检测新型甲型Hmi病毒试剂盒，其中，包括引物和探针，引物和探针序列如下
6.如权利要求5中所述的试剂盒，其中，能与新型甲型Hmi流感HA全长序列特异性结合并扩增的等同引物，其位点区域的覆盖率不能超过50%，其同源性不能超过70%。
7.如权利要求5中所述的试剂盒，其中，能与新型甲型Hmi流感HA全长序列特异性结合并扩增的等同探针，其位点区域的覆盖率不能超过50%，其同源性不能超过70%。
全文摘要
本发明公开了一种检测新型甲型流感病毒荧光定量PCR试剂盒及非诊断检测方法，该试剂盒包括特定序列的引物和探针，该引物和探针检测特异性好，灵敏度高，尤其适用于此次暴发的甲型H1N1流感，与禽流感、猪流感以及普通季节性流感无交叉反应，而且成本也大大降低。
文档编号C12Q1/70GK102296127SQ20111024928
公开日2011年12月28日 申请日期2011年8月26日 优先权日2011年8月26日
发明者姚李四, 孙肖红, 杨鹏飞, 燕清丽, 王静, 胡孔新 申请人:中国检验检疫科学研究院