专利名称：转基因玉米品系bt176 pcr-dhplc检测引物及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种转基因产品的检测，特别是涉及一种转基因玉米品系的PCR-DHPLC检测弓I物及检测方法。
背景技术：
目前对转基因玉米的检测方法主要采用常规PCR、实时荧光PCR、PCR-基因芯片等检测方法。传统的常规PCR检测方法在平台扩展方面具有一定的局限性，随着待检目标的增加，需要对体系中的每套引物的用量及比例重新进行优化，并且兼顾扩增效率等因素，工作量较大；另一方面，通常采用的凝胶电泳分析扩增产物的方法，区分效率不高，检测结果不理想。实时荧光PCR虽然在检测灵敏度等方面较多重常规PCR检测方法有优势，但是由于目前仪器自身及荧光染料研制的限制，仅能同时提供互不干扰的4个荧光通道，也限制了该技术在检测通量扩展。PCR-基因芯片检测方法，操作步骤繁琐，并不适合大规模的高通量检测。变性高效液相色谱技术(Denaturing High-performance Liquid Chromatography,DHPLC)是一种简单、快速、非凝胶的核酸分析方法，具有灵敏度高、扩展性强、分辨率好等优点。该方法在50°C条件下分析样品，样品峰的洗脱只由碱基对的数量决定洗脱顺序，当过柱的乙腈浓度提高，核酸片段会根据分子量从小到大的顺序被洗脱出来。通过得到的洗脱峰与marker比较确定分子量大小，判定是否含有目标检测基因。目前，尚没有转基因玉米品系BT176的PCR结合DHPLC的检测技术(PCR-DHPLC)。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于转基因玉米品系BT176的PCR-DHPLC检测的引物。本发明的另一目的是提供一种基于上述引物的扩展性能好、灵敏度和分辨率高的转基因玉米品系BT176的PCR-DHPLC检测方法。为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案本发明公开了用于转基因玉米品系BT176的PCR-DHPLC检测的引物，所述引物的上游引物含有Seq ID No. I所示序列，下游引物含有Seq ID No. 2所示序列；Seq ID No. I :5’ -TCAAGCACGGGAACTGGC-3，Seq ID No. 2 :5’ -TGGGCGTGGTATCGACTTTATA-3’。需要指出的是，上述Seq ID No. I和Seq ID No. 2是与转基因玉米品系BT176的检测靶标序列互补配对的特异序列，具有很强的特异识别性。进一步的，所述上游引物的5’端还包括Seq ID No. 3所示序列，所述下游引物的5’端还包括Seq ID No. 4所示序列；Seq ID No. 3 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACT-3’Seq ID No. 4 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGA-3，。需要指出的是，上述Seq ID No. 3和Seq ID No. 4是分别在上游引物和下游引物的5 ’端添加的与检测靶标序列无关的一段序列，该序列可以是与检测靶标序列同源性很远的其它物种的序列，也可以是一段随机生成的序列。该序列可以用于调控PCR扩增产物的大小，以便于PCR扩增产物的进一步分析。本发明中，优选的，所述上游引物具有Seq ID No. 5所示序列，下游引物具有SeqID No. 6所示序列； Seq ID No. 5 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACTTCAAGCACGGGAACTGGC-3，Seq ID No. 6 :5’ -CTCAGCGGCGGAGCTACAGATGGGCGTGGTATCGACTTTATA-3’。需要说明的是，所述Seq ID No. 5和Seq ID No. 6序列是由上述Seq ID No. I和Seq ID No. 2序列分别在其5’端添加调控序列而成，尽管上述已经说明Seq ID No. 3和SeqID No. 4所示调控序列可以是随机生成的序列，但是，并不是任意序列都可以添加，具体到本发明中，需要考虑调控序列与Seq ID No. I和Seq ID No. 2所示序列的理化性质的统一协调，并且还需要考虑添加调控序列后的Seq ID No. 3和Seq ID No. 4所示序列作为检测引物的整体性能。本发明还公开了一种用于转基因玉米品系BT176的PCR-DHPLC检测方法，所述检测方法包括采用上述引物，以玉米DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行变性高效液相色谱分析。进一步的,所述检测方法还包括以marker为参考标准进行变性高效液相色谱分析，将PCR扩增产物的变性高效液相色谱分析结果与marker的变性高效液相色谱分析结果进行比对。优选的上述检测方法包括如下步骤(A)采用所述引物，以玉米DNA为模板，进行PCR扩增；(B)以步骤(A)的PCR扩增产物为样品进行DHPLC分析，同时以marker为参考标准进行DHPLC分析；(C)将步骤⑶中样品的DHPLC分析结果与marker的DHPLC分析结果进行比较，确定样品的分子量大小，从而判断是否含有检测的靶标序列。由于采用以上技术方案，本发明的有益效果在于本发明的转基因玉米品系BT176检测引物具有较强的特异性，能够用于后续的多重PCR扩增以及DHPLC分析。本发明针对传统的电泳分析PCR扩增结果不理想的问题，将PCR与DHPLC相结合，提供了一种操作简便、扩展性能好、灵敏度和分辨率高的转基因玉米品系BT176检测方法。利用DHPLC对PCR扩增产物进行分析，对不同大小的PCR产物片段区分率可达数个碱基，甚至能够区分出I个碱基大小差异的片段。本发明的引物和检测方法为转基因玉米品系BT176检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的检测方法，特别适合用于口岸检验检疫等部门使用。
图为本发明实施例中DHPLC分析的部分结果；图中自上而下的曲线分别标记为M、1-18，]\1为11^11 51'、1为非转基因玉米0嫩、2为玉米皿例88017 DNA、3为玉米MIR604 DNA、4为玉米Btl76 DNA、5为玉米Btll DNA、6为玉米M0N810 DNA、7为玉米GA21 DNA、8为玉米 NK603 DNA、9 为玉米 M0N863DNA、10 为玉米 M0N89034 DNA、11 为玉米 T25 DNA、12 为大豆A2704-12DNA、13 为大豆 A5547-12 DNA、14 为油菜 DNA、15 为棉花 LLcotton25 DNA、16 为非转基因棉花DNA、17为Bt63 DNA、18为土豆EH92-527-1 DNA ；marker的各峰值从左至右依次为 80bp、102bp、174bp、257bp、267bp、296bp、434bp、458bp、587bp。
具体实施例方式本发明公布了用于转基因玉米品系BT176的PCR-DHPLC检测的引物，该引物针对转基因玉米BT176品系的特异序列进行设计。进一步的，还在引物的上游和下游分别添加了一段与检测靶标序列无关或者同源性很远的调控序列，用于实现对扩增产物的片段大小的调控。需要指出的是，在上述针对转基因玉米BT176品系的特异序列设计的检测引物已经保证了检测的特异性和稳定性，可以实现对转基因玉米品系BT176的检测分析，调控序列的加入只是为了获得更优异的检测效果，因此，本发明优选的，用于转基因玉米品系BT176的PCR结合DHPLC技术检测的引物是加入了调控序列的引物，分别具有Seq ID No. 5至Seq ID No. 6所示序列。
本发明还公开了一种用于转基因玉米品系BT176的PCR-DHPLC检测方法，所述检测方法包括采用所述引物，以玉米DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行变性高效液相色谱分析。进一步的，所述检测方法还包括以marker为参考标准进行变性高效液相色谱分析，将PCR扩增产物的变性高效液相色谱分析结果与marker的变性高效液相色谱分析结果进行比对，根据比对结果判断PCR扩增产物的大小，从而判断是否含有检测的靶标序列。本发明中，所述引物扩增产物的DHPLC洗脱峰为256bp。下面通过具体实验例并结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实验例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例I DNA提取 采用CTAB法提取样品DNA，具体如下a)称取样品5g，在研钵中加入液氮研磨至样品呈O. 5mm左右大小的粉末；b)称取300mg磨碎的样品，迅速转入2mL离心管中，加65°C预热的CTAB提取液700 μ L，混匀，放入65°C水浴锅中水浴30min ；c)力口 5 μ L RNase (10mg/mL)，37°C 水浴 30min ；d)加入等体积Tris饱和酹,充分混勻，12000r/min离心15min ；e)取上清,加入等体积的氯仿/异戍醇(24 I)混勻，12000r/min离心15min ；f)取上清,加入等体积的氯仿/异戍醇(24 I)混勻，12000r/min离心15min ；g)加入等体积预冷的异丙醇，轻轻摇晃，置于_20°C冰箱静置30min，12000r/min离心15min ；h)弃上清,加70%乙醇500 μ L, 12000r/min离心3min,去上清,重复2次；i)得到DNA沉淀，用冷冻干燥仪进行干燥，加入50 μ L 100 μ L TE或无菌去离子水，充分溶解后，测量DNA的纯度和浓度后置于_20°C冰箱中保存。 实施例2 DNA浓度测定对提取的样品DNA进行浓度和纯度测定；采用紫外分光光度计测定260nm和280nm处吸收值，分别计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下DNA 纯度=0D260/0D280DNA 浓度=50 X 0D260mg/mL
DNA的纯度比值在I. 7 L 9之间，浓度大于IOng/μ L。实施例3 PCR扩增根据转基因玉米ΒΤ176品系设计特异性检测引物的结合位点，并在特异性检测引物结合位点的5’端添加调控序列，合成含有调控序列的检测引物(表1)，采用添加调控序列的上/下游引物进行PCR扩增，样品设置包括非转基因玉米DNA、玉米品系Μ0Ν88017的DNA、玉米品系MIR604的DNA、玉米品系Bt176的DNA、玉米品系Btll的DNA、玉米品系Μ0Ν810的DNA、玉米品系GA21的DNA、玉米品系ΝΚ603的DNA、玉米品系Μ0Ν863的DNA、 玉米品系Μ0Ν89034的DNA、玉米品系Τ25的DNA、大豆品系Α2704-12的DNA、大豆品系Α5547-12的DNA、非转基因油菜的DNA、LLcotton25品系的DNA、非转基因棉花DNA、Bt63品系的DNA、土豆品系 EH92-527-1 的 DNA。表I转基因玉米品系BT176检测引物结合位点及引物
Seq ID
名称序列5’-3’No.
弓 I 物对 I 上/下游弓 I TCAAGCACGGGAACTGGCI
物特异性结合位点 TGGGCGTGGTATCGACTTTATA2
上游引物调控序歹丨J CGTGGCCTCGCGATCTGACT3
下游引物调控序列 CTCAGCGGCGGAGCTACAGA4
添力口调控序歹'J 的弓 I CGTGGCCTCGCGATCTGACTTCAAGCACGGGAACTGGC5
物对 I 上/下游引物 CTCAGCGGCGGAGCTACAGATGGGCGTGGTATCGACTTTATA 6PCR反应体系总体积为50 μ L，各成分分别为多重PCR反应混合液Multiplex PCRMix (TaKaRa) 25 μ L，10 μ mol/L 引物各 I μ L，DNA 2 μ L, 5U/ μ L Taq 酶 O. 25 μ L，用灭菌双蒸水补足为50 μ L0PCR 反应条件94 °C 变性 Imin ;然后进入 35 个循环，94°C 30s，57 °C lmin，72°CImin ;循环结束后72°C延伸lOmin。实施例4 DHPLC检测将PCR产物置于DHPLC的自动进样平台上；打开DHPLC控制软件Navigator，在检测方法中选择Multiplex，即多片段分析，同时设定检测上限为600bp，下限为70bp ;运行两个blank，即空针，平衡色谱柱；运行一个marker，用于参考对照，检测样品的核酸片段大小；依次对待测样本进行分析，部分结果见图I。结果判断观察DHPLC得到的洗脱峰，通过与marker比对及WAVE 4500自动分析确定洗脱峰位置的DNA片段大小，据此进行判断。对含有转基因玉米BT176品系成分的样本，其分析结果显示，该样本含有256bp的洗脱峰；其它转基因品系玉米、非转基因玉米和其它作为阴性对照的不是玉米的转基因的样品均没有洗脱峰。以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护 范围。
权利要求
1.用于转基因玉米品系BT176PCR-DHPLC检测的引物，其特征在于所述引物的上游引物含有Seq ID No. I所示序列,下游引物含有Seq ID No. 2所示序列；Seq ID No.I :5，-TCAAGCACGGGAACTGGC-3，Seq ID No.2 :5’ -TGGGCGTGGTATCGACTTTATA-3’。
2.根据权利要求I所述的引物，其特征在于所述上游引物的5’端还包括SeqID No. 3所示序列，所述下游引物的5’端还包括Seq ID No. 4所示序列；Seq ID No.3 :5， -CGTGGCCTCGCGATCTGACT-3’Seq ID No. 4 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGA-3，。
3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于所述上游引物具有SeqID No. 5所示序列，下游引物具有Seq ID No. 6所示序列；Seq ID No. 5 :5’ -CGTGGCCTCGCGATCTGACTTCAAGCACGGGAACTGGC-3’Seq ID No. 6 :5’ -CTCAGCGGCGGAGCTACAGATGGGCGTGGTATCGACTTTATA-3’。
4.一种用于转基因玉米品系BT176的PCR-DHPLC检测方法，其特征在于所述检测方法包括采用权利要求1-3任一项所述的引物，以玉米DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行变性高效液相色谱分析。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于所述检测方法还包括以marker为参考标准进行变性高效液相色谱分析，将PCR扩增产物的变性高效液相色谱分析结果与marker的变性高效液相色谱分析结果进行比对。
全文摘要
本发明公开了一种转基因玉米品系BT176的PCR-DHPLC检测引物及检测方法，所述引物具有较强的特异性，能够用于PCR扩增以及DHPLC分析。所述检测方法提供了一种操作简便、扩展性能好、灵敏度高的转基因玉米品系BT176检测方法。利用DHPLC对PCR扩增产物进行分析，其片段大小区分率可达数个碱基，分辨率高。本发明的引物和检测方法为转基因玉米品系BT176检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的检测方法，特别适合用于口岸检验检疫等部门使用。
文档编号C12Q1/68GK102952864SQ20111024903
公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月26日 优先权日2011年8月26日
发明者章桂明, 向才玉, 凌杏园, 潘广, 程颖慧, 康林, 李鹤遥 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心