转基因玉米的多重pcr筛查检测引物及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种转基因玉米的多重PCR筛查检测引物及检测方法，所述引物具有较强的特异性，能够用于多重PCR筛查检测分析。所述检测方法提供了一种操作简便、扩展性能好、灵敏度高的转基因玉米筛查检测方法，实现了转基因玉米的多靶标检测。利用毛细管电泳对PCR扩增产物进行分析，其片段大小区分率可达数个碱基，分辨率高。本发明的引物和检测方法为转基因玉米多靶标检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的高通量检测方法。本实验建立的多重PCR反应体系不仅可以检测进口转基因玉米外源基因成分，而且还能扩增到其他转基因作物筛查检测。
【专利说明】转基因玉米的多重PCR筛查检测引物及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及一种可同时检测两种和六种外源基因的多重PCR 筛查检测方法。
【背景技术】
[0002] 目前关于进口转基因玉米及其产品的筛查检测技术，主要集中在单一基因 PCR方 法，尚无关于检测进口转基因玉米及其产品的多重PCR筛查检测策略研究及相关筛查检测 技术。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的主要是提供一种准确、快速、简便的多重PCR快速筛查多个目的基 因元件的检测方法。
[0004] 本发明通过下述技术方案实现： 转基因玉米的多重PCR筛查检测引物，包括以下引物序列： 其中，二重PCR引物序列如下： P-CaMV 35S-F :5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3' ； P-CaMV 35S-R :5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3' ； T-NOS-F :5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3' ； T-NOS-R :5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'。
[0005] 六重PCR引物序列如下： P-ractl-F :5，-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3，； P-ractl-R :5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT-3' ； T-NOS-F :5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3' ； T-NOS-R :5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3' ； P-CaMV 35S-F :5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3' ； P-CaMV 35S-R :5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3' ； bar-F :5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3' ； bar-R :5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3' ； pat-F :5'-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3' ； pat-R :5'-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3' ； PMI-F :5'-TTCTGAAATCGGTTTTGCCAA-3' ； PMI-R :5,-TCAGCAATAGCGGGGAGAA-3,。
[0006] 上述二重PCR检测方法如下： (al)合成以下引物： P-CaMV 35S-F :5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3' ； P-CaMV 35S-R :5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3' ； T-NOS-F :5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3' ； T-NOS-R :5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3' ； (a2)制备待测玉米的DNA稀释液； (a3)配制PCR反应体系； (a4)进行PCR反应； (a5)取PCR反应产物进行毛细管电泳。
[0007] 进一步地，步骤（a3)中所述的配制PCR反应体系总体积为25 μ L ;具体含以下 组分：PCR Master Mix (2Χ)、DNA稀释液、步骤（al)中的各引物、ddH20;其中PCR Master Mix (2X)的加入量为12. 5 μ L，DNA稀释液加入量为2.0 μ L，各引物加入后的终浓度均为 〇· 2 μ Μ，采用 CldH2O 补足 25 μ L。
[0008] 再进一步地，所述PCR反应条件为：94°C变性5min，然后进入35个循环；94°C 30s， 58°C 30s，72°C 30s ;循环结束后 72°C延伸 5min。
[0009] 上述六重PCR检测方法如下： (bl)合成以下引物： P-ractl-F :5，-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3，； P-ractl-R ：5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT -3'； T-NOS-F :5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3' ； T-NOS-R :5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3' ； P-CaMV 35S-F :5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3' ； P-CaMV 35S-R :5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3' ； bar-F :5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3' ； bar-R :5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3' ； pat-F :5'-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3' ； pat-R :5'-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3' ； PMI-F :5'-TTCTGAAATCGGTTTTGCCAA-3' ； PMI-R :5,-TCAGCAATAGCGGGGAGAA-3，； (b2)制备待测玉米的DNA稀释液； (b3)配制PCR反应体系； (b4)进行PCR反应； (b5)取PCR反应产物进行毛细管电泳。
[0010] 进一步地，步骤（b3)中所述的配制PCR反应体系总体积为25 μ L ;具体含以下组 分：PCR Master Mix (2X)、DNA 稀释液、步骤（bl)中的各引物、ddH20;其中 PCR Master Mix (2X)的加入量为12. 5 μ L，DNA稀释液加入量为2.0 μ L，P-ractl引物加入后的终浓度为 0.2 μ M，其他引物加入后的终浓度为0. 1 μ M，采用CldH2O补足25 μ L。
[0011] 再进一步地，所述PCR反应条件为：94°C变性5min，然后进入35个循环；94°C30s， 56°C 30s，72°C 30s ;循环结束后 72°C延伸 5min。
[0012] 本发明具有以下优点及有益效果： 本发明在每个转基因玉米材料及产品至少检测出一次的筛查检测时，采用本发明设定 的T-NOS和P-CaMV 35S两个基因，并通过对引物浓度和退火温度优化建立了检测转基因玉 米的二重PCR技术体系。
[0013] 本发明在每个转基因玉米材料及产品至少检测出两次的筛查检测时，采用本发明 设定的P-ractl、T-NOS、P-CaMV 35S、bar、pat和PMI等6个基因，并通过对引物浓度和退 火温度优化建立了检测转基因玉米的六重PCR技术体系。
[0014] 本发明仅一次PCR反应可快速、准确检测出当前进口转基因玉米至少一次，且成 本低、准确率高，假阳性率低，六重PCR技术体系也能有效控制假阴性的出现。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图 1 为本发明中 P-ractl (A)，T-N0S (B)，P-CaMV 35S (C)，bar/pat (D)，PMI (E) 单基因 PCR扩增结果。
[0016] 图2为本发明中CaMV35s，T-NOS二重PCR引物梯度扩增结果（A)，温度梯度扩增结 果（B)，已知样品验证扩增结果（C)。
[0017] 图 3 为本发明中 p-ractl，T-NOS，P-CaMV 35S，bar，pat，PMI 六重 PCR 引物梯度扩 增结果（A)，温度梯度扩增结果（B)，浓度梯度扩增结果（C)，已知样品验证扩增结果（D)。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的实施方式并不限于此。 实施例
[0019] 转基因玉米的多重PCR筛查检测方法，具体如下： 二重PCR筛查检测方法如下： (al)合成以下引物： P-CaMV 35S-F :5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3' ； P-CaMV 35S-R :5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3' ； T-NOS-F :5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3' ； T-NOS-R :5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3' ； (a2)制备待测玉米的DNA稀释液； (a3)配制PCR反应体系； (a4)进行PCR反应； (a5)取PCR反应产物进行毛细管电泳。
[0020] 其中，步骤（a3)中所述的配制PCR反应体系总体积为25 μ L ;具体含以下组分：PCR Master Mix (2X)、DNA 稀释液、步骤（al)中的各引物、ddH20;其中 PCR Master Mix (2Χ)的 加入量为12. 5 μ L，DNA稀释液加入量为2. 0 μ L，各引物加入后的终浓度均为0. 2 μ M，采用 CldH2O补足25 μ L。所述PCR反应条件为：94°C变性5min，然后进入35个循环；94°C 30s， 58°C 30s，72°C 30s ;循环结束后 72°C延伸 5min。
[0021] 六重PCR筛查检测方法如下： (bl)合成以下引物： P-ractl-F :5，-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3，； P-ractl-R ：5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT -3'； T-NOS-F :5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3' ； T-NOS-R :5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3' ； P-CaMV 35S-F :5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3' ； P-CaMV 35S-R :5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3' ； bar-F :5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3' ； bar-R :5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3' ； pat-F :5'-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3' ； pat-R :5'-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3' ； PMI-F :5'-TTCTGAAATCGGTTTTGCCAA-3' ； PMI-R :5,-TCAGCAATAGCGGGGAGAA-3，； (b2)制备待测玉米的DNA稀释液； (b3)配制PCR反应体系； (b4)进行PCR反应； (b5)取PCR反应产物进行毛细管电泳。
[0022] 其中，步骤（b3)中所述的配制PCR反应体系总体积为25 μ L ;具体含以下组分：PCR Master Mix (2X)、DNA 稀释液、步骤（bl)中的各引物、ddH20;其中 PCR Master Mix (2Χ)的 加入量为12. 5 μ L，DNA稀释液加入量为2. 0 μ L，P-ractl引物加入后的终浓度为0. 2 μ M， 其他引物加入后的终浓度为〇. 1 μ Μ，采用CldH2O补足25 μ L。所述PCR反应条件为：94°C变 性5min，然后进入35个循环；94°C 30s，56°C 30s，72°C 30s ;循环结束后72°C延伸5min。
[0023] 为了验证本发明的筛查检测效果以及相应的参数选取的真实性，对各步骤进行具 体的验证试验，其具体情况如下： (1) 扩增检测引物的合成： 表1引物序列信息表
【权利要求】
1. 转基因玉米的多重PCR筛查检测引物，其特征在于，包括以下引物序列： 二重PCR引物序列： P-CaMV 35S-F :5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3' ； P-CaMV 35S-R :5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3' ； T-NOS-F :5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3' ； T-NOS-R :5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'。
2. 转基因玉米的多重PCR筛查检测引物，其特征在于，包括以下引物序列： 六重PCR引物序列： P-ractl-F ：5'-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3'； P-ractl-R :5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT-3' ； T-NOS-F :5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3' ； T-NOS-R :5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3' ； P-CaMV 35S-F :5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3' ； P-CaMV 35S-R :5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3' ； bar-F :5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3' ； bar-R :5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3' ； pat-F :5'-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3' ； pat-R :5'-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3' ； PMI-F :5'-TTCTGAAATCGGTTTTGCCAA-3' ； PMI-R :5,-TCAGCAATAGCGGGGAGAA-3,。
3. 转基因玉米的多重PCR筛查检测方法，其特征在于，包括以下步骤：二重PCR检测方 法： (al)合成以下引物： P-CaMV 35S-F :5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3' ； P-CaMV 35S-R :5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3' ； T-NOS-F :5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3' ； T-NOS-R :5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3' ； (a2)制备待测玉米的DNA稀释液； (a3)配制PCR反应体系； (a4)进行PCR反应； (a5)取PCR反应产物进行毛细管电泳。
4. 根据权利要求3所述转基因玉米的多重PCR筛查检测方法，其特征在于，步骤（a3) 中所述的配制PCR反应体系总体积为25 ii L ;具体含以下组分：PCR Master Mix (2X)、DNA 稀释液、步骤（al)中的各引物、ddH20;其中PCR Master Mix (2X)的加入量为12.5 iiL，DNA 稀释液加入量为2. 0 y L，各引物加入后的终浓度均为0. 2 y M，采用ddH20补足25 y L。
5. 根据权利要求4所述转基因玉米的多重PCR筛查检测方法，其特征在于，所述PCR反 应条件为：94°C变性5min，然后进入35个循环；94°C 30s，58°C 30s，72°C 30s ;循环结束后 72°C 延伸 5min。
6. 转基因玉米的多重PCR筛查检测方法，其特征在于，六重PCR检测方法： (bl)合成以下引物： P-ractl-F ：5'-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3'； P-ractl-R :5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT-3' ； T-NOS-F :5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3' ； T-NOS-R :5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3' ； P-CaMV 35S-F :5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3' ； P-CaMV 35S-R :5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3' ； bar-F :5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3' ； bar-R :5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3' ； pat-F :5'-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3' ； pat-R :5'-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3' ； PMI-F ：5'-TTCTGAAATCGGTTTTGCCAA-3,； PMI-R :5,-TCAGCAATAGCGGGGAGAA-3，； (b2)制备待测玉米的DNA稀释液； (b3)配制PCR反应体系； (b4)进行PCR反应； (b5)取PCR反应产物进行毛细管电泳。
7. 根据权利要求6所述转基因玉米的多重PCR筛查检测方法，其特征在于，步骤（b3) 中所述的配制PCR反应体系总体积为25 ii L ;具体含以下组分：PCR Master Mix (2X)、DNA 稀释液、步骤（bl)中的各引物、ddH20;其中PCR Master Mix (2X)的加入量为12. 5iiL，DNA 稀释液加入量为2. 0 ii L，P-ractl引物加入后的终浓度为0. 2 ii M，其他引物加入后的终浓 度为〇? 1 U M，采用ddH20补足25 ii L。
8. 根据权利要求7所述的转基因玉米的多重PCR筛查检测方法，其特征在于，所述PCR 反应条件为：94°C变性5min，然后进入35个循环；94°C 30s，56°C 30s，72°C 30s ;循环结束 后72°C延伸5min。
【文档编号】C12N15/11GK104404161SQ201410756727
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月11日 优先权日:2014年12月11日
【发明者】尹全, 宋君, 刘勇, 雷绍荣, 郭灵安, 王东, 张富丽, 刘文娟, 常丽娟 申请人:四川省农业科学院分析测试中心