专利名称：：一种用于转基因玉米检测的标准分子对照物及其制备方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学
技术领域：
，涉及转基因作物检测中必须的对照物质标准分子及其制备方法，具体说是一种制备转基因玉米中外源基因特异性片段标准分子对照物的方法。背景材料转基因产品越来越进入人们的生活。2006年全世界转基因作物种植面积为10200万公顷，与2005年转基因作物9000万公顷相比增长了13%，从1996年到2006年十年间转基因作物总的种植面积增加了60倍。目前，世界各国已进行田间试验的转基因作物超过5000种，批准商品化的转基因作物有160多种，包括玉米、大豆、油菜、番茄、马铃薯、甜椒、西葫芦、木瓜、甜菜、香石竹、矮牵牛、亚麻、烟草、西瓜、菊苣等。我国转基因生物研究始于20世纪80年代初期，主要是转基因抗虫棉。近年来，政府不断加大对生物技术研究的支持力度，积极促进农业生物技术的研究与产业化开发。转基因作物安全性主要集中在转基因作物释放的环境安全性和由转基因作物生产出的食品的安全性上。包括对人和动物健康的风险、对生态环境与农业的风险、对非目标生物的风险。针对第一种风险，1993年，联合国经济发展与合作组织(OECO)提出了食品安全性评估的"实质等同性"原则。如果转基因作物生产的产品与传统产品具有实质等同性，则可以认为是安全的。最早提出对转基因食品进行标识管理的是欧盟，1998年，欧盟在世界上签署第一个法案，要求对转基因产品进行标签说明；1999年，要求出口到欧盟的非转基因产品不得含有1%的转基因产品污染；2002年，欧盟将标识的最低限量降低到0.9%。日本、澳大利亚、新西兰对转基因成分的最低含量做了不同规定，域值从1_5%不等。我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管理三个配套管理办法，确定了第一批实施标识管理的农业转基因生物目录，并于2002年3月20日起正式实施。转基因作物检测方法主要基于核酸水平的PCR检测和基于蛋白质水平的检测。核酸水平检测分为定性和定量检测，蛋白质水平检测包括酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫试纸条法等。目前最常用的检测方法是定性PCR检测。通过对样品中可能含有的外源基因进行扩增，再利用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。如果电泳结果含有特异条带，说明样品中含有转基因成分；反之则没有。在进行定性PCR检测时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照，以确保检测过程的有效性和检测结果的可靠性。阴性对照是指用非转基因作物中提取的DNA作为PCR反应体系的模板；阳性对照是指用特定的转基因作物中提取的DNA作为PCR反应体系的模板；空白对照指用无菌重蒸水作为PCR反应体系的模板。由于转基因作物存在生物安全性的问题，所以有些转基因作物的阳性样品是很难得到的。为了满足检验检疫工作需要，欧盟委员会直属的联合研究中心(JRC)下属的两个研究所——健康及消费者保护研究所(IHCP)和标准物质及计量研究所(IRMM)在联合研制转基因产品检测标准物质，目前只制备出几种转基因作物标准样品，包括转基因大豆RoundReadySoybean、转基因玉米btll，btl76，mon810，event1507、转基因棉花event281-24_236x3006-210-23和转基因甜菜eventH7-l，含量分别为0%、0.1%、0.5%、1%、2%和5%。而全世界已有近百种商品化转基因品种，现有的标准物质与快速增长的转基因作物相比，根本无法满足检测的需要。综上所述，种类少、不易获得是转基因阳性材料存在的重要问题，严重影响着转基因检测工作的进行。由于各种限制，国内的检验检疫机构很难获得阳性样品，而且国际上有证标准物质的价格也一直居高不下，这些都成为了实际检侧工作中很重要的制约因素。为了解决这个问题，国内各科研单位也做了大量研究工作，但是都不能避开转基因生物的基因漂移的问题。目前，以质粒作为阳性对照在国际转基因检测中的得到公认。例如在英国FAPAS分析实验室能力验证测试中心组织的国际能力验证(转基因检测)中，网站的提交信息选项中明确表示质粒可以作为阳性材料使用。在国际期刊上发表的文章中，很多阳性对照也使用质粒。
发明内容本发明通过PCR方法扩增得到转基因作物外源基因的特异性片段，经重叠PCR将外源基因的特异性片段拼接在一起，经过克隆、建立文库，那么就可以将插入这些特异性片段的质粒作为检测过程中的阳性对照。这样就为解决阳性样品缺乏问题提供一条有效途径，有效地保障检测工作的进行。而且，以建立文库的方式获得阳性材料，容易保存、扩繁。本发明一个目的在于提供一种用于转基因玉米检测的标准分子对照物。本发明另一个目的在于提供一套用于制备转基因玉米标准分子对照物引物。本发明再一个目的在于提供一种筛选制备标准分子特异性引物的方法。本发明还一个目的在于提供一种用于制备转基因玉米标准分子对照物的方法。即设计特异性引物制备转基因玉米Mon810、Mon863、BTll、BT176中外源基因特异性片段标准分子对照物。为实现上述目的本发明提供如下的技术方案—种转基因玉米标准分子对照物，包括转基因品系M0N810、M0N863、BTll、BT176转化事件特异性序列及内源基因zSSIIb特异片段，其先后顺序为zSSIIb+M0N810+M0N863+BT11+BT176。本发明所述转基因玉米标准分子对照物，其中zSSIIb+Mon810+Mon863+BTll+BT176标准分子的特异性引物序列如下引物名称引物序列(5'-3')长度bpTm。CGC%MaiZss-ol:CGGTGGATGCTAAGGCTGATG2158.957.1MaiZss-o2:CACACTTGAAAGGGCCAGG1958.557.9Mai810-o3GCCCTTTCAAGTGTGCCCA1961.457.9Mai810-o4TGAGTGCGCAAGCAAATTCGG2162.752.4<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本发明设计用于制备转基因玉米对照物质标准分子引物的方法以将zSSIIb及转化事件特异性序列特异性引物为基础，在zSSIIb基因反向引物的5'端加上转化事件特异性正向引物的反向互补序列；在转化事件反向引物的5'端加上zSSIIb基因反向引物的反向互补序列；在引物设计软件primerprimer5.0中调节引物Tm值在55-60之间。本发明所述的转化事件特异性引物序列指的是农业部发布的转基因作物检测标准中的引物序列情况，详细内容见附件1。本发明进一步公开了用于制备转基因玉米标准分子对照物的PCR反应条件，其特征在于第一轮反应以非转基因玉米及转基因玉米品系M0N810、M0N863、BTll、BT176基因组DNA为模板，用检测标准中引物序列扩增；反应体系为总体积为50iiL，其中2倍pfUmix缓冲液25iiL，上下游引物(10mM)各0.5yL，模板(50ng組)1yL，用(1朋20补足至50iiL。反应程序为95。C，3min;30个循环(94。C，30sec;60-55°C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4。C短期保存。产物记为PPzssb—"PP腦。—"PPM863—"PPB11—"PP罷—!。第二轮反应以第一轮PCR扩增产物PPzssIIb—pPP誦—pPPM863—i、PPB11—i、PP罷—!为模板，以权力说明书2中对应引物，进行PCR扩增；反应体系为总体积为50iiL，其中2倍pfUmix缓冲液25iiL，上下游引物(10mM)各0.5yL，用ddH20补足至50iiL。反应程序为95。C，3min;30个循环(94。C，30sec;60-55。C，30sec;72。C，lmin);72°C，5min;4。C短期保存。产物记为PPzssb—2、PP腦。—2、PPM863—2、PPB11—2、PP罷—2。第三轮反应，分两步进行扩增第一步取第二轮反应产物各5iiL，2倍pfUmix缓冲液7.5yL，用ddH20补足至25i！L。其中PP腦。—2与PP腦—2相连接，PPB11—2与PP罷—2相连接。反应程序95。C，3min;10个循环(94°C，30sec;68。C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4"C短期保存。产物记为Mega810+863和Mega11+176;第二步分别以第一步反应产物Mega810+863和Megal1+176为模板，引物分别为Mai810-o3和Mai863_o6各1iiL，Mai11-o7禾口Mai176_ol0各1iiL;加2倍pfUmix缓冲液12.5iiL，用ddH20补足至50iiL。反应程序95。C，3min;20个循环(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4。C短期保存。产物记为PPM81。+M863、PPB11+B176。第四轮反应，分两步进行扩增第一步取第三轮反应产物PPm810+m863、PPb11+B176各5ilL，2倍pfUmix缓冲液7.5iiL，用ddH20补足至25iiL。反应程序95。C，3min;10个循环(94°C，30sec;68°C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4t:短期保存。产物记为Mega81。+863+11+176，第二步分别以第一步反应产物，引物为Mai810-o3和Mai176_ol0各1iiL;力口2倍pfUmix缓冲液12.5iiL，用ddH20补足至50yL。反应程序95。C，3min;20个循环(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4。C短期保存。产物记为PPM81。+M863+B11+B176。第五轮反应，分两步进行扩增第一步取第二轮反应产物PPzssub—2及第四轮产物PP腦。+腦+Bn+罷各5iiL，2倍pfUmix缓冲液7.5iiL，用ddH20补足至25yL。反应程序95。C，3min;10个循环(94°C，30sec;68°C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4。C短期保存。产物记为MegaZSSIIb+81。+863+11+176;第二步以第一步反应产物为模板，引物为MaiZss-ol和Mai176_ol0各1iiL;加2倍pfUmix缓冲液12.5iiL，用ddH20补足至50yL。反应程序95。C，3min;20个循环(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4t:短期保存。产物记为PPZSSIIM81。+M863+B11+B176。第六轮反应以第五轮产物为模板lyL，用引物MaiZss-ol和Mai176_010扩增；反应体系为总体积为50iiL，其中2倍Taqmix缓冲液25iiL，上下游引物(10mM)各1iiL，用(1朋20补足至50iiL。反应程序为95。C，3min;30个循环(94。C，30sec;60-55°C，30sec;72。C，lmin);72°C，5min;4T短期保存。产物记为TPZSSIIb+M81。+M863+B11+B176。回收纯化第六轮产物，连接于T-easy载体，导入大肠杆菌JM109即可。为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明。1、原理本方法采用两步PCR扩增法将转基因玉米中特异片段逐步连接起来，获得含有zSSIIb+M0N810+M0N863+BT11+BT176的转基因玉米检测中需要的标准分子对照物质。将该标准分子通过常规的方法采用T-easy载体导入大肠杆菌JM109中，即可长期保存使用。2、引物设计本引物设计依据农业部转基因玉米检测标准中涉及的zSSIIb、M0N810、M0N863、BT11、BT176等引物序列，以将zSSIIb及转化事件M0N810特异性引物为基础，在zSSIIb基因反向引物的5'端加上M0N810正向引物的反向互补序列；在转化事件M0N810反向引物的5'端加上zSSIIb基因反向引物的反向互补序列；在引物设计软件primerprimer5.0中调节引物Tm值在55-60之间。用上述方法设计出一套用于制备zSSIIb+M0N810+M0N863+BTll+BT176标准分子的引物。表l引物序列表如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3、制备方法第一轮反应以非转基因玉米及转基因玉米品系M0N810、M0N863、BTll、BT176基因组DNA为模板，用检测标准中引物序列扩增；反应体系为总体积为50iiL，其中2倍pfUmix缓冲液25iiL，上下游引物(10mM)各0.5yL，模板(50ng組)1yL，用(1朋20补足至50iiL。反应程序为95。C，3min;30个循环(94。C，30sec;60-55°C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4。C短期保存。产物记为PPzssb—"PP腦。—"PPM863—"PPB11—"PP罷—!。第二轮反应以第一轮PCR扩增产物PP^hh、PP誦fPP鹏h、PPb1h、PP罷4为模板，以权力说明书2中对应引物，进行PCR扩增；反应体系为总体积为50iiL，其中2倍pfUmix缓冲液25iiL，上下游引物(10mM)各0.5yL，用ddH20补足至50iiL。反应程序为95。C，3min;30个循环(94。C，30sec;60-55°C，30sec;72。C，lmin);72°C，5min;4。C短期保存。产物记为PPzssb—2、PP腦。—2、PPM863—2、PPB11—2、PP罷—2。第三轮反应，分两步进行扩增第一步取第二轮反应产物各5iiL，2倍pfUmix缓冲液7.5yL，用ddH20补足至25i！L。其中PP腦。—2与PP腦—2相连接，PPB11—2与PP罷—2相连接。反应程序95。C，3min;10个循环(94°C，30sec;68°C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4"C短期保存。产物记为Mega810+863和Mega11+176;第二步分别以第一步反应产物Mega810+863和Megal1+176为模板，引物分别为Mai810-o3和Mai863_o6各1iiL，Mai11-o7禾口Mai176_ol0各1iiL;加2倍pfUmix缓冲液12.5iiL，用ddH20补足至50iiL。反应程序95。C，3min;20个循环(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4。C短期保存。产物记为PPM81。+M863、PPB11+B176。第四轮反应，分两步进行扩增第一步取第三轮反应产物PPm810+m863、PPb11+B176各5ilL，2倍pfUmix缓冲液7.5iiL，用ddH20补足至25iiL。反应程序95。C，3min;10个循环(94°C，30sec;68°C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4t:短期保存。产物记为Mega81。+863+11+176，第二步分别以第一步反应产物，引物为Mai810-o3和Mai176_ol0各1iiL;力口2倍pfUmix缓冲液12.5iiL，用ddH20补足至50yL。反应程序95。C，3min;20个循环(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4。C短期保存。产物记为PPM81。+M863+B11+B176。第五轮反应，分两步进行扩增第一步取第二轮反应产物PPzssub—2及第四轮产物PP腦。+腦+Bn+罷各5iiL，2倍pfUmix缓冲液7.5iiL，用ddH20补足至25yL。反应程序95。C，3min;10个循环(94°C，30sec;68°C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4。C短期保存。产物记为MegaZSSIIb+81。+863+11+176;第二步以第一步反应产物为模板，引物为MaiZss-ol和Mai176_ol0各1iiL;加2倍pfUmix缓冲液12.5iiL，用ddH20补足至50yL。反应程序95。C，3min;20个循环(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4t:短期保存。产物记为PPZSSIIM81。+M863+B11+B176。第六轮反应以第五轮产物为模板lyL，用引物MaiZss-ol和Mai176-ol0扩增；回收纯化第六轮产物，连接于T-easy载体，导入大肠杆菌JM109即可。其方法参本发明公开的有效制备转基因作物检测标准分子对照物zSSIIb+M0N810+M0N863+BTll+BT176方法所具有的特点在于(1)方便检测需要将4种转基因玉米品系的外源基因特异性片段连在一起，在检测过程中无需提取多种阳性基因组DNA作为阳性对照。(2)易传代将该标准分子导入大肠杆菌，易保藏、传代。(3)易加入新的外源片段如有新的转基因材料出现，可在原标准分子的基础上加入新的外源片段，满足日益增多的转基因作物材料的检测需要。(4)降低生物安全等级，风险可控标准分子只含有检测标准中需要的特异片段，不能表达，且大肠杆菌易灭活。产物记为TP:zssIIb+M810+M863+Bll+B176。图1为PCR产物用2X琼脂糖凝胶电泳，100V电压，30min图。图中M为DL2000D應Eirker;其中1-6为zSSIIb引物扩增结果1为空白对照，2为阴性对照，3为转基因玉米基因组DNA阳性对照，4为标准分子阳性对照，5为样品重复1，6为样品重复2;7-12为BT11引物扩增结果7为空白对照，8为阴性对照，9为转基因玉米基因组DNA阳性对照，10为标准分子阳性对照，11为样品重复1，12为样品重复2;13-18为BT176引物扩增结果13为空白对照，14为阴性对照，15为转基因玉米基因组DNA阳性对照，16为标准分子阳性对照，17为样品重复1，18为样品重复2;19-24为M0N810引物扩增结果19为空白对照，20为阴性对照，21为转基因玉米基因组DNA阳性对照，22为标准分子阳性对照，23为样品重复1，24为样品重复2;25-30为M0N863引物扩增结果25为空白对照，26为阴性对照，27为转基因玉米基因组DNA阳性对照，28为标准分子阳性对照，29为样品重复1，30为样品重复2.结果显示样品中含有转基因玉米品系M0N863成分，不含有BT11、BT176、M0N810成分；同时验证了本专利制备的标准分子阳性对照物能有效地代替转基因玉米基因组DNA阳性对照。具体实施例方式为了更充分的解释本发明的实施，提供转基因玉米标准分子对照物的制备实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。其中试验中所采用的原料及试剂均有市售。实施例1:M0N810+M0N863标准分子制备过程材料转基因玉米品系M0N810和M0N863基因组DNA(50ng/iiL);试剂pfUmix缓冲液(2倍);Taqmix缓冲液(2倍)；引物(10mM，见表);T-easy载体；大肠杆菌JM109;仪器PCR仪；电泳仪；水浴锅；培养箱<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>方法第一轮反应以转基因玉米品系M0N810、M0N863基因组DNA为模板，用检测标准中引物序列扩增；反应体系为总体积为50iiL，其中2倍pfUmix缓冲液25yL，上下游引物(10mM)各0.5iiL，模板(50ng/yL)1iiL，用ddH20补足至50iiL。反应程序为95。C，3min;30个循环(94。C，30sec;60-55°C，30sec;72。C，lmin);72°C，5min;4"短期保存。产物记为PP誦—"PPM863—10第二轮反应以第一轮PCR扩增产物PP,。—pPPM863—工为模板，以上表中对应引物，进行PCR扩增；反应体系为总体积为50yL，其中2倍pfUmix缓冲液25yL，上下游引物(10mM)各0.5iiL，用ddH20补足至50iiL。反应程序为95。C，3min;30个循环(94。C，30sec;60-55°C，30sec;72。C，lmin);72°C，5min;4。C短期保存。产物记为PPM81。—2、PPM863—2。第三轮反应，分两步进行扩增第一步取第二轮反应产物各5iiL，2倍pfUmix缓冲液7.5yL，用ddH20补足至25iiL。反应程序95。C，3min;10个循环(94°C，30sec;68°C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4t:短期保存。产物记为Mega81。+863;第二步以第一步反应产物Mega8阔63为模板，引物分别为Mai810_o3和Mai863-o6各1iiL;力口2倍pfUmix缓冲液12.5iiL，用ddH20补足至50iiL。反应程序95。C，3min;20个循环(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4t:短期保存。产物记为PPM81。+M863。第四轮反应以第三轮产物为模板liiL，用Mai810-o3和Mai863_o6各1iiL扩增；反应体系为总体积为50iiL，其中2倍Taqmix缓冲液25iiL，用ddH20补足至50iiL。反应程序为95。C，3min;30个循环(94°C，30sec;60-55°C，30sec;72°C，lmin);72t:，5min;4t:短期保存。产物记为TPM81。+M863。回收纯化第四轮产物，连接于T-easy载体，导入大肠杆菌JM109即可。实施例2:Btll+btl76标准分子制备过程材料转基因玉米品系Btll和Btl76基因组DNA(50ng/iiL);试剂:pfUmix缓冲液(2倍);Taqmix缓冲液(2倍)；引物(10mM，见表);T-easy载体；大肠杆菌JM109;仪器PCR仪；电泳仪；水浴锅；培养箱引物名称引物序列(5'-3')Maill-o7AAAGATGGTAGCGGAACCCCMaiII-08CGTGCTTTGCAAGAAATGGTCMai176-o9CCATTTCTTGTGAAGCACGGTCMail76-ol0TCGACTTTATAGGAAGGGAGAGG方法第一轮反应以转基因玉米品系BT11、BT176基因组DNA为模板，用检测标准中引物序列扩增；反应体系为总体积为50L，其中2倍pfUmix缓冲液25yL，上下游引物(10mM)各0.5iiL，模板(50ng/yL)1iiL，用ddH20补足至50iiL。反应程序为95。C，3min;30个循环(94°C，30sec;60-55°C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4"C短期保存。产物记为PPB11—"PP罷—10第二轮反应以第一轮PCR扩增产物PPBn—pPPB176—工为模板，以上表中对应引物，进行PCR扩增；反应体系为总体积为50yL，其中2倍pfUmix缓冲液25yL，上下游引物(10mM)各0.5iiL，用ddH20补足至50iiL。反应程序为95。C，3min;30个循环(94°C，30sec;60-55°C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4"C短期保存。产物记为PPB11—2、PP罷—2。第三轮反应，分两步进行扩增第一步取第二轮反应产物各5iiL，2倍pfUmix缓冲液7.5yL，用ddH20补足至25iiL。反应程序95。C，3min;10个循环(94°C，30sec;68°C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4t:短期保存。产物记为Mega11+176;第二步以第一步反应产物Mega^76为模板，引物分别为Mai11-o7和Mai176-ol0各1iiL;加2倍pfUmix缓冲液12.5iiL，用ddH20补足至50iiL。反应程序95。C，3min;20个循环(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，lmin);72。C，5min;4t:短期保存。产物记为PPB11+B176。第四轮反应以第三轮产物为模板lyL，用Maill-o7和Mai176_ol0各1yL扩增；反应体系为总体积为50iiL，其中2倍Taqmix缓冲液25iiL，用ddH20补足至50iiL。反应程序为95。C，3min;30个循环(94°C，30sec;60-55°C，30sec;72°C，lmin);72°C，5min;4"C短期保存。产物记为TPB11+B176。回收纯化第四轮产物，连接于T-easy载体，导入大肠杆菌JM109即可。实施例3:ZssIIb+M0N810+M0N863标准分子制备过程材料非转基因玉米基因组DNA(50ng/yL)，PCR产物PPM81。+M863;试剂:pfUmix缓冲液(2倍);Taqmix缓冲液(2倍);引物(10mM，见表);T-easy载体；大肠杆菌JM109;仪器PCR仪；电泳仪；水浴锅；培养箱引物名称引物序列(5'-3')MaiZss—ol:CGGTGGATGCTAAGGCTGATGMaiZss-o2:CACACTTGAAAGGGCCAGGMai810-o3GCCCTTTCAAGTGTGCCCA12<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>方法第一轮反应以非转基因玉米基因组DNA为模板，用检测标准中引物序列扩增；反应体系为总体积为50iiL，其中2倍pfUmix缓冲液25iiL，上下游引物(10mM)各O.5yL，模板(50ng/iiL)1iiL，用ddH20补足至50yL。反应程序为95。C，3min;30个循环(94°C，30sec;60-55。C，30sec;72。C，30sec);72。C，5min;4"C短期保存。产物记为PPZSSIIb—10第二轮反应以第一轮PCR扩增产物PP^nb—!为模板，以ol-o6对应引物，进行PCR扩增；反应体系为总体积为50yL，其中2倍pfUmix缓冲液25yL，上下游引物(10mM)各0.5iiL，用ddH20补足至50iiL。反应程序为95。C，3min;30个循环(94°C，30sec;60-55。C，30sec;72。C，30sec);72°C，5min;4"短期保存。产物记为PPZSSIIb—2。第三轮反应，分两步进行扩增第一步取第二轮反应产物及PPM81。+M863各5iiL，2倍pfUmix缓冲液7.5yL，用(1(11120补足至25iiL。反应程序95。C，3min;10个循环(94°C，30sec;68。C，30sec;72。C，2min);72。C，5min;4t:短期保存。产物记为Megazssiib+810+863，第二步分别以第一步反应产物为模板，引物分别为MaiZss-o和Mai863_o6各1yL;加2倍pfUmix缓冲液12.5iiL，用ddH20补足至50yL。反应程序95。C，3min;20个循环(94°C，30sec;50。C，30sec;72°C，2min);72。C，5min;4t:短期保存。产物记为PPZssiib+81。+863。第四轮反应以第三轮产物lyL为模板，用引物MaiZss-ol和Mai176-o8扩增；反应体系为总体积为50iiL，其中2倍Taqmix缓冲液25iiL，上下游引物(10mM)各1iiL，用(1朋20补足至50iiL。反应程序为95。C，3min;30个循环(94。C，30sec;60-55。C，30sec;72。C，2min);72°C，5min;4t:短期保存。产物记为TPzssiib+M8io+M863。回收纯化第7K轮广物，连接于T-easy载体，导入大肠杆菌JM109即可。实施例4对照比较材料转基因玉米品系M0N810、M0N863、Bt11和Btl76基因组DNA(50ng/iiL)，本发明制备的转基因玉米标准分子对照物，待测样品基因组DNA(50ng/yL);试剂:Taqmix缓冲液(2倍);引物(10mM，见表);仪器PCR仪；电泳仪；水浴锅；培养箱方法1转基因玉米标准分子对照物DNA快速提取无菌条件下，挑去已导入zSSIIb+Mon810+Mon863+BTll+BT176标准分子的JM109大肠杆菌一环，与100iiLPCR小管中，100。C煮沸8min。冰上2min备用。2PCR扩增检测样品中是否含有转基因玉米M0N810、M0N863、BT11、BT176:设置空白对照、阴性对照、转基因玉米基因组DNA阳性对照、标准分子阳性对照、样品重复l、样品重复2。使用检测标准中品系特异性引物依次对样品中的内源基因zSSIIb及外源基因M0N810、M0N863、BT11、BT176进行PCR检测。反应体系为总体积为50iiL，其中2倍Taqmix缓冲液25iiL，上下游引物(10mM)各1iiL，DNA模板1iiL，空白对照用水代替，用ddH20补足至50yL。反应程序为95。C，3min;35个循环(94°C，30sec;50°C，30sec;72°C，lmin);72°C，5min;4"短期保存。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，100V电压，30min。结果见下图1。其中1-6为zSSIIb引物扩增结果1为空白对照，2为阴性对照，3为转基因玉米基因组DNA阳性对照，4为标准分子阳性对照，5为样品重复1，6为样品重复2;7-12为BT11引物扩增结果7为空白对照，8为阴性对照，9为转基因玉米基因组DNA阳性对照，10为标准分子阳性对照，11为样品重复1，12为样品重复2;13-18为BT176引物扩增结果13为空白对照，14为阴性对照，15为转基因玉米基因组DNA阳性对照，16为标准分子阳性对照，17为样品重复1，18为样品重复2;19-24为M0N810引物扩增结果19为空白对照，20为阴性对照，21为转基因玉米基因组DNA阳性对照，22为标准分子阳性对照，23为样品重复1，24为样品重复2;25-30为M0N863引物扩增结果25为空白对照，26为阴性对照，27为转基因玉米基因组DNA阳性对照，28为标准分子阳性对照，29为样品重复1，30为样品重复2.结果显示样品中含有转基因玉米品系M0N863成分，不含有BT11、BT176、M0N810成分；同时验证了本专利制备的标准分子阳性对照物能有效地代替转基因玉米基因组DNA阳性对照。附件1:转基因玉米检测标准中转化事件特异性引物序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>:0158]附件2:PCR产物回收后连接T-easy载体及导入JM109大肠杆菌方法，参见:0159]http:/7www.promega.com.cn/techserv/ctbs/pGEM—T.pdf。:0160]序列表:0161]<110>天津市农业科学院中心实验室:0162]〈120〉一种牛羊源成分的快速检测方法:0163]〈160>10:0164]〈210>1:0165]〈2U〉21bp:0166]〈212〉DNA:0167]〈213〉人工序列:0168]〈400>1:0169]cggtggatgctaaggctgatg21:0170]〈210>2:0171]〈2H〉19bp:0172]〈212>DNA:0173]〈213>人工序列:0174]〈400〉2:0175]cacacttgaaagggccagg19:0176]〈210>3:0177]〈2H〉19bp:0178]〈212>DNA:0179]〈213>人工序列:0180]〈400>3:0181]gccctttcaagtgtgccca19:0182]〈210>4:0183]<211>21bp:0184]〈212>DNA:0185]〈213>人工序列:0186]〈400>4:0187]tgagtgcgcaagcaaattcgg21:0188]〈210〉5:0189]〈211〉21bp〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>5ttgcttgcgcactcaaagacc〈210>6〈211>21bp〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6ggttccgctaccatctttggg〈210>7〈211>20bp<212>DNA〈213〉人工序列〈400>7aaagatggtegcggaacccc〈210>8〈211>21bp〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>8cgtgctttgcaagaaatggtc〈210>9〈211>22bp〈212>DNA<213>人工序列〈400>9ccatttcttgtgaagcacggtc〈210>10[0219:<211>23bp[0220:〈212>DNA[0221:〈213〉人工序列[0222:〈400>10[0223:tcgactttataggaagggagagg说明书13/13页20221权利要求一种用于转基因玉米检测的标准分子对照物，包括转基因品系MON810、MON863、BT11、BT176转化事件特异性序列及内源基因zSSIIb特异片段，其先后顺序为zSSIIb+MON810+MON863+BT11+BT176。2.如权利要求1所述转基因玉米标准分子对照物，其中zSSIIb+Mon810+Mon863+BTll+BT176标准分子的引物序列如下<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>3.—种用于筛选权利要求2所述引物的方法其特征在于以将zSSIIb及转化事件特异性序列特异性引物为基础，在zSSIIb基因反向引物的5'端加上转化事件特异性正向引物的反向互补序列；在转化事件反向引物的5'端加上zSSIIb基因反向引物的反向互补序列；以连接处为中心，删减两端序列，使引物长度在18-28bp之间，Tm值在55-60之间。C。4.一种用于制备权利要求1所述转基因玉米标准分子对照物的PCR反应方法，其特征在于第一轮反应以非转基因玉米及转基因玉米品系M0N810、M0N863、BTll、BT176基因组DNA为模板，用检测标准中引物序列扩增；反应体系为总体积为50yL，其中2倍pfUmix缓冲液25iiL，上下游引物(10mM)各0.5yL，模板(50ng/yL)1yL，用ddH20补足至50yL;反应程序为95。C，3min;30个循环(94°C，30sec;60-55。C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4。C短期保存；产物记为PPZSSIIb-"PP腦。-"PPM863-"PPB11-"PP罷-!;第二轮反应以第一轮PCR扩增产物PP^nb—pPP誦—pPP腦—pPP,pPP罷—!为模板，以ol-olO中对应引物，进行PCR扩增；反应体系为总体积为50iiL，其中2倍pfUmix缓冲液`25iiL，上下游引物(10mM)各O.5yL，用ddH20补足至50yL;反应程序为95。C，3min;30个循环(94°C，30sec;60-55。C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4。C短期保存；产物记为PPZSSIIb—2、PP腦。—2、PPM863—2、PPB11—2、PP罷—2;第三轮反应，分两步进行扩增第一步取第二轮反应产物各5iiL，2倍pfUmix缓冲液7.5iiL，用ddH20补足至25i！L;其中PP腦。—2与PP腦—2相连接，PPB11—2与PPB176—2相连接;反应程序95。C，3min;10个循环(94。C，30sec;68。C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4"短期保存；产物记为Mega81。+863和Mega11+176;第二步分别以第一步反应产物Mega810+863和Megall+176为模板，引物分别为Mai810-o3禾PMai863_o6各1iiL，Mai11-o7和Mai176_ol0各1iiL;加2倍pfUmix缓冲液12.5iiL，用ddH20补足至50iiL;反应程序95。C，3min;20个循环(94°C，30sec;50。C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4t:短期保存；产物记为PPm810+m863、PPb11+B176;第四轮反应，分两步进行扩增第一步取第三轮反应产物PPm8io+m863、PPbii+bi76各5iiL，2倍pfUmix缓冲液7.5ilL，用ddH20补足至25iiL;反应程序95。C，3min;10个循环(94。C，30sec;68。C，30sec;72。C，2min);72。C，5min;4t:短期保存；产物记为Mega81。+863+11+176，第二步分别以第一步反应产物，引物为Mai810-o3和Mai176_ol0各1yL;加2倍pfUmix缓冲液12.5iiL，用ddH20补足至50yL;反应程序95。C，3min;20个循环(94°C，30sec;50。C，30sec;72。C，2min);72。C，5min;4t:短期保存。产物记为PPM810+M863+B11+B176，第五轮反应，分两步进行扩增第一步取第二轮反应产物PPzssllb-2及第四轮产物PPM810+M863+B11+B176^S"5ilL，2f昔pfUmix缓冲液7.5iiL，用ddH20补足至25iiL;反应程序95。C，3min;10个循环(94。C，30sec;68。C，30sec;72。C，2min);72。C，5min;fC短期保存；产物记为MegazssIIb+810+863+ll+176，第二步以第一步反应产物为模板，引物为MaiZss-ol和Mai176_ol0各1yL;加2倍pfUmix缓冲液12.5iiL，用ddH20补足至50yL;反应程序95。C，3min;20个循环(94°C，30sec;50。C，30sec;72。C，2min);72。C，5min;4t:短期保存；产物记为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>，第六轮反应以第五轮产物为模板L，用引物MaiZss-ol和Mai176_ol0扩增；反应体系为总体积为50iiL，其中2倍Taqmix缓冲液25iiL，上下游引物(10mM)各1iiL，用ddH20补足至50iiL;反应程序为95。C，3min;30个循环(94°C，30sec;60-55。C，30sec;72。C，lmin);72。C，5min;4。C短期保存；产物记为TPZSSIIb+M81。+M863+B11+B176;回收纯化第六轮产物，连接于T-easy载体，导入大肠杆菌JM109即可长期保存使用。全文摘要本发明公开了一种转基因作物检测中必要的标准分子对照物及其制备方法。设计特异性引物制备含有玉米内源基因ZssIIB特异片段及转基因玉米品系Mon810、Mon863、BT11、BT176中外源基因特异片段标准分子对照物质。本发明将4种转基因玉米品系的外源基因特异性片段连在一起，在检测过程中无需提取多种阳性基因组DNA作为阳性对照。将该标准分子导入大肠杆菌，易保藏、传代。如有新的转基因材料出现，可在原标准分子的基础上加入新的外源片段，满足日益增多的转基因作物材料的检测需要。文档编号C12N15/10GK101724702SQ20091024503公开日2010年6月9日申请日期2009年12月23日优先权日2009年12月23日发明者兰青阔,朱珠,王永,程奕,赵新申请人:天津市农业科学院中心实验室