专利名称：一种食源性致病菌的快速鉴定方法
技术领域：
本发明属于食品微生物鉴定与应用技术领域，具体涉及沙门氏菌、金黄色葡萄球 菌、志贺氏菌和李斯特氏菌四种食源性致病菌的鉴定方法，特别是一种利用焦磷酸测序技 术对四种食源性致病菌快速鉴定方法。
背景技术：
据世界卫生组织估计，全世界每年有数以亿计的食源性疾病患者中，70%病源是 各种致病性微生物。中国疾病预防控制中心营养与食品安全所近年对我国部分省市的生 肉、熟肉、乳和乳制品、水产品、蔬菜中的致病菌污染状况进行了连续的主动监测，结果表 明，微生物性食物中毒居首位，占39. 62%，化学性食物中毒占38. 56%，动植物性和原因不 明的食物中毒均在10%左右。2003年我国重新对致病菌(沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌 等)检测国家标准进行了修订，但与1994年国家标准相比并没有太大的不同，仍以传统分 离培养检测方法为主，该方法除操作繁琐外，检验时间较长，一般需要5 7天培养、生化鉴 定时间，已远远不能满足现代检测要求。国外针对致病微生物检测目前主要采用免疫学方 法和显色培养基方法以及微生物自动鉴定系统，上述方法共同的优点就是节省一定的鉴定 时间，但缺点也非常明显。其中免疫学方法的缺点是操作技术性要求高，假阴性高，普及困 难；显色培养基的缺点是不稳定，贮存时间短，受外界因素影响大；微生物自动鉴定系统， 我国目前还未能生产完全自动化的细菌鉴定仪器设备，而且配套试剂也完全依赖进口。随着生命科学的飞速发展，各种分子生物学实验技术的不断涌现，并逐渐扩展到 微生物检验领域。各种以PCR技术为基础的分子生物学检验技术近年来广泛应用于微生物 检测，但是这些技术仅能提供阳性扩增产物的片段大小信息，且无法显示特异性的基因序 列，假阴性和假阳性无法避免，因此不足以提供确证结论。焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行 电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反 应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模 板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可 最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入 的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成，通过检测荧光的释放和强 度，达到实时测定DNA序列的目的。该技术用于测量短DNA链序列，是目前唯一能实时得到 定量序列结果的技术，兼有PCR技术的灵敏性和测序技术的准确性，准确性高，重复性好， 自动化程度高，操作简单，非常适合用于食源性致病菌快速准确的鉴定。迄今为止，尚未有 成功的利用焦磷酸测序技术鉴定沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和李斯特氏菌四种 食源性致病菌的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种食源性致病菌快速鉴定方法及根据四种致病菌 16sRNA的保守序列设计PCR特异性扩增引物和测序引物，通过焦磷酸测序结果判定四种食 源性致病菌。本发明的检测方法具有高效性、快速、精准及操作简便等特点。为实现上述目 的，本发明提供如下的技术方案用于鉴定四种食源性致病菌的PCR扩增及焦磷酸特异性引物，其 特征在于，包括引物正向序列5’ -AGCAGCCGCGGTAATACG-3’，反向引物序列 5，-Biotin-CGCATTTCACCGCTACAC-3，，测序引物序列5，-ATTTATTGGGCGTAAAG-3，。每条弓丨 物分别配制成浓度为100 μ mol/L的贮存液，工作浓度为10 μ mol/L。本发明采用PCR扩增及焦磷酸特异性引物快速鉴定四种食源性致病菌的方法，其 特征在于按如下步骤(1)采用正、反PCR特异引物及GoTaq Master Mix即用型2X反应缓冲液，加入 四种食源性致病菌模板DNA进行PCR扩增；其中的PCR扩增反应体系扩增反应的总体积为50 μ L，其各种成分分别为 2><GoTaq Master Mix 即用型 2X 反应缓冲液 25 μ L，10 μ mol/L 引物各 1 μ L，模板 DNA 2 μ L，用灭菌去离子水补齐至50 μ L ；反应程序94°C预变性5min，94°C变性30S，53°C退火 30S，72°C延伸30S，循环30次，最后72°C延伸5min，4°C保存；(2)采用测序特异性引物，对四种食源性致病菌的PCR扩增产物进行焦磷酸测序；其中的焦磷酸测序反应体系测序反应的总体积为100 μ L，其中各种成分分别 为:PCR r^ 50 μ L, Sepharose Beads 3 μ L, Binding Buffer 47 μ L (lOmmol/L Tris-HCl, 2mol/L NaCl, lmmol/L EDTA，0.1 % Tween20，ρΗ7· 6)，10 μ mol/L 测序引物 1.2yL， Annealing Buffer 38. 8 μ L(20mmol/LTris-AC,2mmol/L MgAc2，pH7.69)。(3)采用焦磷酸测序仪测序ISmin后，直接通过可见光信号峰值与待测定四种食 源性致病菌已知序列对比分别判定为哪种食源性致病菌。本发明所述的快速鉴定方法，其中四种食源性致病菌指的是沙门氏菌、金黄色葡 萄球菌、志贺氏菌和李斯特氏菌。本发明所述的检测方法中模板DNA指的是供试样品细菌基因组DNA。本发明的焦磷酸测序是在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷 酸酶4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入 一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的 焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每 个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合 成，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法做以详细的 说明。1、原理本方法应用一种新型的核酸测序方法其原理是在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧 光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP聚合与一次荧光 信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。具有准确性高，重复性好，自动化程度高和操作简单等优点。2、引物设计本发明依据四种致病菌16sRNA的保守序列设计2条PCR扩增特异性引物和1条 测序引物。引物由上海生物工程公司合成。表1引物序列表如下 3、反应条件PCR扩增反应试剂需要GoTaq Master Mix即用型2X反应缓冲液、PCR扩增引
物及模板DNA。测序反应试剂需要PCR扩增产物、SepharoseBeads, Binding Buffer、测序 引物及Annealing Buffer，需要有焦磷酸测序仪，测序时间18min。材料与方法(1)试剂Promega公司生产的GoTaq Master Mixes溶液；上海生工合成的特 异性扩增引物和测序引物；Biotage公司生产的S印haroseBead。(2)扩增反应体系及扩增程序扩增反应的总体积为50 μ L，其各种成分分别为 2xGoTaq Master Mix即用型2X反应缓冲液25 μ L，10 μ mol/L引物各1 μ L，模板DNA 2 μ L，用灭菌去离子水补齐至50 μ L ；反应程序94°C预变性5min，94°C变性30S，53°C退火 30S，72°C延伸30S，循环30次，最后72°C延伸5min，4°C保存。(3)测序反应体系测序反应的总体积为100 μ L，其中各种成分分别为PCR产物 50 μ L,Sepharose Beads 3 μ L,Binding Buffer 47 μ L(lOmmol/L Tris-HCl,2mol/L NaCl, lmmol/L EDTA，0. 1 % Tween20, pH7. 6)，10 μ mol/L 测序引物 1.2yL，Annealing Buffer 38. 8μ L(20mmol/LTris-AC,2mmol/L MgAc2, pH7. 6)；(4)采用焦磷酸测序仪测序后，直接通过可见光信号峰值与待测定四种食源性致 病菌已知序列对比分别判定为哪种食源性致病菌，测序时间为18min。本发明采用PCR扩增及焦磷酸特异性引物用于食源性致病菌的快速鉴定方法与 现有技术相比，具有以下优点(1)操作简便程序化操作，不需特殊理论基础。(2)精准性该发明是以焦磷酸测序技术为基础，具有很高的准确性。(3)快速高效3h之内即可完成食源性致病菌鉴定工作；(4)结果判定简单鉴定结果可以直接从可见光信号峰值读出。
图1为扩增产物的电泳分析图谱。自左向右依次为Marker、沙门氏菌1、沙门氏菌 2、沙门氏菌3、金黄色葡萄球菌1、金黄色葡萄球菌2、金黄色葡萄球菌3、志贺氏菌1、志贺氏 菌2、志贺氏菌3、李斯特氏菌1、李斯特氏菌2、李斯特氏菌3。图2为沙门氏菌扩增产物测序结果图。
图3为金黄色葡萄球菌扩增产物测序结果图。图4为志贺氏菌扩增产物测序结果图。图5为李斯特氏菌扩增产物测序结果图。
具体实施例方式为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说 明，其中DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶均有市售，另外 需加以说明的是1、本发明所述的引物序列见表1。2、四种食源性致病菌模板DNA的提取 细菌基因组DNA的小量制备法(见附件)。实施例1(1)试剂Promega公司生产的GoTaq Master Mix即用型2X反应缓冲液；上海 生工合成的特异性扩增引物和测序引物；Biotage公司生产的S印ha rose Bead。(2)扩增反应体系扩增反应的总体积为50 yL，其各种成分分别为2xGoTaq Master Mix即用型2X反应缓冲液25 y L，10 y mol/L引物各1 y L，沙门氏菌细菌基因组模 板DNA 2 u L，用灭菌去离子水补齐至50 ii L ；扩增反应程序941预变性51^11，941变性303，531退火303，721延伸303，循环 30次，最后72°C延伸5min，4°C保存。(3)测序反应体系测序反应的总体积为100 y L，其中各种成分分别为PCR产物 50u L,Sepharose Beads 3u L,Binding Buffer 47u L(lOmmol/L Tris-HCl,2mol/L NaCl, lmmol/L EDTA，0. 1 % Tween20, pH7. 6)，10 ii mol/L 测序引物 1.2iiL，Annealing Buffer 38. 8u L(20mmol/LTris-AC,2mmol/L MgAc2，pH7. 6)，根据软件提示在试剂舱相对应位置加 入所需的底物，酶和dNTP。(4)采用焦磷酸测序仪，根据软件提示编辑程序进行测序，测序结束后，直接通 过可见光信号峰值与待测定四种食源性致病菌已知序列对比分别判定为哪种食源性致病 菌，测序时间为18min。结果如图2所示，测序结果可以直接通过可见光信号峰值读出为 CGCACGCAGGCGGTCT，供试样品可判定为沙门氏菌。实施例2(1)试剂Promega公司生产的GoTaq Master Mix即用型2X反应缓冲液；上海 生工合成的特异性扩增引物和测序引物；Biotage公司生产的S印harose Bead。(2)扩增反应体系及扩增程序扩增反应的总体积为50 y L，其各种成分分别为 2xGoTaq Master Mix即用型2X反应缓冲液25 u L, 10 u mol/L引物各1 y L，金黄色葡 萄球菌细菌基因组模板DNA 2 u L，用灭菌去离子水补齐至50 y L ；扩增反应程序941预变性51^11，941变性303，531退火303，721延伸303，循环 30次，最后72°C延伸5min，4°C保存。(3)测序反应体系测序反应的总体积为100 y L，其中各种成分分别为PCR产物 50u L,Sepharose Beads 3u L,Binding Buffer 47u L(lOmmol/L Tris-HCl,2mol/L NaCl, lmmol/L EDTA，0. 1 % Tween20, pH7. 6)，10 ii mol/L 测序引物 1.2iiL，Annealing Buffer 38. 8u L(20mmol/LTris-AC,2mmol/L MgAc2，pH7. 6)；根据软件提示在试剂舱相对应位置加 入所需的底物，酶和dNTP。
(4)采用焦磷酸测序仪，根据软件提示编辑程序进行测序，测序结束后，直接通 过可见光信号峰值与待测定四种食源性致病菌已知序列对比分别判定为哪种食源性致病 菌，测序时间为18min。结果如图3所示，测序结果可以直接通过可见光信号峰值读出为 CGCGCGTAGGCGGTTT，供试样品可判定为金黄色葡萄球菌。实施例3(1)试剂Promega公司生产的GoTaq Master Mix即用型2X反应缓冲液；上海 生工合成的特异性扩增引物和测序引物；Biotage公司生产的S印harose Bead。(2)扩增反应体系及扩增程序扩增反应的总体积为50 y L，其各种成分分别为 2xGoTaq Master Mix即用型2X反应缓冲液25 u L, 10 u mol/L引物各1 y L，志贺氏菌 细菌基因组模板DNA 2 u L，用灭菌去离子水补齐至50 y L ；扩增反应程序941预变性51^11，941变性303，531退火303，721延伸303，循环 30次，最后72°C延伸5min，4°C保存。(3)测序反应体系测序反应的总体积为100 y L，其中各种成分分别为PCR产物 50u L,Sepharose Beads 3u L,Binding Buffer 47u L(lOmmol/L Tris-HCl,2mol/L NaCl, lmmol/L EDTA，0. 1 % Tween20, pH7. 6)，10 ii mol/L 测序引物 1.2iiL，Annealing Buffer 38. 8u L(20mmol/LTris-AC,2mmol/L MgAc2，pH7. 6)；根据软件提示在试剂舱相对应位置加 入所需的底物，酶和dNTP。(4)采用焦磷酸测序仪，根据软件提示编辑程序进行测序，测序结束后，直接通 过可见光信号峰值与待测定四种食源性致病菌已知序列对比分别判定为哪种食源性致病 菌，测序时间为18min。结果如图4所示，测序结果可以直接通过可见光信号峰值读出为 CGCACGCAGGCGGTTT，供试样品可判定为志贺氏菌。实施例4(1)试剂Promega公司生产的GoTaq Master Mix即用型2X反应缓冲液；上海 生工合成的特异性扩增引物和测序引物；Biotage公司生产的S印harose Bead。(2)扩增反应体系及扩增程序扩增反应的总体积为50 y L，其各种成分分别为 2xGoTaq Master Mix即用型2X反应缓冲液25 u L, 10 u mol/L引物各1 u L，单核增生 李斯特氏菌细菌基因组模板DNA 2 u L，用灭菌去离子水补齐至50 y L ；扩增反应程序941预变性51^11，941变性303，531退火303，721延伸303，循环 30次，最后72°C延伸5min，4°C保存。(3)测序反应体系测序反应的总体积为100 y L，其中各种成分分别为PCR产物 50 u L, Sepharose Beads 3 u L, Binding Buffer 47u L(lOmmol/L Tris-HCl,2mol/L Na CI, lmmol/L EDTA，0. 1% Tween20，pH7. 6)，10 ii mol/L 测序引物 1. 2 u L, Annealing Buffer 38. 8u L(20mmol/LTris-AC,2mmol/L MgAc2，pH7. 6)；根据软件提示在试剂舱相对应位置加 入所需的底物，酶和dNTP。(4)采用焦磷酸测序仪，根据软件提示编辑程序进行测序，测序结束后，直接通 过可见光信号峰值与待测定四种食源性致病菌已知序列对比分别判定为哪种食源性致病 菌，测序时间为18min。结果如图5所示，测序结果可以直接通过可见光信号峰值读出为 CGCGCGCAGGCGGTCT，供试样品可判定为单核增生李斯特氏菌。实施例5 (对比实验)
(1)样品添加以沙门氏菌为例，将沙门氏菌菌液10倍梯度稀释，筛选出 4X 104CFU/mL、4X 103CFU/mL、4X 102CFU/mL、4X 101CFU/mL、4CFU/mL、0CFU/mL 的菌悬液， 各取lmL添加于25mL牛奶中，备用。(2)按照传统国标方法进行前增菌将上述25mL牛奶加入225mL灭菌BPW溶液中， 37°C 培养 18h。(3)传统国标法与焦磷酸测序方法进行对比实验①传统国标方法将上述BPW培养液各取lmL分别接于lOmLTTB和SC中，继续 培养，培养后接种于BS和HE选择性平板，待长出典型菌落后进行生化鉴定，鉴定结果为 4X 104CFU/mL、4X 103CFU/mL、4X 102CFU/mL、4X 101CFU/mL、4CFU/mL 的添加样品均检出， OCFU/mL的添加样品未检出。②焦磷酸测序方法将上述BPW培养液各取2mL细菌基因组DNA的小量制备法提 取模板DNA，用于PCR扩增，扩增反应的总体积为50 yL，其各种成分分别为2><GoTaq Master Mixes Buffer 25 ii L，10 ii mol/L 引物各 1 ii L，供试样品模板 DNA 2yL，用灭菌去 离子水补齐至50ii L ；扩增反应程序94°C预变性5min，94°C变性30S，53°C退火30S，72°C 延伸30S，循环30次，最后72°C延伸5min，4°C保存。而后进行焦磷酸测序反应，测序反 应体系测序反应的总体积为100 iiL，其中各种成分分别为PCR产物50iiL，Sepharose Beads 3u L, Binding Buffer 47u L(10mmol/LTris-HCl,2mol/L NaCl,lmmol/L EDTA, 0. 1% Tween20, pH7. 6)，10 ii mol/L 测序引物 1.2iiL，Annealing Buffer 38.8iiL，根据软 件提示在试剂舱相对应位置加入所需的底物，酶和dNTP。测序结果与为4X104CFU/mL、 4X 103CFU/mL、4X 102CFU/mL、4X 101CFU/mL、4CFU/mL 的添加样品均检出，OCFU/mL 的添加 样品未检出。(4)对比实验结果传统国标法与焦磷酸测序方法检测结果一致。附件供试样品 细菌基因组DNA的小量制备法提取沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和李斯特氏菌的 模板DNA (1)取 2mL 细菌培养物，12000r/min 离心 2min ；(2)沉淀物加入567 ii L的TE缓冲液，涡旋混勻。加入30 y L10 %的SDS和 3 u L20mg/mL的蛋白酶K，颠倒混勻，于37°C温育lh ；(3)加入100 u L5mol/LnaCl，充分混勻，再加入80 u LCTAB/NaCl溶液，混勻，于 65°C温育 lOmin ；(4)加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒混勻，离心5min。将上清转入一个新管中；(5)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，颠倒混勻，离心5min，将上清转入一只新管 中；(6)加入0. 6倍体积异丙醇，轻轻颠倒混勻，-20°C放置30min，12000r/min离心 5min，弃上清；(7) 500 u L70 %乙醇洗涤沉淀，12000r/min离心5min，弃上清，待沉淀干燥，重溶 于100 i! L去离子水中，即为供试样品的细菌基因模板DNA。序列表<110>天津市农业科学院中心实验室<120> 一种食源性致病菌的快速鉴定方法
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<160>3<210>1<211>18bp<212>DNA<213>人工序列<400>1agcagccgcg gtaatacg18<210>2<211>18bp<212>DNA<213>人工序列<400>2cgcatttcac cgctacac18<210>3<211>17bp<212>DNA<213>人工序列<400>3atttattggg cgtaaag1权利要求
用于鉴定四种食源性致病菌的PCR扩增及焦磷酸特异性引物，其特征在于，包括引物正向序列5’-AGCAGCCGCGGTAATACG-3’，反向引物序列5’-Biotin-CGCATTTCACCGCTACAC-3’，测序引物序列5’-ATTTATTGGGCGTAAAG-3’。
2.一种采用权利要求1所述的特异性引物快速鉴定四种食源性致病菌的方法，其特征 在于按如下步骤(1)采用正、反PCR特异引物及GoTaq Master Mix即用型2X反应缓冲液，加入四种 食源性致病菌模板DNA进行PCR扩增；其中的PCR扩增反应体系扩增反应的总体积为50 yL，其各种成分分别为 2xGoTaq Master Mix 25 μ L即用型2X反应缓冲液，10 μ mol/L引物各1 μ L，模板DNA 2 μ L，用灭菌去离子水补齐至50 μ L ；反应程序94°C预变性5min，94°C变性30S，53°C退火 30S，72°C延伸30S，循环30次，最后72°C延伸5min，4°C保存；(2)采用测序特异性引物，对四种食源性致病菌的PCR扩增产物进行焦磷酸测序；其中的焦磷酸测序反应体系测序反应的总体积为lOOyL，其中各种成分分别为PCR产物 50yL，Sepharose Beads 3 μ L, Binding Buffer 47 μ L (lOmmol/L Tris-HCl, 2mol/ L NaCl, lmmol/L EDTA，0. 1 % Tween20, pH7. 6)，10 μ mol/L 测序引物 1.2yL，Annealing Buffer 38.8 μ L0(3)采用焦磷酸测序仪测序后，直接通过可见光信号峰值与待测定四种食源性致病菌 已知序列对比分别判定为哪种食源性致病菌。
3.利要求1所述的快速鉴定方法，其中的AnnealingBuffer的组成是20mmol/L Tris-AC,2mmol/L MgAc2, pH7.69。
4.利要求1所述的快速鉴定方法，其中四种食源性致病菌指的是沙门氏菌、金黄色葡 萄球菌、志贺氏菌和李斯特氏菌。
全文摘要
本发明公开了一种食源性致病菌快速鉴定的方法。该方法以沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和李斯特氏菌的基因组DNA为模板，通过基因库数据检索工具BLAST和ICB分别对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和李斯特氏菌进行同源性分析，结合应用焦磷酸测序技术进行对四种食源性致病菌的鉴定。本发明的检测方法具有高效性、快速、精准及操作简便等特点，为食源性致病菌的快速鉴定开辟了广阔的前景。
文档编号C12N15/11GK101875967SQ20091024503
公开日2010年11月3日 申请日期2009年12月23日 优先权日2009年12月23日
发明者兰青阔, 朱珠, 王永, 程奕, 赵新 申请人:天津市农业科学院中心实验室