专利名称：食源性致病菌检测试剂盒及检测方法
食源性致病菌检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种食源性致病菌检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
人类食用的食品种类繁多，通过食物所传播的病原体也各种各样，包括细菌、病毒、立克次体、产毒藻类、寄生虫及蕈等大型真菌等不同种类。日常生活中，细菌，特别是食源性致病菌污染的食品的误食用，导致的食品中毒事件最为常见。传统的食源性致病菌的检测，主要是采用细菌培养的方法，这种方法检测结果较准确，但是耗费时间长，操作步骤繁琐；此外，还可以采用实时荧光PCR法检测，此方法特异性强，但是一次实验只能检测一种病原目标物，同时检测大量的病原菌则不能很好地应付。 这两种方法在检测多种食源性致病菌时，往往都需要耗费较长的时间，这也延误了诊断和治疗的最佳时机。
发明内容基于此，有必要提供一种可以在短时间内检测多种食源性致病菌的食源性致病菌检测试剂盒及采用上述食源性致病菌检测试剂盒的食源性致病菌检测方法。一种食源性致病菌检测试剂盒，包括选自如下12组引物中的至少一组第1组引物用于扩增金黄色葡萄球菌的如SEQ ID NO. 1所示的核酸片段；第2组引物用于扩增沙门氏菌的如SEQ ID NO. 2所示的核酸片段；第3组引物用于扩增大肠杆菌0157:H7的如SEQ ID NO. 3所示的核酸片段；第4组引物用于扩增志贺杆菌的如SEQ ID NO. 4所示的核酸片段；第5组引物用于扩增单增李斯特菌的如SEQ ID NO. 5所示的核酸片段；第6组引物用于扩增蜡样芽孢杆菌的如SEQ ID N0. 6所示的核酸片段；第7组引物用于扩增小肠结肠炎耶尔森氏菌的如SEQ ID N0. 7所示的核酸片段；第8组引物用于扩增弧菌属的如SEQ ID N0. 8所示的核酸片段；第9组引物用于扩增副溶血弧菌的如SEQ ID N0. 9所示的核酸片段；第10组引物用于扩增霍乱弧菌的如SEQ ID NO. 10所示的核酸片段；第11组引物用于扩增梭状芽孢杆菌属的如SEQ ID NO. 11所示的核酸片段；第12组引物用于扩增弯曲杆菌的如SEQ ID N0. 12所示的核酸片段。优选的，所述第1组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 13所示，下游引物序列如 SEQ ID N0. 25 所示；所述第2组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 14所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 26所示；所述第3组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 15所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 27所示；
所述第4组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 16所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 28所示；所述第5组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 17所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 29所示；所述第6组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 18所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 30所示；所述第7组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 19所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 31所示；所述第8组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 20所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 32所示；所述第9组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 21所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 33所示；所述第10组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 22所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 34所示；所述第11组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 23所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 35所示；所述第12组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 24所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 36所示。优选的，还包括探针，所述探针为如下12个与所述12组引物对应的核酸片段至少一种第1个探针与如SEQ ID NO. 1所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0· 37 所示；第2个探针与如SEQ ID N0. 2所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 38 所示；第3个探针与如SEQ ID N0. 3所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 39 所示；第4个探针与如SEQ ID N0. 4所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 40 所示；第5个探针与如SEQ ID N0. 5所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 41 所示；第6个探针与如SEQ ID N0. 6所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 42 所示；第7个探针与如SEQ ID N0. 7所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 43 所示；第8个探针与如SEQ ID N0. 8所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 44 所示；第9个探针与如SEQ ID N0. 9所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 45 所示；第10个探针与如SEQ ID NO. 10所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID N0. 46所示；第11个探针与如SEQ ID NO. 11所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 47 所示；第12个探针与如SEQ ID NO. 12所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID NO. 48 所示。优选的，还包括固相载体，所述固相载体包括基体和固定在所述基体上的附着层， 所述探针固定在所述附着层上。优选的，所述探针的5'端连接有15个胸腺嘧啶。优选的，还包括PCR阳性质控探针、与所述PCR阳性质控探针互补的PCR阳性检测探针、用于扩增所述PCR阳性检测探针的PCR阳性检测探针引物对、杂交阳性质控探针以及与所述杂交阳性质控探针互补的杂交阳性检测探针；所述PCR阳性质控探针序列如SEQ ID NO. 49所示，所述PCR阳性检测探针的序列如SEQ ID NO. 50所示，所述PCR阳性检测探针引物对的上游引物序列如SEQ ID N0. 51所示，所述PCR阳性检测探针引物对的下游引物序列如SEQID N0. 52所示，所述杂交阳性质控探针的序列如SEQ ID N0. 53所示，所述杂交阳性检测探针的序列如SEQ ID N0. 54所示。一种食源性致病菌的检测方法，包括下述步骤步骤一、提取待测样品中的核酸；步骤二、扩增待测样品中的核酸得到核酸片段，所述核酸片段为如下核酸片段中的至少一种金黄色葡萄球菌的如SEQ ID NO. 1所示的核酸片段；沙门氏菌的如SEQ ID N0. 2所示的核酸片段；大肠杆菌0157 :H7的如SEQ ID N0. 3所示的核酸片段；志贺杆菌的如SEQ ID N0. 4所示的核酸片段；单增李斯特菌的如SEQ ID N0. 5所示的核酸片段；蜡样芽孢杆菌的如SEQ ID N0. 6所示的核酸片段；小肠结肠炎耶尔森氏菌的如SEQ ID N0. 7所示的核酸片段；弧菌属的如SEQ ID N0. 8所示的核酸片段；副溶血弧菌的如SEQ ID N0. 9所示的核酸片段；霍乱弧菌的如SEQ ID NO. 10所示的核酸片段；梭状芽孢杆菌属的如SEQ ID NO. 11所示的核酸片段；弯曲杆菌的如SEQ ID N0. 12所示的核酸片段；步骤三、用探针进行检测，所述探针与步骤二中的扩增产物特异性杂交。优选的，步骤二使用如下12组寡核苷酸片段的至少一组作为引物进行扩增所述第1组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 13所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 25所示；所述第2组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 14所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 26所示；所述第3组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 15所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 27所示；
所述第4组引物上游引物序列如SEQID N。．16所示，下游引物序列如SEQIDN。．28所示；
所述第5组引物上游引物序列如SEQID N。．17所示，下游引物序列如SEQIDN。．29所示；
所述第6组引物上游引物序列如SEQID N。．18所示，下游引物序列如SEQIDN。．30所示；
所述第7组引物上游引物序列如SEQID N。．19所示，下游引物序列如SEQIDN。．3l所示；
所述第8组引物上游引物序列如SEQID N。．20所示，下游引物序列如SEQIDN。．32所示；
所述第9组引物上游引物序列如SEQID N。．2l所示，下游引物序列如SEQIDN。．33所示；
所述第lo组引物上游引物序列如SEQID N。．22所示，下游引物序列如SEQIDN。．34所示；
所述第11组引物上游引物序列如SEQID N。．23所示，下游引物序列如SEQIDN。．35所示；
所述第12组引物上游引物序列如SEQID N。．24所示，下游引物序列如SEQIDN。．36所示。
优选的，步骤三中所述探针为具有如下序列的12个核酸片断中的至少一个
第1个探针与如SEQID N。．1所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDNO．37所示；
第2个探针与如SEQID N。．2所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDNO．38所示；
第3个探针与如SEQID N。．3所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDNO．39所示；
第5个探针与如SEQID N。．5所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDNO．41所示；
第6个探针与如SEQID NO．6所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDNO．42所示；
第7个探针与如SEQID N。．7所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDNO．43所示；
第8个探针与如SEQID N。．8所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDNO．44所示；
第9个探针与如SEQID NO．9所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDNO．45所示；
第lo个探针与如SEQID N。．10所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID NO．46所示；
第11个探针与如SEQ ID NO. 11所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 47 所示；第12个探针与如SEQ ID NO. 12所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID NO. 48 所示。优选的，步骤三中所述探针与所述扩增产物的杂交在固相载体上进行；所述固相载体包括基体和固定在所述基体上的附着层，所述探针固定在所述附着层上。根据多种食源性致病菌的基因保守区设计PCR扩增引物和探针，提取待测样品中的核酸片段并通过PCR扩增引物进行扩增，最后使用探针与扩增产物进行特异性结合， 检测样品中是否含有待检测的12种食源性致病菌中一种或几种，这种检测方法通量高、快速、灵敏以及特异性强。
图1为一实施方式的食源性致病菌的检测方法的流程图；图2为一实施方式的食源性致病菌的检测点阵示意图；图3为图2示检测点阵检测梭状芽孢杆菌属的检测结果示意图；图4为图2示检测点阵检测梭状芽孢杆菌属和弧菌属的检测结果示意图；图5为图2示检测点阵检测弧菌属、蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌0157:H7的检测结果示意图；图6为图2示检测点阵检测沙门氏菌、副溶血弧菌、弧菌属和大肠杆菌0157:H7的检测结果示意图；图7为图2示检测点阵检测弯曲杆菌、沙门氏菌、梭状芽孢杆菌属、弧菌属和小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测结果示意图。
具体实施方式下面主要结合附图和实施例对食源性致病菌检测试剂盒及检测方法做进一步的解释说明。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1设计和制备引物、探针通过对常见的12种食源性致病菌基因序列进行分析，选择相对保守的序列为靶向扩增序列，并根据该靶向扩增序列设计用于扩增该靶向扩增序列的PCR扩增引物和与该靶向扩增序列特异性结合的探针。12个靶向扩增序列及其对应的12组PCR扩增引物和12个探针如下所示第1个靶向扩增序列为金黄色葡萄球菌的如SEQ ID NO. 1所示的核酸片段，对应的上游引物序列如SEQ ID NO. 13所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 25所示，探针序列如 SEQ ID N0. 37 所示。第2个靶向扩增序列为沙门氏菌的如SEQ ID N0. 2所示的核酸片段，对应的上游引物序列如SEQ ID NO. 14所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 26所示，探针序列如SEQ ID NO. 38所示。第3个靶向扩增序列为大肠杆菌0157:H7的如SEQ ID NO. 3所示的核酸片段，对应的上游引物序列如SEQ ID NO. 15所示，下游引物序列如SEQ IDN0. 27所示，探针序列如 SEQ ID NO. 39 所示。第4个靶向扩增序列为志贺杆菌的如SEQ ID N0. 4所示的核酸片段，对应的上游引物序列如SEQ ID N0. 16所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 28所示，探针序列如SEQ ID N0. 40所示。第5个靶向扩增序列为单增李斯特菌的如SEQ ID N0. 5所示的核酸片段，对应的上游引物序列如SEQ ID N0. 17所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 29所示，探针序列如SEQ ID N0. 41 所示。第6个靶向扩增序列为蜡样芽孢杆菌的如SEQ ID N0. 6所示的核酸片段，对应的上游引物序列如SEQ ID N0. 18所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 30所示，探针序列如SEQ ID N0. 42 所示。第7个靶向扩增序列为小肠结肠炎耶尔森氏菌的如SEQ ID N0. 7所示的核酸片段，对应的上游引物序列如SEQ ID N0. 19所示，下游引物序列如SEQ IDN0. 31所示，探针序列如SEQ ID N0. 43所示。第8个靶向扩增序列为弧菌属的如SEQ ID N0. 8所示的核酸片段，对应的上游引物序列如SEQ ID N0. 20所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 32所示，探针序列如SEQ ID N0. 44所示。第9个靶向扩增序列为副溶血弧菌的如SEQ ID N0. 9所示的核酸片段，对应的上游引物序列如SEQ ID N0. 21所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 33所示，探针序列如SEQ ID N0. 45所示。第10个靶向扩增序列为霍乱弧菌的如SEQ ID NO. 10所示的核酸片段，对应的上游引物序列如SEQ ID N0. 22所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 34所示，探针序列如SEQ ID N0. 46所示。第11个靶向扩增序列为梭状芽孢杆菌属的如SEQ ID NO. 11所示的核酸片段，对应的上游引物序列如SEQ ID N0. 23所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 35所示，探针序列如 SEQ ID N0. 47 所示。第12个靶向扩增序列为弯曲杆菌的如SEQ ID N0. 12所示的核酸片段，对应的上游引物序列如SEQ ID N0. 24所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 36所示，探针序列如SEQ ID N0. 48所示。12个下游引物5'端标记有生物素，用于后续的呈色反应。12个检测探针5'端连接有15个胸腺嘧啶(T)，使得检测探针能够更好的伸展开来，有利于检测探针和扩增产物的杂交。上述引物和探针通过广州英韦创津生物科技有限公司合成。实施例2 食源性致病菌检测试剂盒及检测方法
检测试剂盒包括上述12组引物和12个探针。
11
在优选的实施例中，检测试剂盒还包括PCR阳性质控探针、与PCR阳性质控探针互补的PCR阳性检测探针、用于扩增PCR阳性检测探针的PCR阳性检测探针引物对、杂交阳性质控探针以及与杂交阳性质控探针互补的杂交阳性检测探针。PCR阳性质控探针序列如SEQ ID NO. 49所示，PCR阳性检测探针的序列如SEQ ID NO. 50所示，PCR阳性检测探针引物对的上游引物序列如SEQ IDN0. 51所示，PCR阳性检测探针引物对的下游引物序列如SEQ ID NO. 52所示，杂交阳性质控探针的序列如SEQ ID NO. 53 所示，杂交阳性检测探针的序列如SEQ ID NO. 54所示。PCR阳性检测探针引物对的下游引物和杂交阳性检测探针5'端标记有生物素， 用于后续的呈色反应。PCR阳性质控探针和杂交阳性质控探针5'端连接有15个胸腺嘧啶(T)，使得探针在96微孔板表面能够更好的伸展开来，有利于探针和扩增产物的杂交。如图1所示的食源性致病菌的检测方法包括如下步骤S10、提取待测样品中的核酸根据检测样品的不同，待测微生物培养扩增操作具体如下若是固态检体，先适当切碎、混合均勻后，取25g添加到已灭菌的培养基，充分混合后进行培养。若是粉状、粒状或其它易于粉碎的检体，可用已灭菌的药勺或其它方便使用的工具加以粉碎，并取25g添加到已灭菌的培养基，充分混合后进行培养。若是液态检体，可用振摇方式，使充分混合均勻后，取25g添加到已灭菌的培养基，充分混合后进行培养。若是冷冻检体，需解冻者，最好放置于冷藏温度下解冻，待检体解冻后，再予以适当切碎、混合均勻后，取25g添加到已灭菌的培养基，充分混合后进行培养。若是凝态或浓稠液态检体，经适当搅拌均勻后，取25g添加到已灭菌的培养基，充分混合后进行培养。参照 FDA(Food Sampling and Preparation of Sample Homogenate， BacterialAnalytical Manual Online，Chapter 1，http://www. cfsan. fda. gov/ ebam/
bam-l. html)，不同病原菌采用的培养基和培养条件如下
权利要求
1.一种食源性致病菌检测试剂盒，其特征在于，包括选自如下12组引物中的至少一组第1组引物用于扩增金黄色葡萄球菌的如SEQ ID NO. 1所示的核酸片段； 第2组引物用于扩增沙门氏菌的如SEQ ID NO. 2所示的核酸片段； 第3组引物用于扩增大肠杆菌0157:H7的如SEQ ID NO. 3所示的核酸片段； 第4组引物用于扩增志贺杆菌的如SEQ ID NO. 4所示的核酸片段； 第5组引物用于扩增单增李斯特菌的如SEQ ID NO. 5所示的核酸片段； 第6组引物用于扩增蜡样芽孢杆菌的如SEQ ID NO. 6所示的核酸片段； 第7组引物用于扩增小肠结肠炎耶尔森氏菌的如SEQ ID NO. 7所示的核酸片段； 第8组引物用于扩增弧菌属的如SEQ ID NO. 8所示的核酸片段； 第9组引物用于扩增副溶血弧菌的如SEQ ID NO. 9所示的核酸片段； 第10组引物用于扩增霍乱弧菌的如SEQ ID NO. 10所示的核酸片段； 第11组引物用于扩增梭状芽孢杆菌属的如SEQ ID NO. 11所示的核酸片段； 第12组引物用于扩增弯曲杆菌的如SEQ ID NO. 12所示的核酸片段。
2.如权利要求1所述的食源性致病菌检测试剂盒，其特征在于，所述第1组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 13所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 25 所示；所述第2组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 14所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 26 所示；所述第3组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 15所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 27 所示；所述第4组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 16所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 28 所示；所述第5组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 17所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 29 所示；所述第6组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 18所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 30 所示；所述第7组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 19所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 31 所示；所述第8组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 20所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 32 所示；所述第9组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 21所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 33 所示；所述第10组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 22所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 34 所示；所述第11组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 23所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 35 所示；所述第12组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 24所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 36 所示。
3.如权利要求1或2所述的食源性致病菌检测试剂盒，其特征在于，还包括探针，所述探针为如下12个与所述12组引物对应的核酸片段中的至少一个第1个探针与如SEQ ID NO. 1所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 37所示; 第2个探针与如SEQ ID NO. 2所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 38所示; 第3个探针与如SEQ ID NO. 3所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 39所示; 第4个探针与如SEQ ID NO. 4所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 40所示; 第5个探针与如SEQ ID NO. 5所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 41所示; 第6个探针与如SEQ ID NO. 6所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 42所示; 第7个探针与如SEQ ID NO. 7所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 43所示; 第8个探针与如SEQ ID NO. 8所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 44所示; 第9个探针与如SEQ ID NO. 9所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 45所示； 第10个探针与如SEQ ID NO. 10所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID NO. 46所示；第11个探针与如SEQ ID NO. 11所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 47所示；第12个探针与如SEQ ID NO. 12所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID NO. 48所
4.如权利要求3所述的食源性致病菌检测试剂盒，其特征在于，还包括固相载体，所述固相载体包括基体和固定在所述基体上的附着层，所述探针固定在所述附着层上。
5.如权利要求3所述的食源性致病菌检测试剂盒，其特征在于，所述检测探针的5'端连接有15个胸腺嘧啶。
6.如权利要求1所述的食源性致病菌检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR阳性质控探针、与所述PCR阳性质控探针互补的PCR阳性检测探针、用于扩增所述PCR阳性检测探针的PCR阳性检测探针引物对、杂交阳性质控探针以及与所述杂交阳性质控探针互补的杂交阳性检测探针；所述PCR阳性质控探针序列如SEQ ID NO. 49所示，所述PCR阳性检测探针的序列如 SEQ ID NO. 50所示，所述PCR阳性检测探针引物对的上游引物序列如SEQ ID N0. 51所示， 所述PCR阳性检测探针引物对的下游引物序列如SEQID N0. 52所示，所述杂交阳性质控探针的序列如SEQ ID N0. 53所示，所述杂交阳性检测探针的序列如SEQ ID N0. 54所示。
7.一种食源性致病菌的检测方法，其特征在于，包括下述步骤 步骤一、提取待测样品中的核酸；步骤二、扩增待测样品中的核酸得到核酸片段，所述核酸片段为如下核酸片段中的至少一种金黄色葡萄球菌的如SEQ ID NO. 1所示的核酸片段； 沙门氏菌的如SEQ ID N0. 2所示的核酸片段； 大肠杆菌0157:H7的如SEQ ID N0. 3所示的核酸片段； 志贺杆菌的如SEQ ID N0. 4所示的核酸片段； 单增李斯特菌的如SEQ ID N0. 5所示的核酸片段； 蜡样芽孢杆菌的如SEQ ID N0. 6所示的核酸片段；小肠结肠炎耶尔森氏菌的如SEQ ID NO. 7所示的核酸片段；弧菌属的如SEQ ID NO. 8所示的核酸片段；副溶血弧菌的如SEQ ID NO. 9所示的核酸片段；霍乱弧菌的如SEQ ID NO. 10所示的核酸片段；梭状芽孢杆菌属的如SEQ ID NO. 11所示的核酸片段；弯曲杆菌的如SEQ ID NO. 12所示的核酸片段；步骤三、用探针进行检测，所述探针与步骤二中的扩增产物特异性杂交。
8.如权利要求7所述的食源性致病菌的检测方法，其特征在于，步骤二使用如下12组寡核苷酸片段的至少一组作为引物进行扩增所述第1组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 13所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 25 所示；所述第2组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 14所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 26 所示；所述第3组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 15所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 27 所示；所述第4组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 16所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 28 所示；所述第5组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 17所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 29 所示；所述第6组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 18所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 30 所示；所述第7组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 19所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 31 所示；所述第8组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 20所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 32 所示；所述第9组引物上游引物序列如SEQ ID NO. 21所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 33 所示；所述第10组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 22所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 34 所示；所述第11组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 23所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 35 所示；所述第12组引物上游引物序列如SEQ ID N0. 24所示，下游引物序列如SEQ ID N0. 36 所示。
9.如权利要求7所述的食源性致病菌的检测方法，其特征在于，步骤三中所述探针为具有如下序列的12个核酸片断中的至少一个第1个探针与如SEQ ID NO. 1所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 37所示;第2个探针与如SEQ ID N0. 2所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 38所示;第3个探针与如SEQ ID N0. 3所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 39所示;第4个探针与如SEQ ID N0. 4所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 40所示;第5个探针与如SEQ ID NO. 5所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 41所示第6个探针与如SEQ ID NO. 6所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 42所示第7个探针与如SEQ ID NO. 7所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 43所示第8个探针与如SEQ ID NO. 8所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 44所示第9个探针与如SEQ ID NO. 9所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 45所示第10个探针与如SEQ ID NO. 10所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID NO. 46所示；第11个探针与如SEQ ID NO. 11所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQ IDN0. 47所示；第12个探针与如SEQ ID NO. 12所示的核酸片断特异性结合，序列如SEQID NO. 48所示
10.如权利要求7 9中任一项所述的食源性致病菌的检测方法，其特征在于，步骤三中所述探针与所述扩增产物的杂交在固相载体上进行；所述固相载体包括基体和固定在所述基体上的附着层，所述探针固定在所述附着层上。
全文摘要
本发明涉及一种食源性致病菌检测试剂盒，所述试剂盒包含12组引物及其探针，所述引物中，下游引物5′端均以生物素标记。所述试剂盒利用引物对待测样品中核酸进行扩增，形成的生物素化产物与固定于芯片表面的探针杂交形成探针-生物素化产物复合物。碱性磷酸酶-链霉亲和素偶联物与探针-生物素化产物复合物结合，再利用显色底物四唑硝基蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(NBT/BCIP)与碱性磷酸酶发生呈色(蓝紫色)反应。通过判读在特定位点是否呈色，来检测样品中是否含有待检测的致病菌。该试剂盒检测通量高、快速、灵敏以及特异性强，具有很强的实用性。本发明还提供一种采用上述检测试剂盒的食源性致病菌检测方法。
文档编号C12Q1/68GK102181545SQ20111009003
公开日2011年9月14日 申请日期2011年4月11日 优先权日2011年4月11日 公开号201110090034.0
发明者刘春晓, 史蕾, 孙杰, 庄卫东, 张巍, 徐云庆, 李永进, 杨泽, 杨燕秋, 莫秋华, 赵纯中, 赵芳, 顾大勇 申请人:深圳博尔美生物科技有限公司, 深圳国际旅行卫生保健中心