专利名称：一株产原儿茶酸的枯草芽孢杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌。
背景技术：
原儿茶酸广泛存在于无梗五加、荭草等常用中草药中，是一种水溶性酚酸成分，原儿茶酸有抗菌作用，体外试验时对绿脓杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、产碱杆菌及枯草杆菌和金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑菌作用；具有显著降低心肌耗氧量，提高心肌耐氧能力，减慢心率等药理作用，还有明显抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用。临床用于治疗慢性气管炎。常用生产方法由香草醛经碱熔、酸化而得。
发明内容
本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，可产生原儿茶酸，为原儿茶酸的获得提供微生物资源基础。本发明产原儿茶酸的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌WF17 (Bacillus subtilis WF17)，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为 2011年3月22日，保藏编号为CCTCC No =M 2011079 ；本发明枯草芽孢杆菌WF17为革兰氏阳性菌，杆状，细胞大小为长2. 0 3. 0 μ m，宽0. 7 0. 8 μ m，有鞭毛，有菌膜；在牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养，菌落呈圆形，颜色为白色(如图1)。本发明枯草芽孢杆菌WF17淀粉水解试验呈阳性，明胶液化试验呈阴性，接触酶试验呈阳性，酯酶试验呈阴性，甲基红试验呈阳性，V. P试验呈阳性，运动性试验结果为具有运动性。本发明枯草芽孢杆菌WF17 (Bacillus subtilis WF17)通过16S rDNA序列比对分析，与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis strain TCCCl 1002的16S rDNA序列的同源性最高，相似性为99 %，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定枯草芽孢杆菌WF17属于芽孢杆菌属(Bacillus)，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株。本发明枯草芽孢杆菌WF17可在牛肉膏蛋白胨培养基和PDA培养基上生长，枯草芽孢杆菌WF17的最适生长温度为37°C，最适合生长环境的pH值为7. 6，最适盐浓度为2%,为兼性厌氧菌。本发明枯草芽孢杆菌WF17能够产生原儿茶酸，其代谢产物具有较好的抑菌活性。本发明枯草芽孢杆菌WF 17 (Bacillus subtilis WF 17)属于芽孢杆菌属 (Bacillus)，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2011年3月22日，保藏编号为CCTCC No =M 2011079。
图1为本发明枯草芽孢杆菌WF17的菌落形态照片；图2为通过枯草芽孢杆菌WF17 和相近菌株的16S rDNA序列进行同源性比对构建的系统发育树图；图3为原儿茶酸对照品的HPLC色谱图，图4为具体实施方式
二中组分WF17b的HPLC色谱图，图5为具体实施方式
二中标准加入法后WF17b的HPLC色谱图。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式产原儿茶酸的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌 WF17 (Bacillus subtilis WF17)，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2011年3月22日，保藏编号为CCTCC No =M 2011079。本实施方式枯草芽孢杆菌WF17为革兰氏阳性菌，杆状，细胞大小为长2. 0 3. 0 μ m，宽0. 7 0. 8 μ m，有鞭毛，有菌膜；在牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养，菌落呈圆形，颜色为白色。参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》对枯草芽孢杆菌 WF17进行生理生化鉴定枯草芽孢杆菌WF17淀粉水解试验呈阳性，明胶液化试验呈阴性， 接触酶试验呈阳性，酯酶试验呈阴性，甲基红试验呈阳性，V. P试验呈阳性，运动性试验结果为具有运动性。本实施方式枯草芽孢杆菌WF17可在牛肉膏蛋白胨培养基和PDA培养基上生长，枯草芽孢杆菌WF17的最适生长温度为37°C，最适合生长环境的pH值为7. 6，最适盐浓度为 2%，为兼性厌氧菌。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
枯草芽孢杆菌WF17(BacilluS subtilisffF17)由中国黑龙江省帽儿山地区健康的北五味子植株的果实中筛选得到。筛选按以下步骤进行取健康北五味子植株的果实，用水冲洗干净；将清洗干净的北五味子果实依下列顺序进行表面消毒先由75 %酒精漂洗lmin，再由10 %双氧水漂洗15min，接着由 75%酒精漂洗lmin，最后由无菌水冲洗4次；然后置于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于37°C 恒温摇瓶培养1 3d，待培养基长出菌落后，挑取少量菌落转到牛肉膏蛋白胨固体培养基中进行倍比稀释纯化培养，即得到枯草芽孢杆菌WF17。阴性对照为了检查表面消毒是否彻底，把最后一次冲洗北五味子果实的无菌水用无菌的涂布棒涂布在牛肉膏蛋白胨固体培养基表面上，然后将消毒后的北五味子果实在牛肉膏蛋白胨固体培养基上滚动一周，以此做为阴性对照，于相同的条件下培养。经过多次重复，阴性对照平板均无任何菌落长出，证明北五味子果实表面消毒彻底，分离到的菌是北五味子内生细菌-枯草芽孢杆菌WF17，而不是植株表面的附生菌。对筛选得到的枯草芽孢杆菌WF17进行分子鉴定，按以下步骤进行提取菌株的基因组DNA，采用国际细菌鉴定通用引物进行，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后利用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，之后进行克隆、转化，筛选阳性克隆的菌落，经扩大培养后委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序公司进行测序。枯草芽孢杆菌WF17的16SrDNA序列长度为1600bp，将测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对，然后用软件构建系统发育树(如图2所示)，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis strainTCCCl 1002的16S rDNA序列的同源性最高，相似性为99%，通过结合菌体形态特征、 生长条件、生理生化鉴定结果确定枯草芽孢杆菌WF17属于芽孢杆菌属(Bacillus)，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株。
PCR引物购买自上海生工生物技术有限公司，其他试剂购自于大连宝生物工程有限公司。对本实施方式枯草芽孢杆菌WF17的发酵液进行抑菌活性测定，测定结果于表1所
7J\ ο表1枯草芽孢杆菌WF17发酵液对供试菌的抑菌活性测定结果
权利要求
1. 一株产原儿茶酸的枯草芽孢杆菌，其特征在于产原儿茶酸的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌WF17 (Bacillus subtilis WF17)，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2011年3月22日，保藏编号为CCTCC No =M 2011079。
全文摘要
一株产原儿茶酸的枯草芽孢杆菌，它涉及一株枯草芽孢杆菌。本发明提供了一株枯草芽孢杆菌，可产生原儿茶酸，为原儿茶酸的获得提供微生物资源基础。本发明产原儿茶酸的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌WF17，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2011年3月22日，保藏编号为CCTCC NoM 2011079。本发明枯草芽孢杆菌WF17能够产生原儿茶酸，其代谢产物具有较好的抑菌活性，该菌株的发现为原儿茶酸原料的获得可提供微生物资源基础。
文档编号C12N1/20GK102206600SQ20111008984
公开日2011年10月5日 申请日期2011年4月11日 优先权日2011年4月11日
发明者刘玉洁, 吴丹, 徐翠, 郑春英 申请人:黑龙江大学