专利名称：三种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属微生物检测领域，涉及一种沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌三重快速检测方法及其检测引物组和检测试剂盒。
背景技术：
沙门氏菌印/ )是公共卫生领域的重要致病菌，属革兰氏染色阴性肠杆菌。据统计在世界各国发生的细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首， 我国内陆地区所发生的细菌性食物中毒中也以沙门氏菌为首要原因。除引发食物中毒外， 该属的细菌还可以导致胃肠炎、伤寒和副伤寒等疾病。志贺氏菌5^)属革兰氏染色阴性肠杆菌，是人类细菌性痢疾最常见的病原菌。近年来，志贺氏菌I型的细菌性痢疾已发展为世界性流行趋势，我国至少在十余个省区发生了不同规模流行。金黄色葡萄球菌 {Staphylococcus aareM)隶属于葡萄球菌属，革兰氏染色呈阳性。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等， 甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。根据现行有效的国家标准和行业标准，几乎所有的食品均需对这三种食源性致病菌进行检测以排除其污染。常规检测采用传统培养方法，且每个致病菌需应用独立的检测方法单独进行检测，工作量大，检测周期长，且受到检测人员专业、经验等多种因素限制，容易出现误判。随着分子生物学方法在食品微生物检测中的逐步应用，致病菌的检测效率也逐步提升。但目前所采用的普通PCR方法和荧光PCR方法虽可提高检测效率，但对仪器设备要求较高，对检测人员的专业背景和检测能力也有一定要求，因此无法大范围的推广使用。LAMP方法是一种新型的恒温核酸扩增技术，该技术主要利用4种不同的特异性引物识别靶DNA上6个特定区域，并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(feiDNA)，在恒温条件下快速扩增核酸，保证了扩增的高特异性和高效率。由于LAMP独特的核酸扩增机制， 它的产物是由多重复靶序列的茎一环状DNA和花椰菜状DNA所组成的混合物，在琼脂糖凝胶电泳上会呈现出LAMP反应典型的阶梯状条带；同时，核酸大量生成时，从dNIPs中析出的焦磷酸根离子与反应体系中的Mg2+结合，产生肉眼可见的扩增反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀；另外，由于扩增产物大量生成，加入荧光染料(如Syber Green I、溴化乙锭、Gel Red 等)。因此LAMP扩增结果不但观察方式多样，且结果鉴定简单，非常适合高通量的快速检测。鉴于LAMP技术有众多优势，现已被逐渐应用于病原微生物的检测。如分支杆菌属、阪崎肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。但目前已有的方法只能在一个系统中针对某一种致病菌进行检测，在需要快速筛查多个致病菌时，需分别对其进行检测，仍有较大工作量。多重恒温核酸检测技术能在同一反应体系中，同一反应条件下，实现多个目的菌的快速筛查，具有广阔的应用前景。经国内外文献查询，尚未见有LAMP应用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌多重快速检测的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种三种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒。为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是本发明沙门氏菌的快速检测引物组的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列，下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列。本发明志贺氏菌的快速检测引物组的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列，下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列。本发明金黄色葡萄球菌的快速检测引物组的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列，下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列。本发明使用引物组对沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌进行多重快速检测的方法是将沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组和金黄色葡萄球菌的检测引物组与待测样品的DNA进行LAMP反应，反应结束后对反应液进行阴阳性判定，以确定样品中是否含有沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌中的任一种或任几种；其中，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列。进一步地，本发明所述LAMP反应按以下第一种方案或第二种方案进行 第一种方案所述LAMP反应在59. 5-62. 5°C下反应70_110min ；
第二种方案所述LAMP反应包含以下步骤
(1)先在59. 5-62. 5°C下反应 70-1 IOmin ；
(2)后在80°C下反应6-12min。进一步地，本发明在进行所述LAMP反应的反应液中，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0. 2-0. 3μΜ，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0. 2-0. 3μΜ，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0. 2-0. 3 μ Μ,并且，还包含有浓度为0. 6-0. 7 M的甜菜碱、浓度为 3. 8-5. 4mM的MgS04、10 % (体积)的IOXfeiDNA聚合酶缓冲液、浓度为0. 4-0. 6U/μ L的 feiDNA聚合酶、浓度各为0. 6-1. OmM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸。本发明快速检测试剂盒包括沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组、金黄色葡萄球菌的检测引物组、三种阳性对照品、Bs DNA聚合酶、10 Xfe DNA聚合酶缓冲液、 MgSO4溶液、甜菜碱溶液、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和无菌超纯水；所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 4 所示的序列，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列，所述三种阳性对照品分别为沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的标准菌株的基因组DNA。本发明快速检测试剂盒的LAMP反应液中，包含有沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组、金黄色葡萄球菌的检测引物组、甜菜碱、BstmA聚合酶、IOXfeiDNA聚合酶缓冲液、MgSO4溶液、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和无菌超纯水，其中，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0. 2-0. 3μΜ，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0. 2-0. 3 μ Μ，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.2-0. 3 μ Μ，所述甜菜碱的浓度为0.6-0. 7 Μ, MgSO4的浓度为 3. 8-5. 4mM, 10 % (体积)的IOXfeiDNA聚合酶缓冲液，feiDNA聚合酶的浓度为0. 4-0. 6U/ μ L，三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸的浓度各为0. 6-1. OmM。与现有技术相比，本发明的有益效果是
(1)本发明是根据已公开的沙门氏菌侵袭蛋白A (invA)基因序列、志贺氏菌侵袭性质粒抗原(ipaH)基因序列、金黄色葡萄球菌耐热核酸酶(nuc)基因序列，分析设计得到本发明的三重LAMP检测引物组。本发明的三重LAMP检测引物组特异性强，能准确检测沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA。(2)本发明能在同一反应体系中和同一反应温度条件下，实现同时对沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的快速检测，准确判断所检样品是否被沙门氏菌、志贺氏菌或金黄色葡萄球菌污染，大大提高实验室检测效率。(3)本发明的快速检测方法能快速高效扩增沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA目的片段，整个LAMP扩增过程最快可在70分钟内完成，扩增产物得率高，对上述三种致病菌的检测简便、准确。(4)在本发明的快速检测方法中，LAMP扩增反应可在恒定温度下完成，且允许的温度波动范围较大(士 1. 5°C )，因此对温控的仪器设备要求不高，水浴器或板式加热器均可满足要求。(5)本发明的快速检测方法灵敏度高，沙门氏菌的阳性扩增结果仅需10fg/yL目的菌基因组DNA，志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的阳性扩增结果均仅需lfg/yL目的菌基因组 DNA。(6)本发明的快速检测方法结果判定简便，且可根据实验室实际条件采用不同的结果判定方式，方法适应性较强。(7)与常规的平板培养法相比，本发明的快速检测方法可大大缩短检测周期，减少检测环节，从而降低因检测环节过多或人员技术水平和经验的差异造成的误判的几率，使检测结果更为准确可靠。
图1是对沙门氏菌LAMP反应产物进行测序的部分DNA序列。图2是对志贺氏菌LAMP反应产物进行测序的部分DNA序列。图3是对金黄色葡萄球菌LAMP反应产物进行测序的部分DNA序列。图4是多重扩增产物加入荧光染料后的观察结果。图5是多重扩增产物离心后沉淀的观察结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但并不对本发明做任何限定。实施例1 沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌三重LAMP快速检测Mg2+浓度测试本实施例的具体检测方法为
1、样品DNA的提取
1.1、将沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌标准菌株分别接种于营养肉汤， 360C 士 1°C培养18小时。1. 2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取上述培养产物中的细菌DNA。2、LAMP 反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 6所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反应体系
2. 2. 1、沙门氏菌的LAMP反应体系
应用不同的Mg2+浓度分别建立6组沙门氏菌LAMP反应体系，具体如下 各组反应体系的体积为25 μ L，分别包括浓度均为0. 25 μ M的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0. 25μΜ的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0. 25 μ M的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0. 65 M的甜菜碱，10 %(体积)的10 XfeiDNA聚合酶缓冲液，浓度为0. 5U/ μ L的feiDNA聚合酶，浓度各为 0. SmM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)，沙门氏菌基因组DNA模板IyL; 并且在以上6组反应体系中，MgSO4浓度分别为2. 2mM、3mM、3. 8mM、4. 6mM、5. 4mM、6. 2mM ；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。2. 2. 2、志贺氏菌的LAMP反应体系
应用不同的Mg2+浓度分别建立6组志贺氏菌LAMP反应体系，具体如下 各组反应体系的体积为25 μ L，分别包括浓度均为0. 25 μ M的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0. 25μΜ的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0. 25 μ M的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0. 65 M的甜菜碱， 10 % (体积)的IOXfeiDNA聚合酶缓冲液，浓度为0. 5U/ μ L WfeiDNA聚合酶，浓度各为 0. SmM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)，志贺氏菌基因组DNA模板IyL; 并且在以上6组反应体系中，MgSO4的浓度分别采用2. 2mM、3mM、3. 8mM、4. 6mM、5. 4mM、 6. 2mM ；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。2. 2. 3、金黄色葡萄球菌的LAMP反应体系
分别应用不同的Mg2+浓度分别建立6组金黄色葡萄球菌LAMP反应体系，具体如下 各组反应体系的体积为25 μ L，分别包括0. 25 μ M的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0. 25 μ M的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.25 μ M的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0.65 M的甜菜碱，10 % (体积)的IOXfeiDNA聚合酶缓冲液，浓度为0. 5U/ μ L WfeiDNA聚合酶，浓度各为0. 8mM 的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)，金黄色葡萄球菌基因组DNA模板IyL; 并且在以上6组反应体系中，MgSO4的浓度分别采用2. 2mM、3mM、3. 8mM、4. 6mM、5. 4mM、 6. 2mM ；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。2. 3、LAMP 反应条件
应用恒温水浴器，反应条件为先在61°C下反应90min ；后在80°C下反应6min。2. 4、结果观察
将以上反应液直接进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为0. 5XTBE、2. 0%琼脂糖凝胶、 150V电压条件下电泳30min，自动凝胶成像系统下成像观察结果。其中沙门氏菌扩增时， 当Mg2+浓度在3. 8-5. 4mM区间时，呈现出明亮的梯状电泳条带；志贺氏菌扩增时，当Mg2+浓度在3-6. 2mM区间时，呈现出明亮的梯状电泳条带；金黄色葡萄球菌扩增时，当Mg2+浓度在 3. 8-6. 2mM区间时，呈现出明亮的梯状电泳条带。综合三种目标菌检测时的Mg2+浓度范围， 确定该三重检测方法的最佳Mg2+浓度为3. 8-5. 4mM。实施例2 沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌三重LAMP快速检测反应温度测试本实施例具体检测方法如下
1、样品DNA的提取
1.1、将沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌标准菌株分别接种于营养肉汤， 360C 士 1°C培养18小时。1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上培养产物中的细菌 DNA。2、LAMP 反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 6所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反应体系
2. 2. 1、沙门氏菌的LAMP反应体系
应用不同的反应温度分别建立6组沙门氏菌LAMP反应体系，具体如下 各组反应体系的体积为25 μ L，分别包括浓度均为0. 25 μ M的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0. 25μΜ的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0. 25 μ M的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0. 65 M的甜菜碱，10 % (体积)的10 XfeiDNA聚合酶缓冲液，浓度为0. 5U/ μ L的Bstmk聚合酶，浓度各为0. SmM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)，浓度为4. 6mM的MgSO4,沙门氏菌基因组DNA模板1 μ L，以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。2. 2. 2、志贺氏菌的LAMP反应体系应用不同的反应温度分别建立6组志贺氏菌LAMP反应体系，具体如下 各组反应体系体积为25 μ L，分别包括浓度均为0. 25 μ M的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0. 25μΜ的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0. 25 μ M的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0. 65 M的甜菜碱， 10 % (体积)的IOXfeiDNA聚合酶缓冲液，浓度为0. 5U/ μ L WfeiDNA聚合酶，浓度各为 0. SmM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)，浓度为4. 6mM的MgSO4,志贺氏菌基因组DNA模板1 μ L，以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。2. 2. 3、金黄色葡萄球菌的LAMP反应体系
应用不同的反应温度分别建立6组金黄色葡萄球菌LAMP反应体系，具体如下 各组反应体系体积为25 μ L，分别包括浓度均为0. 25 μ M的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0. 25μΜ的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0. 25 μ M的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0. 65 M的甜菜碱， 10 % (体积)的IOXfeiDNA聚合酶缓冲液，浓度为0. 5U/ μ L WfeiDNA聚合酶，浓度各为 0. SmM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)，浓度为4. 6mM的MgSO4,金黄色葡萄球菌基因组DNA模板IyL;以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。2. 3、LAMP 反应条件
应用恒温水浴器，将本实施例的2. 2中所述6组沙门氏菌LAMP反应体系、6组志贺氏菌反应体系、6组金黄色葡萄球菌反应体系，分别先在6种不同温度下进行反应，所采用的温度分别为58. 50C>59. 5°C、61°C、62. 5°C>63. 5°C>64. 5°C，反应时间为 90min ；后再分别在 80°C下反应6min。2. 4、结果观察
将以上反应液直接进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为0. 5XTBE、2. 0%琼脂糖凝胶、 150V电压条件下电泳30min，自动凝胶成像系统下成像观察结果。其中沙门氏菌扩增时，当反应温度在59. 5-64. 5°C区间时，呈现明亮的梯状电泳条带；志贺氏菌扩增时，当反应温度在59. 5-63. 5°C区间时，呈现明亮的梯状电泳条带；金黄色葡萄球菌扩增时，当反应温度在 59. 5-62. 5°C区间时，呈现明亮的梯状电泳条带。综合三种目标菌检测时的温度范围，确定该三重检测体系的最佳反应温度为59. 5-62. 5°C。实施例3 三重LAMP快速检测对沙门氏菌的检测灵敏度本实施例的具体检测方法为
1、样品DNA的提取
1.1、将沙门氏菌标准菌株接种于营养肉汤，36 °C 士 1 °C培养18小时。1. 2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上培养产物中细菌DNA。2、LAMP 反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 6所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP的反应体系
建立9个反应管，各反应管中反应体系的总体积为25 μ L，包括浓度均为0. 25 μ M的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0. 25 μ M的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0. 25 μ M的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物， 浓度为0. 65 M的甜菜碱，10 % (体积)的IOXfeiDNA聚合酶缓冲液，浓度为0. 5U/ μ L的 feiDNA聚合酶，浓度各为0. SmM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)，浓度为4. 6mM的MgSO4 ；各反应管还需分别加入沙门氏菌基因组DNA模板液1 μ L，所用沙门氏菌基因组DNA模板液的浓度分别为IOng/μ L、lng/μ L、100pg/μ L、10pg/μ L、lpg/μ L、 lOOfg/yLUOfg/yLUfg/uL.O. lfg/yL,以测试该检测方法对沙门氏菌的检测灵敏度； 以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。2. 3、LAMP 反应条件
应用恒温水浴器，先在61°C下反应90min，后在80°C下反应6min。2. 4、结果观察
将以上各反应液直接进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为0. 5XTBE、2. 0%琼脂糖凝胶、 150V电压条件下电泳30min，自动凝胶成像系统下成像观察结果。通过对反应产物的电泳分析，当模板DNA液的浓度降至IOfg/ μ L时，仍可见较为明亮的梯状电泳条带。说明本发明方法对沙门氏菌DNA的检测灵敏度为IOfg/μ L。 实施例4 三重LAMP快速检测对志贺氏菌的检测灵敏度本实施例具体检测方法为 1、样品DNA的提取
1.1、将志贺氏菌标准菌株分别接种于营养肉汤，36°C 士 1°C培养18小时。1. 2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上培养产物中细菌DNA。2、LAMP 反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 6所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反应体系
建立9个反应管，各反应管反应体系总体积为25 μ L，分别包括浓度均为0. 25 μ M的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0. 25 μ M的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0. 25 μ M的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物， 浓度为0. 65 M的甜菜碱，10 % (体积)的IOXfeiDNA聚合酶缓冲液，浓度为0. 5U/ μ L的 feiDNA聚合酶，浓度各为0. SmM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)，浓度为4. 6mM的MgSO4 ；各反应管还需加入志贺氏菌基因组DNA模板液1 μ L，所用模板DNA液浓度分别为 IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、IOOfg/ μ L、IOfg/ μ L、lfg/μ L、0. lfg/μ L，以测试该检测方法对志贺氏菌的检测灵敏度；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。2. 3、LAMP 反应条件
应用恒温水浴器，先在61°C下反应90min，后在80°C下反应6min。2. 4、结果观察
将以上各反应液直接进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为0. 5XTBE、2. 0%琼脂糖凝胶、 150V电压条件下电泳30min，自动凝胶成像系统下成像观察结果。通过对反应产物的电泳分析，当模板DNA液的浓度降至lfg/μ L时，仍可见较为明亮的梯状电泳条带。说明本方法对志贺氏菌DNA的检测灵敏度为lfg/μ L。实施例5 三重LAMP快速检测对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度本实施例具体检测方法为
1、样品DNA的提取
1.1、将金黄色葡萄球菌标准菌株分别接种于营养肉汤，36°C 士 1°C培养18小时。1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA分别提取试剂盒提取以上培养产物中的细菌 DNA。2、LAMP 反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 6所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反应体系
建立9个反应管，各反应管反应体系总体积为25 μ L，包括0. 25 μ M的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0. 25 μ M的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0. 25 μ M的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0. 65 M的甜菜碱，10 %(体积)的10 XfeiDNA聚合酶缓冲液，浓度为0. 5U/ μ L的feiDNA聚合酶，浓度各为0. SmM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)，浓度为4. 6mM的MgSO4 ；各反应管还需加入金黄色葡萄球菌基因组DNA模板液1 μ L，所用金黄色葡萄球菌基因组DNA 模板液的浓度分别为 IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、IOOfg/ μ L、IOfg/ μ LUfg/μ L、0. lfg/μ L，以测试该检测方法对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。2. 3、LAMP 反应条件
应用恒温水浴器，反应条件为先在61°C下反应90min，后在80°C下反应为6min。2. 4、结果观察
将以上各反应液直接进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为0. 5XTBE、2. 0%琼脂糖凝胶、 150V电压条件下电泳30min，自动凝胶成像系统下成像观察结果。通过对反应产物的电泳分析，当模板DNA液的浓度降至lfg/μ L时，仍可见较为明亮的梯状电泳条带。说明本发明方法对金黄色葡萄球菌DNA的检测灵敏度为Ifg/μ L。
实施例6 三重LAMP快速检测的特异性、准确性分析本实施例具体检测方法为
1、样品DNA的提取
1. 1、将沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌标准菌株分别接种于营养肉汤， 360C 士 1°C培养18小时。1. 2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上培养产物中细菌DNA。1. 3、将三组DNA提取液按等体积比例混合，作为最终LAMP检测模板。2、引物的合成
分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 2 所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物具有如 SEQ No. 5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 6所示的核苷酸序列。用于对沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的三重LAMP产物进行PCR扩增和测序的引物详见表1。表1沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌三重LAMP产物测序引物
权利要求
1.一种沙门氏菌的快速检测引物组，其特征是其上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列，其下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列。
2.一种志贺氏菌的快速检测引物组，其特征是其上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列，其下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列。
3.一种金黄色葡萄球菌的快速检测引物组，其特征是其上游引物具有如SEQ No. 5 所示的序列，其下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列。
4.一种使用引物组对沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌进行多重快速检测的方法，其特征是将沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组和金黄色葡萄球菌的检测引物组与对待测样品的DNA进行LAMP反应，反应结束后对反应液进行阴阳性判定，以确定样品中是否含有沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌中的任一种或任几种；其中，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 2 所示的序列，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物具有如 SEQ No. 5所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是所述LAMP反应按以下第一种方案或第二种方案进行第一种方案所述LAMP反应在59. 5-62. 5°C下反应70_110min ；第二种方案所述LAMP反应包含以下步骤(1)先在59. 5-62. 5°C下反应 70-1 IOmin ；(2)后在80°C下反应6-12min。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征是在进行所述LAMP反应的反应液中，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0. 2-0. 3 μ M，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0. 2-0. 3 μ Μ，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0. 2-0. 3 μ Μ，并且，还包含有浓度为0. 6-0. 7 M的甜菜碱、浓度为3. 8-5. 4mM的MgS04、10 % (体积)的IOXfeiDNA聚合酶缓冲液、浓度为 0. 4-0. 6U/ μ L WfeiDNA聚合酶、浓度各为0. 6-1. OmM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸。
7.一种快速检测试剂盒，其特征在于包括沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组、金黄色葡萄球菌的检测引物组、三种阳性对照品、feiDNA聚合酶、IOXfeiDNA聚合酶缓冲液、MgSO4溶液、甜菜碱溶液、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、 三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和无菌超纯水；所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 5 所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列，所述三种阳性对照品分别为沙门氏菌、 志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的标准菌株的基因组DNA。
8.一种快速检测试剂盒，其特征在于其LAMP反应液中包含有沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组、金黄色葡萄球菌的检测引物组、甜菜碱、feiDNA聚合酶、 IOXfeiDNA聚合酶缓冲液、MgSO4溶液、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸，无菌超纯水，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0. 2-0. 3μΜ，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0. 2-0. 3 μ Μ，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.2-0. 3 μ Μ，所述甜菜碱的浓度为0.6-0. 7 M，MgSO4 的浓度为3. 8-5. 4mM, 10 % (体积)的IOXfeiDNA聚合酶缓冲液，feiDNA聚合酶的浓度为 0. 4-0. 6U/μ L，三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸的浓度各为0. 6-1. OmM。
全文摘要
本发明公开一种用于三种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒。沙门氏菌的快速检测引物组的上游引物具有如SEQNo.1所示的序列，其下游引物具有如SEQNo.2所示的序列；志贺氏菌的快速检测引物组的上游引物具有如SEQNo.3所示的序列，其下游引物具有如SEQNo.4所示的序列；金黄色葡萄球菌的快速检测引物组的其上游引物具有如SEQNo.5所示的序列，其下游引物具有如SEQNo.6所示的序列。利用上述检测引物组对待测样品中所提取的细菌的基因组DNA，在同一反应体系中进行LAMP反应，通过对反应产物的鉴定来判定样品中是否含有沙门氏菌、志贺氏菌或金黄色葡萄球菌。各检测引物组特异性强，能在同一反应体系中准确检测沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA。
文档编号C12Q1/68GK102206703SQ201110024340
公开日2011年10月5日 申请日期2011年1月23日 优先权日2011年1月23日
发明者姜侃, 张东雷, 李洪波, 汪新, 金燕飞, 黄建锋 申请人:李洪波, 浙江省质量技术监督检测研究院