一种高通量检测食源性致病菌的方法
【专利摘要】本发明提供了一种高通量检测食源性致病菌的方法，所述方法包括：采用针对多种致病菌标志性DNA序列的通用引物对对样品进行PCR扩增，从而获得所述致病菌的标志性DNA序列；使得所述致病菌的标志性DNA序列与分别针对所述致病菌标志性DNA序列的特异性捕获探针接触，获得带有不同可检测标记物的杂交产物；检测可检测标记物的信号以确定样品中致病菌的存在或数量。本发明还提供了用于检测致病菌的试剂盒。本发明的方法和试剂盒可准确快速、高通量地检测致病菌，具有易操作、特异性强、灵敏度高等优点，其应用前景广泛。
【专利说明】一种高通量检测食源性致病菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及食品检测、公共卫生和细菌学领域。具体而言，本发明涉及一种高通量、快速检测致病菌(优选食源性致病菌)的新方法。
【背景技术】
[0002]食源性疾病，包括食物中毒、肠道传染病、人畜共患传染病、肠源性病毒感染等，是当今最广泛的公共卫生问题之一，而引起这些食源性疾病的主要因子是致病细菌。要从根本上解决食品安全问题，就必须对食品的生产、加工、流通和销售等各环节实施全程管理和监控，这就需要大量能够满足这一要求的快速、方便、准确、灵敏的食品安全分析检测技术。
[0003]目前，食品检验检疫工作中的细菌鉴定主要方法有:传统的细菌分离培养和鉴定方法、PCR、Southern Blot杂交(即DNA印迹法)、ELISA等分子生物学和免疫学方法。
[0004]但是，传统检测方法操作繁琐、耗时费力，一般需要5天，有的甚至需要一个月的时间；ELISA方法虽然灵敏度高，但容易污染，出现假阳性；采用多重PCR技术，虽然可以达到对单一菌的快速、准确和方便的诊断目的，但在病原菌未明时，需要采用多种不同引物进行试验，这对病原菌的复杂性和PCR程序的多样性来说是不够理想的。
[0005]随着生物芯片技术的日趋成熟，高效、快速、准确、灵敏的生物芯片技术被应用到越来越多的领域，其中就包括食品微生物检测领域。液相芯片技术是新近开发出的新一代分子诊断技术平台，该平台既能保证信息质量，又能提供相对高通量的检测，其高通量、高精确性的特点提供了食源性细菌所需的多指标联合检测的思路。
[0006]目前最先进的技术是科学家韩健博士发明的Tem-PCR (target enrichedmultiplex PCR,祀序列富集多重PCR)技术与液相芯片检测技术的结合运用，该技术能在一次反应中对多种靶序列进行高度敏感和特异的扩增和检测，其主要原理是，针对待扩增的每一种靶序列，设计两对巢式的特异性`引物:F0，R0 ;Fi，Ri。其中的Fi和Ri引物带有一个能被通用的超级引物(Super Primer)识别的标签序列。巢式的祀序列特异性引物的浓度极低，用于在PCR的最初几个循环中富集目标序列。只有超级引物的浓度足以进行指数扩增，而且只有反向超级引物进行了生物素的标记。最后通过液相芯片检测平台输出信号，达到检测目的。该技术与普通PCR技术相比具有兼容性好、特异性强、效率超高、可半定量等优点，但是该技术也存在对所需DNA模板要求高、PCR反应时间长、敏感性不够强等缺点。
[0007]细菌rRNA按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构包含保守区及可变区。16S rDNA是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16S rRNA)的基因，其长度约为1500pb，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”。
[0008]在核糖体RNA(rRNA)特征序列中，经研究认为16S rRNA及其类似的rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适，其主要依据是:它们为细胞所共有；其功能同源且最为古老；既含有保守序列又含可变序列；分子大小适合操作；它的序列变化与进化距离相适应。依据16S rRNA序列绘制的生命进化树，卡尔?沃斯(Carl ffoese)将地球上的所有细胞生物划分为3个域(domain),即古生菌(Archaea,也称Archaebacteria)、细菌(Bacteria,也称Eubacteria)和真核生物(Eukarya)。16S rRNA序列分析作为微生物分类系统的主要依据也得到了广泛认同，随着微生物核糖体数据库的日益完善，该技术成为细菌分类和鉴定的一个有力工具。
[0009]关于16S rDNA的数据库信息及分析软件较其它分类鉴定用的基因丰富得多，如RDP (http://rdp.cme.msu.edu/html/)、ARB (http: //www.ard-home.de/)、ORS (http://soul, mikr0.biologie.tu-muenchen.de/ORS/)、OPD (http: //www.com.msu.eduOPD/)及PRIMROSE, CLUSTAL-X, PRIMER PREMIER、DNA START等，各分析软件因采用的算法不同而各有所长。
[0010]然而，本领域中尚未提供同时检测样品中多种致病菌的方法。本领域中仍然迫切需要开发出能够克服目前致病菌检测中的不足、高通量、快速检测多种致病菌的方法。
【发明内容】
[0011]本发明的主要目的就在于提供一种高通量、快速检测致病菌的方法，该方法具有特异性强、敏感性高、检测时间短等优点。本发明的另一个目的在于提供用于本发明方法的试剂盒，以及本发明的方法和试剂盒在致病菌检测中的应用。
[0012]在本发明的第一方面中，提供了一种获得样品中致病菌的标志性DNA序列的方法，所述致病菌为选自下组中的至少两种:大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimorium)、腊状芽抱杆菌(Bacillus cereus)、单增李斯特菌(L.monocytogenes)、小肠结肠耶尔森菌(Yersima enterocolitica)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni),所述方法包括:
[0013](i)获得针对SEQ ID NO:22所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和针对SEQ ID NO:23所示序列TGITGGGTTAAGTCCCGCAACGAG的通用下游引物；
[0014](ii)采用所述通用上游引物和通用下游引物对所述样品进行PCR扩增，从而获得所述致病菌的标志性DNA，其中，所述标志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包含所述一种或多种致病菌各自独有的特异性序列。
[0015]在一些优选例中，通过以上所述的PCR扩增方法获得的分别是SEQ ID NO: 16-21所示的标志性DNA序列。
[0016]在一些优选例中，所述通用下游引物的序列针对SEQ ID N0:24所示序列TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA。
[0017]在一些优选例中，所述通用上游引物的序列如SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:3所示；所述通用下游引物的序列如 SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:6 或 SEQID NO:7 所示。
[0018]在一些实施方式中，所述通用上游引物为与SEQ ID NO:22所示序列的15~17个连续核苷酸序列完全一致的序列；所述通用下游引物为与SEQ ID NO:23的15~23个连续核苷酸序列完全互补的序列。
[0019]在一些优选例中，所述通用下游引物为与SEQ ID NO:24所示序列TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA的15~23个连续核苷酸序列完全互补的序列。
[0020]在另一些实施方式中，所述通用上游引物为与SEQ ID NO:22所示序列的15~17个连续核苷酸序列完全互补的序列；所述通用下游引物为与SEQ ID NO: 23的15~23个连续核苷酸序列完全一致的序列。
[0021]在一些优选例中，所述通用下游引物为与SEQ ID NO:24所示序列TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA的15~23个连续核苷酸序列完全一致的序列。
[0022]在一些优选例中，所述致病菌的标志性DNA序列分别如下:a) SEQ ID NO: 16所示的大肠杆菌的标志性DNA序列；b)SEQ ID NO: 17所示的鼠伤寒沙门氏菌的标志性DNA序列；
c)SEQ ID NO: 18所示的蜡状芽孢杆菌的标志性DNA序列；d)SEQ ID NO: 19所示的单增李斯特菌的标志性DNA序列；e) SEQ ID NO: 20所示的小肠结肠耶尔森菌的标志性DNA序列；和
f)SEQ ID NO: 21所示的空肠弯曲杆菌的标志性DNA序列。 [0023]在本发明的第二方面中，提供了一种检测样品中致病菌的方法，所述致病菌为选自下组中的至少两种:大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimorium)、腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、单增李斯特菌(L.monocytogenes)、小肠结肠耶尔森菌(Yersima enterocolitica)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni),所述方法包括:
[0024](A)采用本发明所述的方法获得样品中所述致病菌的标志性DNA序列；
[0025](B)提供分别针对所述至少两种致病菌的标志性DNA序列的相应特异性捕获探针；
[0026](C)在杂交条件下，使所述致病菌的标志性DNA序列与所述特异性捕获探针接触，并且在所述接触之前、之时或之后用不同的可检测标记物标记所述特异性捕获探针或所述致病菌的标志性DNA序列与所述特异性捕获探针形成的复合物，获得带有不同可检测标记物的杂交产物；
[0027](D)检测连接到所述杂交产物上的可检测标记物的信号，以确定样品中各种待测致病菌的存在或数量。
[0028]在一些实施方式中，所述方法用于食品检验、食品加工过程检测、临床样品或化妆品检测，优选用于食品检疫。
[0029]在另一些实施例中，所述可检测标记物选自:编码微球、或其它载体(如荧光标记物、发光蛋白等)。
[0030]在另一些实施例中，所述方法还包括在步骤(A)之后，分离和/或纯化所述所述致病菌的标志性DNA序列、和/或将所述所述致病菌的标志性DNA序列与可检测标记物连接。在一些实施例中，所述可检测标记物是生物素、抗生物素、抗体、标记细胞或发光蛋白。
[0031]在一些实施方式中,所述样品来源于:食品、血液或尿液。
[0032]在另一些实施例中，所述样品是DNA样品或菌液。
[0033]在另一些实施例中，所述样品中可包含所述6种致病菌中的1、2、3、4、5或6种。
[0034]在另一些实施方式中，其特征在于，所述特异性捕获探针选自:
[0035]a)针对SEQ ID NO: 16所示大肠杆菌标志性DNA序列的特异性捕获探针；b)针对SEQ ID NO: 17所示鼠伤寒沙门氏菌标志性DNA序列的特异性捕获探针；c)针对SEQ IDNO: 18所示腊状芽孢杆菌标志性DNA序列的特异性捕获探针；d)针对SEQ ID NO: 19所示单增李斯特菌标志性DNA序列的特异性捕获探针；e)针对SEQ ID NO:20所示小肠结肠耶尔森菌标志性DNA序列的特异性捕获探针；和f)针对SEQ ID NO: 21所示空肠弯曲杆菌标志性DNA序列的特异性捕获探针。[0036]在另一些优选例中，所述特异性捕获探针的G/C为45~60%，优选50~55%。
[0037]在另一些实施例中，所述特异性捕获探针的长度为20_25bp，更优选22bp。
[0038]在另一些实施例中，所述特异性捕获探针的Tm值为40_60°C，优选52°C。
[0039]在另一些实施例中，所述特异性捕获探针的5’端将修饰或封闭，以便于与编码微球偶联。
[0040]在另一些实施例中，所述特异性捕获探针选自下组:
[0041]a) SEQ ID NO: 10所示的大肠杆菌的特异性捕获探针；
[0042]b) SEQ ID NO: 11所示的鼠伤寒沙门氏菌的特异性捕获探针；
[0043]c) SEQ ID NO: 12所示的蜡状芽孢杆菌的特异性捕获探针；
[0044]d) SEQ ID NO: 13所示的单增李斯特菌的特异性捕获探针；
[0045]e) SEQ ID NO: 14所示的小肠结肠耶尔森菌的特异性捕获探针；和
[0046]f) SEQ ID NO: 15所示的空肠弯曲杆菌的特异性捕获探针。
[0047]在另一些实施方式中，步骤(C)中的所述可检测标记物为编码微球，所述编码微球采用可产生不同可信号的标记物编码。
[0048]在一些实施例中，所述标记物选自:不同颜色的标记物或其不同比例的组合。在另一些实施例中，所述标记物`选自:不同颜色的荧光标记物、或不同比例的两种或两种以上的荧光标记物的组合。
[0049]在一些实施例中，所述编码微球与捕获探针偶联。在一些实施例中，所述偶联通过EDC法进行。在另一些实施例中，所述偶联是通过NHS偶联剂进行的。在另一些实施例中，所述微球是聚苯乙烯微球，并根据其表面带有的分子残基的不同，可以结合不同的探针分子。
[0050]在另一些实施方式中，步骤(D)中的所述检测采用选自下组的一种或多种系统或仪器:液相芯片检测系统、流式细胞仪或固相芯片。
[0051]在本发明的第三方面中，提供了一种用于检测致病菌和/或治疗致病菌感染的试剂盒，所述致病菌为选自下组中的至少两种:大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimorium)、腊状芽抱杆菌(Bacillus cereus)、单增李斯特菌(L.monocytogenes)、小肠结肠耶尔森菌(Yersima enterocolitica)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni),所述试剂盒包含:
[0052](i’)针对SEQ ID NO:22所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和针对SEQ ID NO:23所示序列TGITGGGTTAAGTCCCGCAACGAG的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物对所述样品进行PCR扩增，可获得所述致病菌的标志性DNA，其中，所述标志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包含所述一种或多种致病菌各自独有的特异性序列；
[0053](ii')针对所述致病菌的标志性DNA序列的相应特异性捕获探针、各种可检测标记物、或各种特异性捕获探针与可检测标记物的连接物；
[0054](iii’)一个或多个容器和/或包装物；
[0055](iv’ )任选的，PCR扩增用试剂；
[0056](V’ )任选的，用于连接所述特异性捕获探针和可检测标记物的试剂；
[0057](vi’ )任选的，检测信号用的试剂和/或仪器；[0058](vii’)任选的，使用说明书；
[0059](viii’)任选的，致病菌治疗剂。
[0060]在本发明的第四方面中，提供了下述物质在制备检测致病菌和/或治疗致病菌感染的试剂盒中的用途:
[0061]⑴针对SEQ ID NO:22所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和针对SEQ ID NO:23所示序列TGITGGGTTAAGTCCCGCAACGAG的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物对所述样品进行PCR扩增，可获得所述致病菌的标志性DNA，其中，所述标志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包含所述一种或多种致病菌各自独有的特异性序列；
[0062](ii)针对所述致病菌的标志性DNA序列的相应特异性捕获探针、各种可检测标记物、或各种特异性捕获探针与可检测标记物的连接物；
[0063](iii) 一个或多个容器和/或包装物；
[0064](iv)任选的，PCR扩增用试剂；
[0065](V)任选的，用于连接所述特异性捕获探针和可检测标记物的试剂；
[0066](vi)任选的，检测信号用的试剂和/或仪器；
[0067](vii)任选的，使用说明书；
[0068](viii)任选的，致病菌治疗剂。
[0069]在一些实施例中，所述可检测标记物是微球。
[0070]在本发明的其它方面中`，还提供了本发明上述方法和试剂盒在检测致病菌和/或治疗致病菌感染中的用途。
[0071]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0072]下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。
[0073]图1:针对16S rDNA基因的通用引物和特异性捕获探针的设计示意图。
[0074]图2:采用通用引物对(SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2)PCR扩增不同菌株的凝胶电泳图。
[0075]图3:采用通用引物对(SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4)PCR扩增不同菌株的凝胶电泳图。
[0076]图4:采用通用引物对(SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5)PCR扩增不同菌株的凝胶电泳图。
[0077]图5:采用通用引物对(SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:6)PCR扩增不同菌株的凝胶电泳图。
[0078]图6:采用通用引物对(SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:7)PCR扩增不同菌株的凝胶电泳图。
[0079]图7:采用通用引物对(SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9)PCR扩增不同菌株的凝胶电泳图。【具体实施方式】
[0080]本发明主要是为了克服目前致病菌(尤其是食源性致病菌)检测中的不足，提供一种高通量快速检测致病菌的方法，采用一对通用引物及特异性捕获探针设计，通过液相芯片实现信号输出的方法，可同时、快速检测多种致病菌。该方法高效、灵敏、特异性强、交叉反应少，克服多重PCR及荧光检测系统中存在的PCR反应引物设计繁琐及产生交叉反应等缺点。
[0081]本发明人开发的以16S rDNA PCR技术为核心的新型致病菌快速检测技术，只需采用一对通用引物就可以对多种不同细菌的16S rRNA特征信息进行扩增，获得的为包含多重性的16S rDNA信息的PCR产物。这种常规的PCR方法，可以在一个小时之内完成扩增反应。所获得的PCR产物，采用与特异性引物偶联的编码微球，用液相芯片检测系统(如Luminex200)，可以实现多重性和高通量的检测目标。
[0082]获得致病菌标志性DNA序列的方法
[0083]本发明中提供了一种获得样品中致病菌的标志性DNA序列的方法，所述致病菌为选自下组中的至少两种:大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimorium)、腊状芽抱杆菌(Bacillus cereus)、单增李斯特菌(L.monocytogenes)、小肠结肠耶尔森菌(Yersima enterocolitica)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni),所述方法包括:
[0084](i)获得针对SEQ ID NO:22所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和针对SEQ ID NO:23所示序列TGITGGGTTAAGTCCCGCAACGAG的通用下游引物；
[0085](ii)采用所述通用上游引物和通用下游引物对所述样品进行PCR扩增，从而获得所述致病菌的标志性DNA，其中，所述标志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包含所述一种或多种致病菌各自独有的特异性序列。
[0086]如本文所用，术语“标志性DNA序列”是指位于各种致病菌16S rDNA中、且可由本发明的通用引物对扩增获得的特定序列，所述序列的两端包含各菌共有的保守序列，而在该序列内部具有各种致病菌独有的特异性序列。在本发明的一些实施方式中，所述致病菌的标志性DNA序列分别如下:a)SEQ ID NO: 16所示的大肠杆菌的标志性DNA序列；b)SEQ IDNO: 17所示的鼠伤寒沙门氏菌的标志性DNA序列；c)SEQ ID NO: 18所示的腊状芽孢杆菌的标志性DNA序列；d)SEQ ID NO: 19所示的单增李斯特菌的标志性DNA序列；e)SEQ ID NO:20所示的小肠结肠耶尔森菌的标志性DNA序列jPf)SEQ ID NO:21所示的空肠弯曲杆菌的标志性DNA序列。 [0087]如本文所用，术语“特异性序列”或“可变区”可互换使用，均是指位于各种待测致病菌16S rDNA基因内部、各种待测致病菌独有的一段区域。通过分析和比较各种待测致病菌的16S rDNA序列可确定该特异性序列的存在和具体位置。通常，该特异性序列两端具有各种致病菌共有的保守序列。所述的特异性序列可用于区分致病菌的种类。
[0088]可采用序列比对、参考文献(液体芯片技术定量测定人体血清CEA、AFP、NSE 和 tPSA，粱惠仪等，J Mol Diagn Ther, 2010 年 7 月，Vol.2，N0.4 ;王嘉莉等；High-Throughput,Sensitive, and Accurate Multiplex PCR-Microsphere FlowCytometry System for Large-Scale Comprehensive Detection of Respiratory Viruses(以新技术平台Luminex快速检测具二甲氧基苯青霉素抗药性的金黃色葡萄球菌)2007年
5月 30 日提前公开? 10.1128/JCM.02501-06.2007，45(8):2626.DO1:J.Clin.Microbiol.JamesR.Prudent等)、实验验证等本领域常规技术确定适用于本发明方法的各待测致病菌的特异性序列或包含该序列的标志性DNA序列。关于16S rDNA的数据库信息及分析软件在本领域中是已知的，例如 RDP(http://rdp.cme.msu.edu/html/)、ARB(http://www.ard-home.de/)、ORS (http://soul.mikr0.biologie.tu-muenchen.de/0RS/)、OPD (http://www.com.msu.eduOPD/)及 PRMR0SE、CLUSTAL_X、PRMER PREMIER,DNA START 等，各分析软件因采用的算法不同而各有所长，这些数据库和软件均可用于本发明中。
[0089]如本文所用，术语“保守序列”或“共有序列”可互换使用，均是指各种致病菌的16SrRNA基因(16S rDNA)的标志性DNA序列中的一致序列。针对“保守序列”设计出的本发明的通用引物可用于扩增出各种待测致病菌的标志性DNA序列。为了实现通用扩增的目的，通常该保守序列位于可变区的两端。
[0090]如本文所用，术语“通用引物对”是指针对致病菌标志性DNA序列中的保守区域、可用于扩增出包含各种致病菌的特异性序列的致病菌标志性DNA序列的一对通用引物。正向通用引物通常针对标志性DNA序列的上游；反向通用引物通常针对标志性DNA序列的下游。
[0091]通用引物对的设计可根据本领域中常规的引物设计规则进行、采用已知的引物设计软件和/或由提供引物设计的公司提供专门的服务。本发明的通用上游引物和通用下游引物分别针对SEQ ID NO:22所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC (即单增李斯特菌16s rDNA的927 ~943bp)和针对 SEQ ID NO:23 所示序列 TGITGGGTTAAGTCCCGCAACGAG (即单增李斯特菌16s rDNA的1041~1064bp)。例如在本发明的一个实施例中，可采用SEQ ID NO:1或3的正向通用引物与SEQ ID N0:2、4、5、6或7的反向通用引物组合形成通用引物对。
[0092]在本发明的方法中，可采用本领域中已知的PCR方法和常规条件、采用本发明的通用引物对，对样品进行PCR扩增。也可对已知类型的菌种进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序，并将测序信息用于后续的特异性捕获探针设计。
[0093]致病菌检测方法
[0094]本发明中提供了一种检测致病菌的方法，所述方法包括:
[0095](A)采用如上所述的方法获得样品中所述致病菌的标志性DNA序列；
[0096](B)提供分别针对所述至少两种致病菌的标志性DNA序列的相应特异性捕获探针；
[0097](C)在杂交条件下，使所述致病菌的标志性DNA序列与所述特异性捕获探针接触，并且在所述接触之前、之时或之后用不同的可检测标记物标记所述特异性捕获探针或所述致病菌的标志性DNA序列与所述特异性捕获探针形成的复合物，获得带有不同可检测标记物的杂交产物；
[0098](D)检测连接到所述杂交产物上的可检测标记物的信号，以确定样品中各种待测致病菌的存在或数量。
[0099]如本文所用，术语“特异性捕获探针”或“捕获探针”可互换使用，均是指针对可能存在的某种致病菌在16S rDNA标志性DNA序列中的特异性序列设计的，从而可特异性捕获该种致病菌的16S rDNA扩增产物的探针。根据需要，本发明的捕获探针可带有或不带有标记物(如放射性、生物素、荧光标记物等)。可根据本领域中常规的探针设计规则设计探针，并人工合成探针。
[0100]在本发明的一些实施方式中，SEQ ID NO: 10~15的捕获探针序列分别特异性地针对并可分别捕获大肠杆菌、沙门氏菌、蜡状芽孢杆菌、李斯特菌、小肠结肠耶尔森菌和空肠弯曲杆菌的标志性DNA序列，更具体而言标志性DNA序列中的特异性序列。
[0101]可用各种可检测标记物与捕获探针连接，以使得被特定捕获探针捕获的序列上带有特定的标记，从而将特定可检测标记与特定菌的序列对应起来，便于区分不同的细菌。所述可检测标记物包括但不限于:编码微球、载体(例如荧光标记物、发光蛋白)等，优选编码微球。连接标记物和捕获探针的方法是本领域中所熟知的，本领域普通技术人员可根据所选的标记物对捕获探针或标记物进行修饰或改造，以得到两者可相互连接(例如可参见许艳军，厦门大学2008年硕士学位论文:液相芯片中羧基功能性聚苯乙烯微球的制备、表征及其在生物检测中的应用、及其所引用的参考文献等文献)。
[0102]如本文所用，术语“编码微球”是指具有不同可检测区分的特征(例如大小和/或颜色)、能与捕获探针偶联、并可被检测设备区分的各种微球。微球的材料可为:聚苯乙烯,如MultiAnalyte微球或SeroMap微球等。微球的直径可为20nm_200 u m,优选5~1011111，更优选5.611111。微球可用不同配比的染料(优选荧光染料)染成不同的颜色(如荧光色)，从而获得可多达数种、十数种、数十种、甚至百余种不同的编码微球。可通过市售途径获得编码微球，例如购自凯杰生物、BIO-RAD或根据需要自行设计和制备编码微球(例如可参考陈玮，液相芯片技术的原理与应用进展，成都医学院病理教研室，成都医院学报，2008 (3): 225-231，该文献以其全文纳入本文作为参考)。
[0103]本发明的捕获探针可经过修饰或改造具有适于与编码微球偶联的接头或基团，例如可在捕获探针的5’端连接AMB以用于进一步与编码微球连接。捕获探针与编码微球的偶联，可采用本领域中已知的方法进行(例如可参考韩卫宁等，液相芯片技术在核酸检测中的应用研究进展，现代预防医学，2008 (10): 1911-1915，该文献以其全文纳入本文作为参考)。例如在适合捕获探针上的接头或基团与编码微球上的相应结构连接或反应的条件下，混合和孵化捕获探针和编码微球。
[0104]在适当条件下，使采用通用引物对扩增得到的PCR产物与不同的捕获探针-编码微球偶联物杂交，以使得PCR产物带有来自编码微球的可检测信号。杂交条件可参照厂商提供的操作规程(例如Iuminex偶联试剂盒的标准操作规程进行)或本领域中的常规条件进行。
[0105]可采用本领域中已知的方法检测连接到所述PCR产物上的编码微球的信号，以测定致病菌的存在或数量。例如可采用荧光微球检测系统、流式细胞仪或固相芯片等。当检测到与特定致病菌的捕获探针偶联的特定编码微球信号时，表明被检测的样品中带有此种特定的致病菌。如需要的话，可通过编码微球信号的强弱测定样品中致病菌的数量。
[0106] 试剂盒及试剂的应用
[0107]本发明中还提供了一种用于检测致病菌的试剂盒，其包含:
[0108](i’)针对SEQ ID NO:22所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和针对SEQ ID NO:23所示序列TGITGGGTTAAGTCCCGCAACGAG的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物对所述样品进行PCR扩增，可获得所述致病菌的标志性DNA，其中，所述标志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包含所述一种或多种致病菌各自独有的特异性序列；
[0109](ii')针对所述致病菌的标志性DNA序列的相应特异性捕获探针、各种可检测标记物、或各种特异性捕获探针与可检测标记物的连接物；
[0110](iii’)一个或多个容器和/或包装物；
[0111](iv’)任选的，PCR扩增用试剂；
[0112](V’ )任选的，用于连接所述特异性捕获探针和可检测标记物的试剂；
[0113](vi’ )任选的，检测信号用的试剂和/或仪器；
[0114](vii’)任选的，使用说明书；
[0115](viii’)任选的,致病菌治疗剂。
[0116]本发明中进一步提供了采用本发明的方法或试剂盒检测致病菌和/或治疗致病菌感染中的用途。
[0117]本发明的优点
[0118]利用本发明的技术，可在4小时内对多种常见食源性致病菌及其混合物进行准确、快速检测；与传统的检测方法(细菌培养、生化鉴定、血清分型等)相比，新技术的特色和创新性主要体现在:可以直接用菌液或待检样品作为PCR模板进行快速多重PCR扩增，可同时对多种食源性致病菌进行高通量并行检测，一次实验即可得出全部结果，操作简便快速，特异性强、灵敏度高。
[0119]序列表说明
[0120]本发明序列表中序列号与具体序列之间的对应关系如下表所示:
[0121]
【权利要求】
1.一种获得样品中致病菌的标志性DNA序列的方法，所述致病菌为选自下组中的至少两种:大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimorium)、腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、单增李斯特菌(L.monocytogenes)、小肠结肠耶尔森菌(Yersimaenterocolitica)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni),所述方法包括: (i)获得针对SEQID NO:22所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和针对SEQID NO:23所示序列TGITGGGTTAAGTCCCGCAACGAG的通用下游引物； (ii)采用所述通用上游引物和通用下游引物对所述样品进行PCR扩增，从而获得所述致病菌的标志性DNA，其中，所述标志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包含所述一种或多种致病菌各自独有的特异性序列。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述通用上游引物为与SEQID N0:22所示序列的15~17个连续核苷酸序列完全一致的序列；所述通用下游引物为与SEQ ID NO:23的15~23个连续核苷酸序列完全互补的序列。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述通用上游引物为与SEQID N0:22所示序列的15~17个连续核苷酸序列完全互补的序列；所述通用下游引物为与SEQ ID NO:23的15~23个连续核苷酸序列完全一致的序列。
4.一种检测样品中致病菌的方法，所述致病菌为选自下组中的至少两种:大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimorium)、腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、单增李斯特菌(L.monocytogenes)、小肠结肠耶尔森菌(Yersimaenterocolitica)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni),所述方法包括: (A)采用权利要求1~3中任一项所述的方法获得样品中所述致病菌的标志性DNA序列； (B)提供分别针对所述至少两种致病菌的标志性DNA序列的相应特异性捕获探针； (C)在杂交条件下，使所述致病菌的标志性DNA序列与所述特异性捕获探针接触，并且在所述接触之前、之时或之后用不同的可检测标记物标记所述特异性捕获探针或所述致病菌的标志性DNA序列与所述特异性捕获探针形成的复合物，获得带有不同可检测标记物的杂交产物； (D)检测连接到所述杂交产物上的可检测标记物的信号，以确定样品中各种待测致病菌的存在或数量。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法用于食品检验、食品加工过程检测、临床样品或化妆品检测，优选用于食品检疫。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述特异性捕获探针选自: a)针对SEQID NO: 16所示大肠杆菌标志性DNA序列的特异性捕获探针； b)针对SEQID NO: 17所示鼠伤寒沙门氏菌标志性DNA序列的特异性捕获探针； c)针对SEQID NO: 18所示腊状芽孢杆菌标志性DNA序列的特异性捕获探针； d)针对SEQID NO: 19所示单增李斯特菌标志性DNA序列的特异性捕获探针； e)针对SEQID NO:20所示小肠结肠耶尔森菌标志性DNA序列的特异性捕获探针；和 f)针对SEQID NO: 21所示空肠弯曲杆菌标志性DNA序列的特异性捕获探针。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(C)中的所述可检测标记物为编码微球，所述编码微球采用可产生不同可信号的标记物编码。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(D)中的所述检测采用选自下组的一种或多种系统或仪器:液相芯片检测系统、流式细胞仪或固相芯片。
9.一种用于检测致病菌和/或治疗致病菌感染的试剂盒，所述致病菌为选自下组中的至少两种:大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimorium)、腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、单增李斯特菌(L.monocytogenes)、小肠结肠耶尔森菌(Yersimaenterocolitica)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni),所述试剂盒包含: (i’)针对SEQ ID NO:22所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和针对SEQID NO:23所示序列TGITGGGTTAAGTCCCGCAACGAG的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物对所述样品进行PCR扩增，可获得所述致病菌的标志性DNA，其中，所述标志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包含所述一种或多种致病菌各自独有的特异性序列； (ii')针对所述致病菌的标志性DNA序列的相应特异性捕获探针、各种可检测标记物、或各种特异性捕获探针与可检测标记物的连接物； (iii’)一个或多个容器和/或包装物； (iv’)任选的，PCR扩增用试剂； (v’)任选的，用于连接所述特异性捕获探针和可检测标记物的试剂； (vi’)任选的，检 测信号用的试剂和/或仪器； (vii')任选的，使用说明书； (viii’)任选的，致病菌治疗剂。
10.下述物质在制备检测致病菌和/或治疗致病菌感染的试剂盒中的用途: (i)针对SEQID NO:22所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和针对SEQ IDNO: 23所示序列TGITGGGTTAAGTCCCGCAACGAG的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物对所述样品进行PCR扩增，可获得所述致病菌的标志性DNA，其中，所述标志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包含所述一种或多种致病菌各自独有的特异性序列； (ii)针对所述致病菌的标志性DNA序列的相应特异性捕获探针、各种可检测标记物、或各种特异性捕获探针与可检测标记物的连接物； (iii)一个或多个容器和/或包装物； (iv)任选的，PCR扩增用试剂； (v)任选的，用于连接所述特异性捕获探针和可检测标记物的试剂； (vi)任选的，检测信号用的试剂和/或仪器； (vii)任选的，使用说明书； (viii)任选的，致病菌治疗剂。
【文档编号】A61K45/00GK103667251SQ201210322582
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月3日 优先权日:2012年9月3日
【发明者】王慧, 储瑞蔼, 谢东, 韩雪松, 周贤, 邱红玲, 李井泉, 尹珺, 王寿利, 王奕然 申请人:中国科学院上海生命科学研究院