利用多重pcr技术对食源性致病菌进行高通量快速检测的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用多重PCR技术对食源性致病菌进行高通量快速检测的方法，依据四种主要的食源性致病菌沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特菌以及大肠杆菌O157：H7的保守区序列设计出适用于进行多重PCR的引物，用多重PCR技术检测农产品中的主要食源性致病菌，该检测方法特异性好，与8种相似菌种无交叉反应，扩增出的条带清晰，灵敏度也较高，检出限均可以达到103copies/ml，而且快速、方便。本发明设计的引物与多重PCR体系可制成适于快速检测食源性致病菌的试剂盒，利用此试剂盒可以大大地缩短时间，提高检测的效率。
【专利说明】利用多重PCR技术对食源性致病菌进行高通量快速检测的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种利用多重PCR技术对食源性致病菌进行高通量快速检测的方法。
【背景技术】
[0002]在我国，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特菌、肠出血性大肠杆菌在环境中分布很广。然而，我国日常食用品检测标准多数只包括感官指标和理化指标，缺少微生物限量指标，在牛肉的食品卫生标准中只是规定了检测大肠杆菌菌群和沙门氏菌菌群计数检测，与国际标准要求差距很大。我国整体食品标准采用国际食品法典委员会(CAC)标准的只有12 %，采用国际标准化组织食品技术委员会标准的只有40 %，而且，在我国的国家标准中有80%为非强制性的推荐标准。
[0003]目前对与食品相关的食源性病菌的监测和疫情的确诊，主要采用病菌分离鉴定、血清学和分子生物学方法。
[0004]病菌分离鉴定:这种方法是最经典的病菌鉴定技术，比较可靠，但因为周期长，操作烦琐。
[0005]血清学方法:血清学诊断技术对于这些病的研究意义非常重大，目前实验室采用的有ELISA，HA/H1、琼扩等，多用于抗体检测，但这种检测方法只能针对单一血清型。HA/HI方法是目前检测的通用方法，但由于近年来重组菌株、变异株的出现，使得HI试验的交叉反应越来越明显,有时无法判定确切的血清亚型；另外,采用HI测定血清亚型，需要多个试验，操作烦琐；而且利用已知亚型血清无法检测出新的血清型，其应用受到了一定限制。琼扩试验(AGP)是利用抗原抗体在固体琼脂上可形成肉眼可见的沉淀线来判定样品中是否含有病菌或血清中是否有病菌抗体，此法虽然简单易行，但是敏感性稍差。间接免疫荧光试验也可应用于这些疾病的诊断，但是由于此种方法需要借助荧光显微镜，价格昂贵，只能局限于有条件的实验室，另外该方法存在较高的非特异性也使其应用受到了一定限制。
[0006]分子生物学诊断方法:为了提供有效的检测病原的方法，在过去的十几年，一系列的RT-PCR和实时RT-PCR已经被发展来检测不同的病原。然而，只有极少数方法用来同时检测几种病菌。比如多重PCR，但在同一反应管中进行多重PCR效果常常很差。
[0007]所有目前用的分子检测方法，尽管有用，但是，这些方法或者由于不能同时检测和定量样品中要检测的所有病原，或者因不够灵敏、不够简单，而不能在大规模的检测中应用。
[0008]进一步，高通量方法要面临污染的风险，这也是基于PCR方法所面临的共同问题。一些可利用的病原检测RT-PCR方法是基于多重PCR方法，来进行多个病原的检测，或者利用巢式PCR方法来增加灵敏度。这些方法的大部分用传统的凝胶电泳来检测扩增的病菌核酸。但这不适于大规模的常规检测。有人开发出酶联寡核苷酸吸附试验(PCR-ELISA)作为大规模扩增病菌核酸的检测系统，但样品必须仔细的处理，以避免PCR产品的污染。
[0009]传统食源性病原微生物定性、定量PCR检测技术每次只能对单一种的食源性病原微生物进行检测，而对于食源性病原微生物成分不明确的加工农产品中的食源性病原微生物成分，需要通过多种检测方法、进行多次实验才能确定，周期长，工作量大，成本高。在未来的加工农产品食源性病原微生物检测中，这两种检测技术已越来越不能胜任一次处理几种、十几种、几十种食源性病原微生物的特殊需要，尤其是大数量的加工农产品进入商品化生产时，需要有更有效的、快速的检测方法。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供一种利用多重PCR技术对食源性致病菌进行高通量快速检测的方法，用多重PCR技术检测农产品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特菌、肠出血性大肠杆菌，该检测方法特异性好，与8种相似菌种无交叉反应，扩增出的条带清晰，灵敏度也较高，检出限均可以达到103copies/ml,而且快速、方便。
[0011]为了达到以上目的，本发明的技术方案如下:
[0012]一种利用多重PCR技术对食源性致病菌进行高通量快速检测的方法，包括:
[0013]I)查找食源性致病菌沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特菌和大肠杆菌0157:H7的保守区序列；
[0014]2)针对待测食源性致病菌分别设计4组上下游引物对；
[0015]所述4组引物对的序列及相关参数为:
[0016]
【权利要求】
1.一种利用多重PCR技术对食源性致病菌进行高通量快速检测的方法，包括: 1)查找食源性致病菌沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特菌和大肠杆菌0157:H7的保守区序列； 2)针对待测食源性致病菌分别设计4组上下游引物对； 所述4组引物对的序列及相关参数为:
3)进行多重PCR反应； 进行所述的多重PCR反应的总体系为25~50μ 1，其中Tris-HCl，pH = 8.3, 1mM5KCl,50mM ；MgS04,1.5mM ；dNTP, 0.2 μ M ;步骤 2)的 4 组上下游引物各 0.8 μ M ；rTaq 酶，2U ;模板，0.25 μ I ;余量为灭菌的去离子水； 4)将步骤3)的产物用琼脂糖凝胶电泳检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中多重PCR反应的总体系为40 μ 1，其中 Tris-HCl，pH = 8.3，1mM ；KCl,50mM ；MgS04,1.5mM ;dNTP，0.2 μ M ;步骤 2)的 4组上下游引物各0.8 μ M ；rTaq酶，2U ;模板，0.25 μ I ;余量为灭菌的去离子水。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述的多重PCR反应条件为:94°C预变性 5min，94°C变性 30sec，58.0 ~64.(TC退火 40sec，72°C延伸 30sec，35 个循环。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的退火温度为62.1°C。
5.一种快速检测食源性致病菌的试剂盒，包括:阳性对照物，为沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特菌和大肠杆菌0157:H7的阳性对照质粒；阴性对照物TOC-18质粒;多重PCR反应体系，总体系为25~50μ 1，其中Tris-HCl，pH = 8.3，1mM ；KCl,50mM ；MgSO4,1.5mM ；dNTP, 0.2 μ M ;如权利要求1所述的4组上下游引物各0.8 μ M ;rTaq酶，2U ;余量为灭菌的去尚子水。
6.根据权利要求5所述的快速检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于，所述的多重PCR 反应体系，总体系为 40 μ 1，其中 Tris-HCl, pH = 8.3，1mM ；KCl,50mM ；MgS04,1.5mM ；dNTP，0.2 μ M ;如权利要求1所述的4组上下游引物各0.8 μ M ；rTaq酶，2U ;余量为灭菌的去离子水。
【文档编号】C12Q1/10GK104164510SQ201410410218
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月20日 优先权日:2014年8月20日
【发明者】赵凯, 周昌艳, 任方方, 赵笑, 索玉娟, 吴洋洋, 邵毅, 胡瑞丽, 沈源源, 金晓芬, 史斌, 宋美萱 申请人:上海市农业科学院, 上海科立特农产品检测技术服务有限公司