高通量str序列核心重复数检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种高效快捷的高通量STR序列核心重复数检测的方法，包括首先在已扩增到检测基片的STR序列簇上杂交一对检测引物，其中终引物上修饰荧光基团；随后利用核苷酸组合进行分步延伸，同时在每轮延伸后检测荧光信号，直至终引物上带荧光的碱基被聚合酶切除，信号消失为止；最终分析荧光信号的情况，得到相应的STR序列核心重复数。本发明采用通用的生物化学试剂，广泛适用于生物芯片及高通量测序等检测平台，且信噪比很高，明显提高了STR检测的准确性和对杂合STR的分辨率，同时其高通量特性使得该方法可以通过检测更多STR基因座得到更加确信的结果以及检测更多样本实现快速的群体STR检测。
【专利说明】高通量STR序列核心重复数检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及一种高效快捷的高通量STR序列核心重复数 检测方法。
【背景技术】
[0002] 十九世纪八十年代发现的DNA指纹图谱，开创了检测DNA多态性（生物的不同个 体或不同种群在DNA结构上存在着差异）的多种多样的手段，如RFLP(限制性内切酶酶切 片段长度多态性）分析、串联重复序列分析、RAPD(随机扩增多态性DNA)分析等等。各种 分析方法均以DNA的多态性为基础，产生具有高度个体特异性的DNA指纹图谱，由于DNA指 纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为当时最具 吸引力的遗传标记。
[0003] 1985年Jefferys博士首先将DNA指纹技术应用于法医鉴定。1989年该技术获美 国国会批准作为正式法庭物证手段。随着生物技术的发展，DNA聚合酶链式反应（PCR)技 术的出现使对样品量的需求大大降低，将分析目标集中到VNTR(可变数目串联重复）中的 较短的重复序列（STR)，使得较短的核酸片段也能够用于分析。后来进一步出现了多重PCR 技术，使STR基因分型检测在法医和刑侦中迅速推广。
[0004] 短串联重复序列又称简单重复序列（SSR)或微卫星DNA (microsatellite DNA)， 由2?6bp的核心序列组成，重复次数通常在15?30次。STR广泛存在于真核生物基因 组中。由于STR核心序列的重复次数存在个体间差异，具有高度多态性，因而被作为一种遗 传标记广泛地应用于植物、动物的种类鉴定中。在人类基因组中，STR分散在人的整个基因 组中，平均每15?20kb就存在一个STR基因座，约占人基因组的3%。STR标记还具有多 态性丰富、易于检测等特点，因此被广泛应用于人类遗传制图、基因定位、连锁分析、亲子鉴 定、罪犯鉴定和人类遗传研究等方面。
[0005] 目前通用的STR检测方法主要采用上世纪九十年代提出的分组多重扩增STR基因 座并通过荧光毛细管电泳对扩增片段长度进行检测，最后反馈出与核心重复数相应的荧光 峰位。其基本原理是利用基因座内等位基因长度的不同以及扩增的基因座之间片段长度范 围的不同，采用高分辨率的毛细管电泳技术进行分离。通常，对于每个基因座中一条引物进 行荧光标记，不同的基因座引物标记不同的荧光，结合扩增片段的迁移率和荧光的颜色，应 用基因序列分析仪及采用相应的分析软件可自动化检出复合扩增的众多STR基因座的所 有信息。
[0006] 根据上述的检测原理，不难判断，目前的STR检测方法具有如下的不足之处：（1) 检测反应基于第一代测序技术类似的荧光毛细管电泳法，该法的通量很低，无法对海量样 本进行大规模并行检测；(2)由于需要根据产物片段的长度对STR进行荧光分组，这意味着 该方法对检测的基因座有数量上的限制，难以通过增加待测STR序列的手段，进一步提高 生物学个体的识别率；（3)存在无效等位基因，致使不同的试剂盒有可能出现某些基因座 测定结果的差异；(4)由于是对片段长度的检测，对STR内部核心重复中的单核苷酸多态性 (SNP)位点无法检测出来。
【发明内容】
[0007] 发明目的：提供一种高效快捷的高通量STR序列核心重复数检测方法，以快速有 效地以较低成本对海量样本的多个STR序列进行大规模地并行检测，解决现有技术存在的 一个或多个问题。
[0008] 技术方案：一种高通量STR序列核心重复数检测方法，包括以下步骤：
[0009] A.将一对引物杂交到待测STR序列上，其中下游引物带荧光标记；
[0010] B.重复交替地加入核苷酸单体组合，利用具有5' 一 3'外切酶活性的DNA聚合酶 合成待测STR序列的互补链，每次加入核苷酸单体组合完成聚合反应后进行清洗，然后检 测荧光强度；
[0011] C.分析荧光信号的变化及信号变化发生的轮次，判断STR序列的杂合情况并计算 出核心重复数。
[0012] 其具体操作过程包括以下步骤：
[0013] (1)样本基因座STR序列的特异性扩增
[0014] 选取相应数量的STR序列，作为检测对象；通过多重PCR技术，将上述STR序列从 人类DNA样本的相应基因座上扩增出来；
[0015] 选取完待检STR序列后，根据STR序列中核心重复单元的序列信息来设计聚合时 的核苷酸单体组合以及设计多组STR序列同时检测的分组检测方案，同时还需要设计每种 STR序列相应的上下游检测引物并合成；
[0016] (2)检测基片上STR序列的固定及文库制备
[0017] 检测基片上的每一个反应位点上仅有唯一样本的同一种STR单链序列拷贝；
[0018] 上述STR单链序列拷贝可以直接固定于基片的固相载体表面，或者通过微媒介物 间接地先将单链序列拷贝固定在媒介物的表面，再将媒介物固定于检测基片的表面；
[0019] (3) STR序列核心重复数的检测实验
[0020] 检测反应进行前，首先读取芯片上每个反应位点上的STR序列所属的样本信息以 及基因座信息；
[0021] 随后加入混合后的上下游检测引物进行杂交，杂交完成后清洗并检测荧光；
[0022] 不断重复进行加入核苷酸单体组合聚合的操作，并在每次聚合完全后清洗及检测 荧光，直至整张反应基片上所有反应位点的荧光降低到下限阈值以下后结束检测；
[0023] (4)突光信号分析
[0024] 根据检测芯片上的每个反应位点在不同轮次下的荧光信号强度，找到荧光信号强 度发生衰减的反应轮次，根据该轮次及核苷酸单体组合方式推导出该位点上STR序列的核 心重复数；
[0025] 同时需要对荧光信号衰减率进行分析，判断该位点的STR序列是否为杂合并根据 二次荧光衰减得到另一条等位STR序列的核心重复数；
[0026] 最终，通过对检测芯片上海量位点的检测结果进行统计学分析，得到每个样本的 每条STR序列的核心重复数及其纯合比率。
[0027] 有益效果：本发明实现了 STR检测技术从现有检测平台向高通量检测平台的转 变，通过高通量地并行检测，极大程度的减少了单个样本的检测时间和成本。本发明适用于 多种高通量检测平台，既可以适用于便于现场检测的生物芯片技术，又可以应用于高通量 测序系统实现对大规模样本的高速检测。本发明的检测方法简单快速，检测中的操作仅有 延伸聚合、清洗和检测荧光三个步骤。涉及的生化反应少且反应间干扰小。本发明中的延 伸聚合反应采用非专利保护的天然dNTP单体组合，可以降低延伸的错误率，同时降低实验 的试剂成本。本发明在延伸反应时不存在常规检测方法中由于突光剪切带来的突光信号的 衰减，延伸反应可进行非常多轮次，可以检测多重复数的STR序列。本发明使用DNA聚合酶 自带的5'外切酶活性，将包含荧光基团的碱基整体切除。无需特意设计荧光的连接基团以 及剪切试剂或者是淬灭方案，采用普通的荧光引物即可。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1是本发明实施例中直接固定在生物芯片固相载体表面的STR序列示意图及其 功能分区。
[0029] 图中：101表不检测芯片的固相载体表面，102表不STR序列和固相载体表面的连 接基团，103表示一对扩增引物在STR序列上的位置，104表示一对检测引物在STR序列上 的位置，105表示STR序列中待检测的核心重复区域。
[0030] 图2是本发明实施例中通过磁珠媒介固定于高通量测序芯片上的STR序列在检测 过程中的示意图。图中合成链的延伸方向如图示从右向左。
[0031] 图中：201表不测序芯片的反应基面，202表不磁珠，203表不连接基团，204表不与 待检STR序列杂交的带荧光修饰的下游检测引物，205表示DNA聚合酶，206表示经之前轮 次的延伸聚合后已合成出的DNA链，207表示与待检STR序列杂交的上游检测引物。
[0032] 图3是本发明实施例中通过磁珠媒介固定于高通量测序芯片上的STR序列在检测 结束时荧光衰减的示意图。图中合成链的延伸方向如图示从右向左。
[0033] 图中：301表不测序芯片的反应基面，302表不磁珠，303表不连接基团，304表不被 聚合酶切除带荧光碱基后的下游检测引物，305表示DNA聚合酶，306表示经之前轮次的延 伸聚合后已合成出的DNA链，307表示与待检STR序列杂交的上游检测引物，308表示被聚 合酶切除并冲洗离开反应位点的带荧光碱基。
[0034] 图4a是本发明实施例中采用的物理区域分隔法将不同样本的多种STR序列拷贝 簇固定在检测基片上的示意图。
[0035] 图4b是图4a的区域放大图（含20个样本的区域）。
[0036] 图中：401表不检测基片的固相载体表面，402表不固相载体表面上某个样本的 STR拷贝簇构成的检测区域。
[0037] 图4c是图4b的区域放大图（含16个STR拷贝簇）。
[0038] 图4d是图4c的简化示意图。
【具体实施方式】
[0039] 结合如图1至图4d描述本发明高效快捷的高通量STR序列核心重复数检测方法。
[0040] 实施例1 :基于生物芯片平台的法医学身份识别STR检测
[0041] 该次实验为本发明在高通量芯片检测平台中的应用，可以实现数万个检测位点的 并行检测，相较于目前基于荧光毛细管电泳的96道并行检测，单次运行得到的检测结果大 幅增多，这同时意味着单样本的检测时间和检测成本的大幅下降。
[0042] 检测步骤为：
[0043](一）芯片上检测序列文库的制备：
[0044] 首先，从待检组织中提取出基因组DNA。选用如表1所示的16对扩增引物，对基因 组DNA中的相应基因座进行多重扩增。其中，Amelogenin为检测性别的基因座，其余15种 为不同的STR基因座。
[0045] 该次实验选取的待检STR序列为目前用于法医学身份鉴定的16个标准序列，但本 方法检测的序列种类并不局限于此，因为每个拷贝簇作为单独的检测位点，不存在位点间 的信号检测范围的相互交叠。
[0046] 表 1
[0047]
【权利要求】
1. 一种高通量STR序列核心重复数检测方法，其特征在于，包括以下步骤： A. 将一对引物杂交到待测STR序列上，其中下游引物带荧光标记； B. 重复交替地加入核苷酸单体组合，利用具有5' 一 3'外切酶活性的DNA聚合酶合成 待测STR序列的互补链，每次加入核苷酸单体组合完成聚合反应后进行清洗，检测荧光强 度； C. 分析荧光信号的变化及信号变化发生的轮次，判断STR序列的杂合情况并计算出核 心重复数。
2. 根据权利要求1所述的高效快捷的高通量STR序列核心重复数检测方法，其特征在 于：待测的STR序列簇固定于固相载体表面，其中所述固相载体表面包括测序流道或生物 芯片的基片，以及连接在检测基片上的媒介物的表面。
3. 根据权利要求1所述的高通量STR序列核心重复数检测方法，其特征在于步骤A之 前还包括步骤： A0.对需要检测的STR序列进行多重扩增，将待测STR序列直接或是通过媒介物扩增 并连接到检测基片表面。
4. 根据权利要求2所述的高通量STR序列核心重复数检测方法，其特征在于，所述的媒 介物包括磁珠、微珠、微柱、微粒及微槽中的至少一个。
5. 根据权利要求3所述的高通量STR序列核心重复数检测方法，其特征在于，将海量样 本的多个STR序列通过间隔区域编码或者插入测序标签的方法，实现高通量地并行检测。
6. 根据权利要求1所述的高通量STR序列核心重复数检测方法，其特征在于，步骤A中 所述的一对引物分别位于STR序列核心区域的上游和下游，将检测区域限定在STR核心区 域附近，减少反应和检测的轮次。
7. 根据权利要求1所述的高通量STR序列核心重复数检测方法，其特征在于，步骤A中 所述的下游引物上修饰的荧光标记位于下游引物5'端附近的碱基上。
8. 根据权利要求1所述的高通量STR序列核心重复数检测方法，其特征在于，步骤B中 所述的核苷酸单体组合为常用脱氧核糖核苷三磷酸中的一种或几种。
9. 一种高通量STR序列核心重复数检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1 )样本基因座STR序列的特异性扩增 选取相应数量的STR序列，作为检测对象；通过多重PCR技术，将上述STR序列从人类 DNA样本的相应基因座上扩增出来； 选取完待检STR序列后，根据STR序列中核心重复单元的序列信息来设计聚合时的核 苷酸单体组合以及设计多组STR序列同时检测的分组检测方案，同时设计每种STR序列相 应的上下游检测引物并合成； (2) 检测基片上STR序列的固定及文库制备 检测基片上的每一个反应位点上仅有唯一样本的同一种STR单链序列拷贝； 上述STR单链序列拷贝可以直接固定于基片的固相载体表面，或者通过微媒介物间接 地先将单链序列拷贝固定在媒介物的表面，再将媒介物固定于检测基片的表面； (3) STR序列核心重复数的检测实验 检测反应进行前，读取芯片上每个反应位点上的STR序列所属的样本信息以及基因座 信息； 加入混合后的上下游检测引物进行杂交，杂交完成后清洗并检测荧光； 不断重复进行加入核苷酸单体组合聚合的操作，并在每次聚合完全后清洗及检测荧 光，直至整张反应基片上所有反应位点的荧光降低到下限阈值以下后结束检测； (4)荧光信号分析 根据检测芯片上的每个反应位点在不同轮次下的荧光信号强度，找到荧光信号强度发 生衰减的反应轮次，根据该轮次及核苷酸单体组合方式推导出该位点上STR序列的核心重 复数； 对荧光信号衰减率进行分析，判断该位点的STR序列是否为杂合并根据二次荧光衰减 得到另一条等位STR序列的核心重复数； 最终，通过对检测芯片上海量位点的检测结果进行统计学分析，得到每个样本的每条 STR序列的核心重复数及其纯合比率。
【文档编号】C12Q1/68GK104152568SQ201410410187
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月19日 优先权日:2014年8月19日
【发明者】李俊吉, 陆祖宏, 涂景 申请人:东南大学