miRNA-199a在制备诊断试剂盒中的用途
【专利摘要】本发明公开了一种与人类肝癌相关的血液miRNA标志物及其应用。该标志物为exosome来源的miRNA-199a。本发明首先分离纯化了肝癌患者和肝脏良性疾病患者外周血中肿瘤源性exosome，并进行了miRNA芯片分析筛选出了上述表达差异的miRNA-199a，并且上述结论经过了QPCR验证。本发明的标志物及其检测试剂可用于制备诊断试剂盒，用于肝癌的早期诊断。
【专利说明】mi RNA-199a在制备诊断试剂盒中的用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程和医学诊断领域，具体涉及一种miRNA的用途，更具体的涉 及miRNA-199a在诊断肝癌方面的用途。
【背景技术】
[0002] 肝癌是世界上第五大常见的癌症，也是死亡率排行第三的癌症。80 %的肝癌常与 慢性乙型肝炎病毒和/或丙型肝炎病毒感染有关。如此高的致死率是因为缺乏敏感而特异 的无创性指标来进行早期诊断。由于早期肝癌症状不明显，通常在晚期才得以确诊，那时， 由于大多存在癌细胞肝内或/及肝外转移，病人已经丧失了手术切除病灶的机会。目前，肝 癌的诊断主要依赖于影像学上发现肝内肿物，包括超声、CT、核磁共振（MRI)等，同时结合 血清中的肿瘤标志物如AFP等。但是，这两种方法的敏感性及特异性都不是十分令人满意。
[0003] Exosomes是一种纳米级的小囊泡状结构，存在于血液或其他生物体液中。它形 成于众多细胞（包括树突状细胞和肿瘤细胞）的胞吐作用。Exosomes的外膜是由脂质双 分子层组成，其成分包含有选择性蛋白、mRNA和miRNA。在Exosomes中包含有大于120种 的miRNA, exosome中的miRNA可以影响干细胞变异（let-7)、器官形成（miR-1)、造血作用 (miR-181)、肿瘤发生（miR-17、miR-18、miR-19a、miR-20、miR-19b-l、miR-93-l)以及新陈 代谢。
[0004] miRNA是一类小的非编码的RNA，它们在细胞的增殖、分化及凋亡过程中发挥了重 要的作用。miRNA通过结合在靶mRNA的3'-非编码区的特异位点上来抑制翻译或使靶mRNA 降解。miRNA的失调可导致内环境的紊乱，最终导致肿瘤的发生。位于肿瘤相关的基因区 域或脆性位点的miRNA基因在肿瘤中常常会扩增或缺失，这意味着miRNA在恶变过程中发 挥了重要作用。miRNA可作为癌基因或抑癌基因，几乎所有的人类肿瘤中都可以发现miRNA 的失调。miRNA能以稳定的形式在人类的体液如血清、血浆中检测到，这使它有可能成为无 创的检查指标。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一在于提供一种能够用于诊断肝癌的新的miRNA标志物及其在 制备肝癌诊断试剂盒中的应用。
[0006] 本发明的目的之二在于提供上述miRNA标志物的检测试剂及其在制备肝癌诊断 试剂盒中的应用。
[0007] 本发明的目的之三在于提供一种检测上述miRNA标志物的方法。
[0008] 为了实现上述目的，本发明采取了如下的技术方案：
[0009] 本发明提供了 一种与人类肝癌相关的血液m i RNA标志物，所述标志物是血液 exosome来源的miRNA_199a，其序列信息如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 本发明还提供了与人类肝癌相关的血液miRNA标志物在制备诊断人类肝癌的试 剂盒中的应用，所述标志物是血液exosome来源的miRNA-199a，其序列信息如SEQ ID NO. 1 所示。
[0011] 本发明还提供了上述与人类肝癌相关的血液miRNA标志物的检测试剂。所述试剂 包括QPCR实验中使用的反转录引物和/或扩增引物；所述反转录引物为Oligo(dT)特异性 的RT引物；所述扩增引物的上游引物序列如SEQ ID N0. 2所示，所述扩增引物的下游引物 为通用反向引物。在本发明的一个具体的实施方案中，所述通用反向引物购自北京旷博生 物技术有限公司。
[0012] 本发明还提供了与人类肝癌相关的血液miRNA标志物的检测试剂在制备诊断人 类肝癌的试剂盒中的应用，所述试剂包括QPCR实验中使用的反转录引物和/或扩增引物； 所述反转录引物为Oligo(dT)特异性的RT引物；所述扩增引物的上游引物序列如SEQ ID NO. 2所示，所述扩增引物的下游引物为通用反向引物。在本发明的一个具体的实施方案中， 所述通用反向引物购自北京旷博生物技术有限公司。所述诊断试剂盒包含上述引物序列。
[0013] 本发明还提供了一种诊断人类肝癌的试剂盒，所述试剂盒包含与人类肝癌相关的 血液miRNA标志物的检测试剂，所述试剂包括QPCR实验中使用的反转录引物和/或扩增引 物；所述反转录引物为Oligo(dT)特异性的RT引物；所述扩增引物的上游引物序列如SEQ ID N0. 2所示，所述扩增引物的下游引物为通用反向引物。在本发明的一个具体的实施方案 中，所述通用反向引物购自北京旷博生物技术有限公司。
[0014] 优选地，本发明的诊断试剂盒还包含QPCR常用的试剂和酶，所述常用试剂包含 PCR反应缓冲液、核糖核酸酶抑制剂、dNTP等；所述酶包含M-MLV逆转录酶、poly A多聚酶。 还可以包括标准品和/或对照品。
[0015] 具体来说，本发明解决技术问题的技术方案包括：
[0016] (1)建立统一标准的标本库和数据库，以标准操作程序采集符合标准的血液样本， 系统收集完整的人口学资料和临床资料；
[0017] (2)血液中肿瘤源性exosome来源的miRNA差异表达谱分析：选择肝癌病例和肝 脏良性疾病患者的血液样本,收集肿瘤源性exosome来源的miRNA，进行芯片分析，筛选差 异表达的miRNA ;
[0018] (3)对已筛选的差异表达miRNA在大样本人群中进行定量分析。
[0019] 上述步骤（3)中的大样本定量分析可以采用RT-PCR、QPCR、Solexa测序技术、 Tapman low densityarray(TLDA)芯片检测等来完成。在本发明的具体的实施方案中，采用 QPCR进行验证。
[0020] 采用QPCR进行差异表达miRNA的验证，具体的操作步骤为：
[0021] (1)分离纯化血液中肿瘤源性的exosome ;
[0022] (2)提取样本总RNA ;
[0023] (3)将步骤⑵获得的RNA逆转录成cDNA ;
[0024] (3)在荧光实时定量PCR仪上将miRNA和参照基因进行扩增检测；
[0025] (4)通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，Λ Λ CT法进行相对定量。
[0026] 步骤⑴具体的操作为：
[0027] a.全血3000*g离心15min，移去细胞和细胞碎片；
[0028] b.取上层液体移入离心管，加入适量exoquick试剂，4°C下反应30min ;优选 250 μ 1血清中加入63 μ 1 exoquick试剂；
[0029] c. l5〇0*g 离心混合液 3〇min (exosome 沉于管下）；
[0030] d.吸出上清，离心1500*g 5min吸出所有上清（不能震动离心管）；
[0031] e.用250 μ 1 PBS溶解全部沉淀，-20°C保存。
[0032] 步骤（2)的具体实施方法为：
[0033] ①加入Trizol，室温保存5min ;
[0034] ②加氯仿0. 2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5min-10min ;
[0035] ③12000rpm高速离心15min后吸取上层水相（吸70% )到另一新离心管中，注 意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的_20°C预冷异丙醇，充分颠 倒混勻，置于冰上lOmin ;
[0036] ④12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按lml/ml Trizol的比例加入75% DEPC乙醇洗涤沉淀（4°C保存），洗涤沉淀物，振荡混合，4°C下12000rpm高速离心5min ;
[0037] ⑤弃去乙醇液体，室温下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉 淀；
[0038] ⑥用Nan〇dr〇p2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70°C。
[0039] 步骤（3)将RNA转录成cDNA可以采用加尾法或茎环法将总RNA中的miRNA反转 录成cDNA。
[0040] 加尾法的实验原理是：在小RNA3'末端由poly A聚合酶加上一段poly A尾巴，然 后用一个3'末端含有一段poly T的长引物将miRNA逆转录成cDNA，所得到的cDNA的长度 比较适合进行荧光定量PCR。
[0041] 茎环法的实验原理是：该方法应用了一个单一的茎环状的引物，避免对目的 miRNA进行加尾。反应过程分两步：首先，茎环状引物与目的miRNA分子的3'端结合，引物 3'端与miRNA3'端有6个互补配对的核苷酸，然后用逆转录酶将之逆转录成cDNA第一链。 其次是PCR反应。cDNA第一链的茎环状结构打开后链的长度增加了，以其为模板即可进行 传统的荧光定量PCR。茎环状引物的茎部为双链结构，防止引物与pre-miRNA或其他长链 RNA的杂交；茎部的碱基堆积增强了 miRNA和DNA异质双链的亲合力，提高了逆转录的效 率；且茎环状结构展开后增加了 miRNA的长度，为随后进行的PCR反应提供了合适的模板。
[0042] 在本发明的一个具体的实施方案中，使用加尾法将miRNA反转录成cDNA。具体操 作步骤为：将lOpg-Ιμ g的总RNA模板与2μ 1 10*缓冲液、2μ 1 dATP(10mM)、0· 5μ 1 polyA 多聚酶、〇· 5μ 1核糖核酸酶（RNase)抑制剂和无核糖核酸酶水（RNase free water)混合， 体积最后为20μ 1，37°C孵育lh。然后反应管中加入1μ 10. 1 Oligo(dT)特异性RT 引物，70°C孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打断RNA和引物的二级结构。最后，将上述 20 μ 1反应混合物与4 μ 1 5*缓冲液、1 μ 1 dNTP (10mM)，0. 5 μ 1 M-MLV逆转录酶，0. 5 μ 1核 糖核酸酶（RNase)抑制剂，10μ 1 polyA反应混合液和4μ 1无核糖核酸酶水（RNase free water)混合，42°C孵育lh。未稀释的cDNA模板保存在-20°C以备用。
[0043] 步骤⑷的具体实施方法为：采用25 μ 1反应体系，每个样本设置3个平行管，所 有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶 链式反应体系12. 5 μ 1，正向引物（5 μ Μ/μ 1) 1 μ 1，反向引物（5 μ Μ/μ 1) 1 μ 1，模板cDNA 2. 0μ1，无酶水8. 5μ1。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95°C 10min，（95°C 15s， 60°C 60s) *45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR 仪上进行PCR反应。扩增miRNA-199a的正向引物序列如SEQ ID NO. 1所示，反向引物为通 用反向引物（购自北京旷博生物技术有限公司）。以snRNA U6作为参照基因，其上游引物 序列为SEQ ID NO. 3所示；下游引物序列为SEQ ID NO. 4所示。
[0044] 本发明的优点和有益效果如下：
[0045] (1)血液中肿瘤源性exosome来源的miRNAs是一种新型生物标志物，区别于传统 生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异 性，该类小分子RNA生物标志物的成功开发有助于肝癌的辅助诊断，为其他疾病生物标志 物的研制提供借鉴。
[0046] (2)通过检测血液中肿瘤源性exosome来源的miRNAs的表达来诊断人类肝癌是否 发生的试剂盒是一种系统、全面的诊断和监测试剂盒，可用于肝癌患者的辅助诊断，有助于 反映肝癌患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防 治方案提供支持。
[0047] (3)采用严密的设计和评价体系，本发明人初期采用miRNA芯片对miRNAs进行分 析，且应用qRT-PCR的方法在大样本中进行了验证；以上方法和策略的应用加速和保证了 血液中肿瘤源性exosome来源的miRNAs生物标志物和诊断试剂盒的应用，也为其他疾病生 物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
【专利附图】
【附图说明】
[0048] 图1显不利用QPCR验证血液中肿瘤源性exosome来源的miRNA_199a的表达情 况；
[0049] 图2显示exosome来源和血液来源的miRNA-199a在肝癌患者、肝硬化和正常人的 表达情况，其中A :exosome来源的miRNA_199a ;B :血液来源的miRNA_199a ;
[0050] 图3显示利用R0C曲线分析miRNA_199a区分肝癌组和正常组时的敏感性和特异 性。
[0051] 具体的实施方式
[0052] 下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明， 并不意味着限制本发明的保护范围。
[0053] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0054] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0055] 实施例1与人类肝癌相关的miRNA的筛选
[0056] 1. 1样本的收集和样本资料的整理
[0057] 发明人于2013年1月在北京肿瘤医院收集了大量的肝癌患者和肝脏良性疾病患 者的外周血样本（用于研究的样本为同期收集、采样、分装、保存条件均一），通过对样本资 料的整理，发明人从中选择了 20例符合同医院、尽量同科室随机收集的肝癌病人血浆（乙 肝-肝硬化-肝癌）和20例同医院与实验组同一时期随机收集的肝脏良性疾病患者的血 浆，尽量避免采取有肝癌家族史人的血浆的样本进行miRNA芯片的检测。
[0058] 1. aniRNA 芯片检测
[0059] 1. 2. lexosome的分离与纯化
[0060] (1)全血3000*g离心15min，移去细胞和细胞碎片；
[0061] (2)取上层液体移入离心管，加入适量exoquick试剂，4°C下反应30min ;优选 250 μ 1血清中加入63 μ 1 exoquick试剂；
[0062] (3) l5〇0*g 离心混合液 3〇min (exosome 沉于管下）；
[0063] (4)吸出上清，离心1500*g 5min吸出所有上清（不能震动离心管）；
[0064] (5)用250 μ 1 PBS溶解全部沉淀，_20°C保存。
[0065] 1. 2. 2 总 RNA 的提取
[0066] ①加入Trizol，室温保存5min ;
[0067] ②加氯仿0. 2ml，用力振荡离心管，充分混勻，室温下放置5min-10min ;
[0068] ③12000rpm高速离心15min后吸取上层水相（吸70% )到另一新离心管中，注 意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的_20°C预冷异丙醇，充分颠 倒混勻，置于冰上l〇min ;
[0069] ④12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按lml/ml Trizol的比例加入75% DEPC乙醇洗涤沉淀（4°C保存），洗涤沉淀物，振荡混合，4°C下12000rpm高速离心5min ;
[0070] ⑤弃去乙醇液体，室温下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉 淀；
[0071] ⑥用Nan〇dr〇p2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70°C。
[0072] 1. 2. 3miRNA 芯片操作
[0073] miRNA芯片购自ABI公司，按照说明书的指示进行miRNA表达谱的检测。
[0074] 1. 2. 4 结果
[0075] 根据miRNA芯片的检测结果，发现肝癌患者肿瘤源性的exosome来源的 miRNA-26a、miRNA-29c、miRNA-199a的表达低于肝脏良性疾病患者，其中以miRNA-26a、 miRNA_29c差异最为明显。
[0076] 实施例2 QPCR验证差异表达的miRNA-199a
[0077] 根据miRNA芯片的检测结果选择miRNA-199a进行大样本QPCR验证。按照实施例 1中的样本收集和样本资料的整理的方式选择肝癌组和肝脏良性疾病组各100例样本。
[0078] 2. 1RNA提取过程同实施例1。
[0079] 2. 2 逆转录：将 10pg-l μ g 的总 RNA 模板与 2 μ 1 10* 缓冲液、2 μ 1 dATP (10mM)、 0. 5μ 1 polyA多聚酶、0. 5μ 1核糖核酸酶（RNase)抑制剂和无核糖核酸酶水（RNase free water)混合，体积最后为20μ 1，37°C孵育lh。然后反应管中加入Ιμ? 0.5yg/yl Oligo(dT)特异性RT引物，70°C孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打断RNA和引物的 二级结构。最后，将上述20μ1反应混合物与4μ1 5*缓冲液、Ιμ? dNTP(10mM)，0. 5μ1 M-MLV逆转录酶，0· 5 μ 1核糖核酸酶（RNase)抑制剂，10 μ 1 polyA反应混合液和4 μ 1无核 糖核酸酶水（RNase free water)混合，42°C孵育lh。
[0080] 2. 3QPCR反应：采用25 μ 1反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均 重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系 12. 5 μ 1，正向引物（5 μ Μ/μ 1) 1 μ 1，反向引物（5 μ Μ/μ 1) 1 μ 1，模板 cDNA 2. 0 μ 1，无酶水 8. 5μ1。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95°C 10min，（95°C 15s，60°C 60s)*45个 循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR 反应。扩增miRNA-199a的正向引物序列如SEQ ID NO. 1所示，反向引物为通用反向引物 (购自北京旷博生物技术有限公司）。以snRNA U6作为参照基因，其上游引物序列为SEQ ID NO. 3所示；下游引物序列为SEQ ID NO. 4所示。通过融解曲线分析和电泳确定目的条 带，Λ ACT法进行相对定量，结果如图1所示，与肝脏良性疾病患者相比，miRNA-199a在肝 癌患者血液中的含量低，同RNA-sep结果一致。
[0081] 实施例3分析miRNA对肝癌发病的诊断
[0082] 以exosome来源的miRNA-199a为研究对象，并与血楽游离的miRNA在对照组和肝 癌组敏感性和特异性上作比较。以肝癌病人为实验组、肝硬化病人和正常人作为对照组，首 先利用exoquic试剂来提取血楽中的exosome (步骤同实施例1)。选用40例肝癌血楽样本、 20例肝硬化病人和20例正常人血浆样本进行miRNA-199a QPCR实验，求得各标本CT值，利 用样本miRNA-199a CT值比U6 CT值做散点图（图2)，实验证明exosome组聚集性比血浆 组好，exosome组实验结果和之前肝癌组织与癌旁组织miRNA-199a表达趋势相同，而血楽 组不明显，exosome组肝癌病人血浆与正常人血浆中的miRNA-199a有统计学意义，利用R0C 曲线分析显示，miRNA-199a在区分肝癌组和正常组时，其AUC值为0. 7853,最佳临界点时的 敏感性为65%、特异性为63% (图3)，而血浆组肝癌病人血浆和肝硬化病人血浆组无统计 学差异。而实验结果显示exosome中miRNA作为潜在的诊断标志物的灵敏性和特异性都好 于血浆组。
[0083] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进 和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
[0084] 序列表 SEQUENCE LISTING <no>中国人民解放军总医院第一附属医院 <120> miRNA-199a在制备诊断试剂盒中的用途 <160〉 4 <170> Paicnlln version 3.3 <210> 1 <211> 22 、212> RNJA <213>人源 <400> 1 cccaguguuc agacuaccug uuc 23 <210> 2 <21 卜 22 <212> DNA <213>人工序列 <400> 2 cccagtgtic agactacctg ttc 23 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213>人丄序列
[0085] <400> 3 clcgcllcgg cagcaca 17 、210> 4 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <400> 4 aacgcttcac gaatttgcgt 20
【权利要求】
1. 一种与人类肝癌相关的血液m i RNA标志物，其特征在于，所述m i RNA标志物是 exosome来源的miRNA_199a，其序列信息如SEQ ID NO. 1所示。
2. 权利要求1所述的miRNA标志物的检测试剂，其特征在于，所述试剂包括QPCR实验 中使用的反转录引物和/或扩增引物；所述反转录引物为Oligo(dT)特异性的RT引物；所 述扩增引物的上游引物序列如SEQ ID NO. 2所示，所述扩增引物的下游引物为通用反向引 物。
3. 权利要求1所述的miRNA标志物在制备人类肝癌诊断试剂盒中的应用。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2所述的试剂。
5. 权利要求2所述的试剂在制备人类肝癌诊断试剂盒中的应用。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2所述的试剂。
7. -种人类肝癌诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包含权利要求2所述的试 剂。
8. 根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包含PCR反应常 用的试剂和酶。
9. 一种检测权利要求1所述的miRNA标志物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步 骤： (1) 分离纯化血液中肿瘤源性的exosome ; (2) 提取样本总RNA ; (3) 将步骤⑵获得的RNA逆转录成cDNA ; (4) 在荧光实时定量PCR仪上将步骤（3)获得的cDNA和参照基因进行扩增检测； (5) 通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，Λ ACT法进行相对定量。
10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述RNA逆转录成cDNA使用的引物序 列为Oligo (dT)特异性的RT引物；所述cDNA扩增引物的上游引物序列如SEQ ID NO. 2所 示，所述cDNA扩增引物的下游引物为通用反向引物。
【文档编号】C12Q1/68GK104152567SQ201410410093
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月19日 优先权日:2014年8月19日
【发明者】肖文华, 王硕, 屈雪玲, 李小梅, 董伟伟, 赵慧霞 申请人:中国人民解放军总医院第一附属医院