一种检测幽门螺杆菌耐药基因的方法和检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测幽门螺杆菌耐药基因的方法和检测试剂盒，该方法以待检样本基因组DNA为模板，用巢氏PCR外道引物进行PCR反应；再以巢式PCR的外道产物作为模板，用等位基因特异性引物作为内道引物进行PCR；内道PCR扩增后的产物在含溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶中电泳，并在紫外线透射仪下检查有无特异扩增条带；其中巢氏PCR外道引物序列如SEQ?ID?NO.1和2所示；内道引物序列如SEQ?ID?NO.3-9所示。所述试剂盒包括上述巢氏PCR外道引物和内道引物。本发明可以达到区别不同标本中是否存在耐药突变位点的目的。该方法具有高检出率、高敏感性、操作简便、无痛苦、无创伤性，病人的依从性较好。
【专利说明】一种检测幽门螺杆菌耐药基因的方法和检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及将巢氏PCR联合等位基因特异性引物扩增技术应用于人口腔唾液中幽门螺杆菌耐药基因的检测，属于消化道疾病中幽门螺杆菌的分子生物学检测的【技术领域】。
【背景技术】
[0002]慢性胃炎、胃十二指肠溃疡、胃癌、胃黏膜相关性淋巴样组织恶性瘤等的发病与幽门螺杆菌(Hp)的感染密切相关，因此根除Hp可以减少Hp相关疾病的发生和发展。近年来，Hp的耐药性呈全球性分布，且日趋严重，常导致根除治疗的失败。越来越多的耐药基因突变位点被发现(如Hp对克拉霉素耐药与23SrRNA基因A2142G、A2143G、A2144G和C2182T等点突变相关)，这些位点的存在无疑将为临床医师提供相当有价值的参考，帮助其了解患者所感染的菌株的情况，选择高效敏感的治疗药物和治疗方案。
[0003]目前，对于Hp耐药基因的检测主要依赖于通过胃内窥镜检查从获取的胃黏膜组织抽提基因组DNA，基于PCR为基础的及分子杂交的生物学方法。
[0004]大多数研究表明口腔可能是Hp的长期聚集地，口腔Hp感染与胃内Hp感染存在一定的相关性，有研究证实口腔Hp与胃内的Hp多为同一菌株，两者具有同源性，因此口腔Hp可能是胃内Hp感染的重要储存库。本发明以口腔唾液为检测对象，建立一种非侵入性的Hp耐药基因的检测方法，能够更好地指导临床用药。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种简单易行、非侵入性的幽门螺杆菌耐药基因的检测试剂盒。
[0006]本发明的技术方案是:为达到上述目的，本发明以口腔唾液为检测对象，采用巢氏PCR联合等位基因特异性引物扩增技术从人口腔唾液中扩增幽门螺杆菌的耐药基因。
[0007]上述技术方案中所说的以口腔唾液为检测对象，即从口腔唾液中抽提基因组DNA用于检测。
[0008]巢氏PCR的外道引物被用于扩增幽门螺杆菌的23S and 5S ribosomal RNAgenes (GenBank Access1n:N0.U27270)的 1962 ~2466bp,共 505bp。
[0009]巢氏PCR的内道引物即等位基因特异性引物被用来扩增幽门螺杆菌的23S and 5Sribosomal RNA genes (GenBank Access1n:N0.U27270)的 2122 ~2415bp,共 294bp。
[0010]本发明所述的检测幽门螺杆菌的耐药基因的方法，是用巢式PCR特异性外道引物扩增幽门螺杆菌23Sand 5S ribosomal RNA genes 中的23S rRNA基因的第 1962至2466bp，以巢式PCR的外道产物作为模板，用等位基因特异性引物作为内道引物来检测其耐药突变位点；该项反应体系由10倍浓缩的PCR扩增反应液、Taq DNA聚合酶、dNTP、内道引物、外道引物、双蒸水、待检样本基因组DNA、阴性对照标本和DNA抽提试剂盒组成；
[0011]其中巢氏PCR特异性外道和内道引物如下:
[0012]I)巢氏PCR外道引物
[0013]外道上游引物:23s1962-F 5’ -GCGTTGAATTGAAGCCCGAGTAAAC-3’ (SEQ ID N0.1)
[0014]外道下游引物:23s2466-R 5’ -CCGACTTTCGTCTCTGCTTGA-3’ (SEQ ID N0.2)
[0015]2)巢氏PCR内道引物
[0016]2142WT 23S 2142A-F 5’ -TCCTACCCGCGGCAAGACGGA-3J (SEQ ID N0.3)
[0017]2142MUT 23S A2142G-F 5，-TCCTACCCGCGGCAAGACGGG-3J (SEQ ID N0.4)
[0018]2143WT 23S 2143A-F 5’ -CCTACCCGCGGCAAGACGGAA-3J (SEQ ID N0.5)
[0019]2143MUT 23S A2143G-F 5’ -CCTACCCGCGGCAAGACGGAG-3J (SEQ ID N0.6)
[0020]2144WT 23S 2144A-F 5’ -TCCTACCCGCGGCAAGACGGAAA-3J (SEQ ID N0.7)
[0021]2144MUT 23S A2144G-F 5’ -TCCTACCCGCGGCAAGACGGAAG-3J (SEQ ID N0.8)
[0022]内道下游引物:23S 2415-R 5’ -GCCATTACACTCAACTTGCGATTTC-3’ (SEQ ID N0.9)
[0023]注:WT指野生株，MUT指突变型。
[0024]所述的引物浓度为10 μ M ;
[0025]所述的DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶，活性单位为8U/ μ L ;
[0026]10 倍浓缩的 PCR 扩增反应液为 1x Takara Taq TMBuffer (Mg2+pIus)；
[0027]所述的阴性样本为快速尿素酶和13C呼气试验阴性，且细菌培养阴性的标本；
[0028]所述的样本DNA 抽提试剂盒包括:3SColumn、2.0ml coll tube、Digest1nBuffer、Solut1n B> Wash Solut1n、Proteinase k、TE pH8.0。
[0029]本发明方法具体是以待检样本基因组DNA为模板，用巢氏PCR外道引物进行PCR反应；再以巢式PCR的外道产物作为模板，用等位基因特异性引物作为内道引物进行PCR ;内道PCR扩增后的产物在含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，并在紫外线透射仪下检查有无特异扩增条带；在相应的位置处，若出现亮光条带，则为阳性；若无条带，则为阴性。
[0030]本发明还公开了检测幽门螺杆菌的耐药基因的试剂盒，包括一套巢式PCR特异性外道引物和6套等位基因特异性的内道引物，反应体系由10倍浓缩的PCR扩增反应液、TaqDNA聚合酶、dNTP、内道引物、外道引物、双蒸水、待检样本基因组DNA、阴性对照标本和DNA抽提试剂盒组成；
[0031]所述的一套巢式PCR特异性外道引物和6套等位基因特异性的内道引物如下:
[0032]I)巢氏PCR外道引物，其序列如SEQ ID N0.1和2所示；
[0033]2)巢氏PCR内道引物；其序列如SEQ ID N0.3-9所示。
[0034]本发明利用巢氏RCR联合等位基因特异性引物扩增技术检测唾液中的幽门螺杆菌的耐药基因，具有便捷、特异性高、灵敏度高、无创伤等优点。通过对Hp耐药基因的突变进行筛查，在基因水平上了解菌株对根除治疗抗生素的耐药情况，对个体化用药、减少抗生素滥用具有重要的指导意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1是胃黏膜组织与口腔唾液中Hp耐药基因的检测结果的琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0036]除非特别说明，本发明中所使用的术语，一般为本领域普通技术人员通常理解的含义。
[0037]下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。在以下的实施案例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
[0038]实施例1
[0039]1、唾液的采集
[0040]获患者知情同意后，在上消化道症状准备进行胃镜检查之前，于清晨做胃镜前收集患者的口腔唾液。
[0041]2、抽提唾液中的基因组DNA
[0042]采用基因组DNA快速制备试剂盒(上海博彩生物科技有限公司)，从唾液中抽提基因组DNA，作为以下聚合酶链反应(PCR)扩增的模板。具体实验操作流程如下:
[0043](I)标本的处理
[0044]I) 25~10mg组织样品用手术刀切成小块，再用液氮碾碎，或用组织匀浆器匀浆。将粉末收集到1.5mL离心管中，用400 μ L Disgest1n Buffer悬浮。
[0045]2)取新鲜唾液lmL，加入2mL PBS (或生理盐水)，室温浸泡2_5h。
[0046](2)在按要求处理的样品中加入3 μ L Proteinase K,混匀，55°C保温10~60min。
[0047](3)高速室温12000转/分离心5min，将上清转移到1.5mL无菌离心管中，加入300 μ L Solut1n B,混匀。
[0048](4)将样品全部转移到3S柱,柱子放入2.0mL Collect1n Tube,盖上离心管盖，转移时用ImL Tip头取样品。
[0049](5)用台式离心机,12, 000转/分,室温Imin。
[0050](6)取下3S柱，弃去离心管中的废液。将柱子放回同一根离心管中，加入500μ LWash Solut1n, 12000r/min,室温离心 Imin0
[0051](7)重复步骤(6) 一次。
[0052](8)取下3S柱，弃去离心管中的废液。将柱子放回同一根离心管中，10000转/min，室温离心2min,以除去残留的Wash Solut1n。
[0053](9)在柱子中加入10yL的TE，将柱子加入新的干净1.5mL或2mL离心管中，室温37~55°C放置2min。12000r/min，室温离心lmin，收集管中的液体即为基因组DNA。根据用途，样品可以放4°C或_20°C保存。
[0054]3、巢氏PCR联合等位基因特异性引物扩增技术的建立
[0055](I)用巢氏PCR外道引物进行PCR反应
[0056]I)巢氏PCR外道引物
[0057]外道上游引物:23s1962-F 5’ -GCGTTGAATTGAAGCCCGAGTAAAC-3’ (SEQ ID N0.1)
[0058]外道下游引物:23s2466-R 5’ -CCGACTTTCGTCTCTGCTTGA-3’ (SEQ ID N0.2)
[0059]2)反应体系:10XPCR缓冲液5 μ 1，10 μ M dNTP 1.0 μ 1，外道上游引物1.0 μ 1，外道下游引物Ι.Ομ l，Taq DNA聚合酶I μ I，双蒸水40 μ I，唾液的基因组DNA I μ 1，共50 μ I。
[0060]3)反应条件:预变性 94°C 5min;变性 94°C 30s，退火 55°C 30s，延伸 72°C 30s，35个循环；延伸72°C 5min ;4°C保存。
[0061]4)巢式PCR外道产物DNA片段:幽门螺杆菌23S and 5S ribosomal RNA genes中的 23S rRNA 基因的第 1962 至 2466bp，共 505bp ;如 SEQ ID N0.10 所示。
[0062](2)用巢氏PCR的内道引物(即等位基因特异性引物)进行PCR反应
[0063]I)巢氏PCR内道引物
[0064]内道上游引物:
[0065]2142WT 23S 2142A-F 5’ -TCCTACCCGCGGCAAGACGGA-3J (SEQ ID N0.3)
[0066]2142MUT 23S A2142G-F 5，-TCCTACCCGCGGCAAGACGGG-3J (SEQ ID N0.4)
[0067]2143WT 23S 2143A-F 5’ -CCTACCCGCGGCAAGACGGAA-3J (SEQ ID N0.5)
[0068]2143MUT 23S A2143G-F 5’ -CCTACCCGCGGCAAGACGGAG-3J (SEQ ID N0.6)
[0069]2144WT 23S 2144A-F 5’ -TCCTACCCGCGGCAAGACGGAAA-3J (SEQ ID N0.7)
[0070]2144MUT 23S A2144G-F 5’ -TCCTACCCGCGGCAAGACGGAAG-3J (SEQ ID N0.8)
[0071]内道下游引物:23S 2415-R 5’ -GCCATTACACTCAACTTGCGATTTC-3’ (SEQ ID N0.9)
[0072]注:WT指野生株，MUT指突变型。
[0073]2)反应体系:10XPCR缓冲液2.5μ 1，10μΜ dNTP 1.0 μ 1，内道上游引物 1.0 μ 1，内道下游引物Ι.ομ l，Taq DNA聚合酶I μ I，双蒸水17.5 μ I，外道PCR产物I μ I，共25 μ I。为明确幽门螺杆菌的突变类型，每份唾液样本执行6管的内道PCR反应，用以确定是否为2142野生型、2142突变型、2143野生型、2143突变型、2144野生型和2144突变型。
[0074]3)反应条件:预变性 94°C 5min;变性 94°C 30s，退火 55°C 30s，延伸 72°C 30s，35个循环；延伸72°C 5min ;4°C保存。
[0075]4)得到幽门螺杆菌的23S and 5S ribosomal RNA genes (GenBank Access1n:N0.U27270)的 2122 ~2415bp，共 294bp，序列如 SEQ ID N0.11。其中 21_23bp “aaa” 为耐药基因2142-2144突变位点。
[0076]4、琼脂糖凝胶电泳
[0077]内道PCR扩增后的产物在含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，并在紫外线透射仪下检查有无特异扩增条带。图1显示口腔唾液中Hp耐药基因的检测结果(与胃黏膜组织的检测相对照)。
[0078]备注:加样顺序分别为:Maker、Twt2142 (胃黏膜组织2142野生株)、Tmut2142 (胃黏膜组织2142突变株)、Twt2143 (胃黏膜组织2143野生株)、Tmut2143 (胃黏膜组织2143突变株)、Twt2144(胃黏膜组织2144野生株)、Tmut2144(胃黏膜组织2144突变株)、Swt2142 ( 口腔唾液2142野生株)、Smut2H2 ( 口腔唾液2142突变株)、Swt2H3 ( 口腔唾液2143野生株)、Smut2143( 口腔唾液2143突变株)、Swt2144( 口腔唾液2144野生株)、Smut2144( 口腔唾液2144突变株)。
[0079]2142 突变株
[0080]分别在胃黏膜组织Tmut2142、Twt2143、Twt2144 出现条带，Twt2142、Tmut2143、Tmut2144位点未出现条带。唾液与胃黏膜的检测结果一致。此标本为2142单位点突变纯合株。
[0081]2143 突变株
[0082]分别在胃黏膜组织T1、T4、T5出现条带，T2、T3、T6位点未出现条带。唾液与胃黏膜的检测结果一致。此标本为2143单位点突变纯合株。
[0083]2144 突变株
[0084]分别在胃黏膜组织T1、T3、T6出现条带，T2、T4、T5位点未出现条带。唾液与胃黏膜的检测结果一致。此标本为2144单位点突变纯合株。
[0085]野生和突变混合株
[0086]快速尿素酶阳性的标本分别在胃黏膜组织Twt2142、Tmut2142、Twt2143、Tmut2143、Twt2144、Tmut2144均出现条带。唾液与胃黏膜一致性相同。
[0087]野生株
[0088]快速尿素酶阳性的标本分别在胃黏膜组织Twt2142、Twt2143、Twt2144均出现条带,而Tmut2142、Tmut2143、Tmut2144未出现条带。唾液与胃黏膜组织的检测条带一致。
[0089]阴性对照株
[0090]Hp阴性的标本在胃黏膜组织和口腔唾液均未出现条带。
[0091]由上图可示:同一标本胃黏膜组织与口腔唾液的突变检出基本一致，但从胃黏膜组织中扩增的条带比从口腔唾液中扩增的条带清晰，可能与胃黏膜组织中DNA的含量比唾液中DNA的含量高有关。
[0092]实施例2采集60例有上消化道症状且快速尿素酶试验阳性病人的唾液和胃黏膜组织。采用基因组DNA 快速制备试剂盒(上海博彩生物科技有限公司)，分别从唾液和胃黏膜组织中抽提基因组DNA，采用两种PCR法进行检测。第一种为普通PCR法，以唾液(或胃黏膜组织)中基因组DNA为模板，采用等位基因特异性引物直接进行PCR扩增。第二种为巢氏PCR法，即第一轮PCR以唾液(或胃黏膜组织)中基因组DNA为模板，采用巢氏PCR外道引物进行扩增；第二轮PCR以第一轮PCR产物为模板，采用等位基因特异性引物进行扩增。PCR结束后，普通PCR产物和巢氏PCR产物均在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，并用紫外线透射仪检查有无特异扩增条带，由此记录阳性/阴性结果。60位患者中，巢式PCR胃黏膜组织的检出率为92%，口腔唾液的检出率为80% ;普通PCR组织的检出率62%，口腔唾液的检出率为63%，因此巢式PCR的检出率明显高于普通PCR的检出率，且胃黏膜组织的检出率大于口腔唾液的检出率。
[0093]表160例胃黏膜组织中Hp耐药基因的检出情况
【权利要求】
1.一种检测幽门螺杆菌的耐药基因的方法，其特征在于:以待检样本基因组DNA为模板，用巢氏PCR外道引物进行PCR反应；再以巢式PCR的外道产物作为模板，用等位基因特异性引物作为内道弓丨物进行PCR ;内道PCR扩增后的产物在含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，并在紫外线透射仪下检查有无特异扩增条带；在相应的位置处，若出现亮光条带，则为阳性；若无条带，则为阴性；其中巢氏PCR特异性外道引物，其序列如SEQ ID N0.1和2所示；内道引物序列如SEQ ID N0.3-9所示。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:PCR反应体系由10倍浓缩的PCR扩增反应液、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物、双蒸水、待检样本基因组DNA、阴性对照标本和DNA抽提试剂盒组成。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于所述的TaqDNA聚合酶，活性单位为8υ/μ L。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于10倍浓缩的PCR扩增反应液为1xTakara Taq TMBuffer (Mg2+ plus)。
5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于.所述的阴性样本为快速尿素酶和13C呼气试验阴性，且细菌培养阴性的标本。
6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于所述的DNA抽提试剂盒组成为:3SColumn、2.0ml coll tube、Digest1n Buffer、Solut1n B、Wash SoIut1nΛProteinasek、TE pH8.00
7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于PCR反应DNA的扩增条件如下: 1)反应体系:10XPCR缓冲液5μ1，10μΜdNTP 1.0 μ 1，外道上游引物1.0 μ 1，外道下游引物Ι.Ομ l，Taq DNA聚合酶I μ 1，双蒸水40 μ I，唾液的基因组DNA 1μ1，*50μ1; 2)反应条件:预变性94°C5 min;变性94°C 30s，退火55°C 30 s，延伸72°C 30s, 35个循环；延伸72 °C 5 min ;4°C保存。
8.—种检测幽门螺杆菌的耐药基因的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括:一套巢式PCR特异性外道引物和6套等位基因特异性的内道引物，反应体系由10倍浓缩的PCR扩增反应液、Taq DNA聚合酶、dNTP、内道引物和外道引物、双蒸水、待检样本基因组DNA、阴性对照标本和DNA抽提试剂盒组成； 所述的一套巢式PCR特异性外道引物和6套等位基因特异性的内道引物如下: 1)巢氏PCR外道引物，其序列如SEQID N0.1和2所示； 2)巢氏PCR内道引物；其序列如SEQID N0.3-9所示。
【文档编号】C12Q1/68GK104164509SQ201410410194
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月19日 优先权日:2014年8月19日
【发明者】季旻珺, 焦健华, 普汉明, 骆晓凤, 屈保进, 钱明芳, 杨丙雅, 侯敏 申请人:南京医科大学