食源性致病菌检测的复合型基因芯片的制作方法

专利名称：：食源性致病菌检测的复合型基因芯片的制作方法
技术领域：
：本发明属于食品安全领域，涉及食源性致病菌检测的复合型基因芯片。技术背景食物中毒是指摄入了含有生物性、化学性有毒有害物质的食品或者把有毒有害物质当作食品摄入后出现的非传染性(不属于传染病)的急性、亚急性疾病。根据病原物质可将食物中毒分为细菌性、化学性、动物性、植物性、真菌性五大类毒，其中细菌性和化学性食物中毒最常见。细菌性食物中毒是指由于食入被病原菌或其毒素污染的食物后，所引起的以急性胃肠炎为主要中毒症状的疾病，它是食物中毒中最常见的一类。引起细菌性食物中毒的常见致病菌有副溶血性弧菌、沙门氏菌、葡萄球菌、大肠埃希菌、霍乱弧菌、单增李斯特菌、空肠弯曲菌、变形杆菌、蜡样芽孢杆菌和小肠结肠炎耶尔森菌等。近年来，国内外食物中毒导致的食品安全事件频频发生，对消费者的健康造成威胁。如何迅速查明引起食物中毒的原因，是处理公共卫生突发事件的重要环节；食品安全性检测技术是保障食品安全的重要技术手段。为了更好地保障人民的身体健康，将人员伤害、经济损失等降到最低，迫切需要建立食物中毒的快速检测技术平台，实现食品安全的"主动保障"。快速检测技术是一个国家食品安全科学发展的核心标志，也是一个国家食品安全监管能力的重要体现。近年来欧美等发达国家投入了大量资金对食品安全检测关键技术进行攻关，检测技术水平快速提高，并以此为基础对标准提出越来越高的要求，限制不达标的国外产品进入。因此，研制食物中毒的快速检测技术，是保障我国食品安全、应对贸易非关税技术壁垒的关键，意义尤其重大。目前，国内外对病原菌检验的"金标准"方法仍然是培养法。一般采集标本后需先进行增菌，出现阳性结果后，再分离单个菌落，进行直接镜检、分离培养、生化鉴定、血清学试验和动物实验等方法才能最终确诊。这些传统方法的周期长，如从分离过程中增菌步骤开始计算，目前的鉴定程序需五天以上；多菌种批量检测能力弱，易受细菌生理条件和抗生素使用的限制，而且不能用于目前还不能培养细菌或新菌种的鉴定，已难以适应当前快速发展的国际国内形势。因此，有必要开发一个可以大批量、快速检测若干种微生物或致病菌的检测方法，对食源性致病菌进行主动监测。近年来各种分子生物学技术如PCR、多重PCR、荧光定量PCR技术的建立已经极大地推进了微生物的检测与鉴定。但是高通量的、可同时对大量样本进行鉴定的方法仍是摆在研究者面前的一个难题。基因芯片技术是近年来发展起来的一种高新生物技术，是生命科学领域的一个基础性的平台技术。该技术是一种全新的反向固相杂交技术，与传统的以膜为介质的点杂交相比，由于使用了玻片这种刚性杂交载体，DNA以化学键的形式牢固地结合至经过活化处理的玻片表面，表现出极好的稳定性。该技术突出的特点是可以对多种靶基因同时检测和鉴定，表现出快速、高通量、平行化等其它技术无法比拟的优势；基因芯片还具有体积微小、易自动化和操作方便等优点，因此现在已经被广泛应用于生命科学的各个领域，譬如基因表达谱分析、基因突变及多态性分析、基因测序、新基因发现、基因功能分析、基因组文库作图、疾病预防、疾病诊断、耐药基因检测、新药开发与评价、毒物研究与评价、生物恐怖防范、食品安全和司法鉴定等。将基因芯片技术用于食源性致病菌检测的研究，在国内外正在受到高度重视。目前的食源性致病菌检测芯片根据探针的不同可以归纳为两大类，一类是寡核苷酸探针芯片，其探针长度一般为22-70mer，此类芯片探针是通过采集已经测序的病原菌基因组序列，经过特殊的探针设计和分析软件筛选后，用DNA合成仪人工合成。另一类是PCR扩增子探针芯片。通过分析已经测序的病原菌基因组上的保守或特征性的基因或DNA片段，设计扩增引物，进行PCR扩增，将获得的长度为几百至一千个碱基左右的扩增子作为芯片探针。迄今己报道的食源性病原体检测芯片，要么检测的菌种单一，要么检测的基因单一，要么检测芯片的用途不明确，都没有体现出基因芯片高通量和高信息含量的特点；而且，这些研究没有明显的个性和特色，基本上都是选取的相同或类似的基因作为检测的靶基因。
发明内容本发明的目的在于提供一种食源性致病菌检测的复合型基因芯片。本发明所述的一种食源性致病菌检测的复合型基因芯片，包括以检测八种食源性致病菌中每一种菌的检测探针组构建的八个平行的亚阵列，这八个亚阵列之间分别以一行空白作为间隔，构建为一个大阵列；所述的八种食源性致病菌为单增李斯特菌(LM)、霍乱弧菌(VC)、副溶血弧菌(VP)、沙门氏菌(Sal)、志贺氏菌(Shi)、金黄色葡萄球菌(SA)、空肠弯曲菌(CJ)和大肠埃希菌(EC);其中，单增李斯特菌亚阵列上有47个探针，序列为SEQIDNo.1-7，来源于7个靶基因；霍乱弧菌亚阵列上有93个，序列为SEQIDNo.8-140,来源于18个耙基因；副溶血弧菌亚阵列上有33个，序列为SEQIDNo.141-173，来源于9个耙基因；沙门氏菌亚阵列上有31个，序列为SEQIDNo.174-204，来源于11个耙基因；志贺氏菌亚阵列上有31个，序列为SEQIDNo.205-235,来源于8个靶基因；金黄色葡萄球菌亚阵列上有22个，序列为SEQIDNo.236-257，来源于9个耙基因；空肠弯曲菌亚阵列上有17个，序列为SEQIDNo.258-274，来源于7个靶基因；大肠埃希菌亚阵列上有73个，序列为SEQIDNo.275-347，来源于17个耙基因；还包括1个阳性对照探针，序列为SEQIDNo.348;3个阴性对照探针，序列为SEQIDNo.349-351。采用本发明所述的食源性致病菌检测的复合型基因芯片，逐一检测了8个种属的目标食源性致病菌。检测单增李斯特菌，其中LM亚阵列报告的PPR(探针阳性率)最高，平均PPR为68.8X;检测英诺克李斯特菌，LM亚阵列报告的PPR最高，平均PPR为51.8X;检测伊氏李斯特菌样品，LM亚阵列报告的PPR最高，平均PPR为59.6X;因此，初步检测数据显示，李斯特菌属的这三个不同菌种可以用该基因芯片区分开来。检测霍乱弧菌，VC亚阵列报告的PPR最高，平均PPR为54.1X;检测副溶血弧菌，VP亚阵列报告的PPR最高，平均PPR为66.7%;检测沙门氏菌，Sal亚阵列报告的PPR最高，平均PPR为55.9%;检测志贺氏菌，Shi亚阵列报告的PPR最高，平均PPR为53.8%;检测金黄色葡萄球菌，SA亚阵列报告的PPR最高，平均PPR为65.2%;检测空肠弯曲菌，CJ亚阵列报告的PPR最高，平均PPR为88.2X;检测大肠弯曲菌，CJ亚阵列报告的PPR最高，平均PPR为58.8X;用该芯片检测同属的两个不同菌种空肠弯曲菌和大肠弯曲菌的PPR有显著差异，完全可以清楚地将两个菌种区分开来。检测大肠杆菌，EC亚阵列报告的PPR最高，平均PPR为47.9X。以上结果显示，本发明所述的基因芯片在检测8个目标食源性致病菌时，目标菌检测亚阵列的PPR显著高于其它亚阵列；因此该基因芯片检测报告结果与实际检测样品是完全符合的。发明人还采用本发明所述的基因芯片试验性地检测了除上述8个种属的目标食源性致病菌以外的其它有一定代表性的生物样品，如Lambda噬菌体、人基因组、肺炎链球菌、猪链球菌、粪链球菌、铜绿假单胞菌和脑膜炎奈瑟氏菌等非目标菌样品；结果发现，在这些被检测样品中，除了链球菌属的三个革兰氏阳性菌即肺炎链球菌、猪链球菌和粪链球菌在LM亚阵列的PPR偏高外，当检测其余样品时，所有亚阵列的PPR都很低或者没有，说明该芯片与这些非目标菌样品的交叉反应很弱或没有。因而，反证了本发明所述基因芯片的特异性。通过上述18种已知参考种属样品的全面检测分析，初步证实，本发明所述的食源性致病菌检测的复合型基因芯片，能够清楚正确地检测出8个目标食源性致病菌种属，也能够明确地排除8个目标食源性致病菌种属以外的其它非目标菌样品。而且，根据该芯片检测18个种属样品后进行PPR的排序与比较分析显示，该芯片上的每个食源性致病菌检测亚阵列可以清晰而又明确地区分目标菌样品和非目标菌样品。图1是本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)上8个细菌检测亚阵列的实际打印效果图；右侧每个亚阵列旁边的数值显示对应亚阵列的检测探针数。图2是本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)Oligo微阵列在芯片上布局示意图。图3是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测单增李斯特菌的一个菌株04LM233的检测结果扫描图。图左边纵向排列的向右方框型箭头标识了Biosafood-8芯片上8个食源性致病菌检测亚阵列的位置；图右边的一个向左的方框型箭头标识了本次芯片检测的样品，以及根据PPR判定的菌种归属。图4是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测三株单增李斯特菌(LM)后，根据从扫描图提取的芯片杂交检测信号强度值计算的PPR均值；对芯片上8个亚阵列检测该样品的PPR进行了比较。图5是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测霍乱弧菌的一个菌株V07—56的检测结果扫描图。图左边纵向排列的向右方框型箭头标识了Biosafood-8芯片上8个食源性致病菌检测亚阵列的位置；图右边的一个向左的方框型箭头标识了本次芯片检测的样品，以及根据PPR判定的菌种归属。图6是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测三株霍乱弧菌(VC)后，根据从扫描图提取的芯片杂交检测信号强度值计算的PPR均值；对芯片上8个亚阵列检测该样品的PPR进行了比较。图7是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测副溶血弧菌的一个菌株L一EP080的检测结果扫描图。图左边纵向排列的向右方框型箭头标识Biosafood-8芯片上8个食源性致病菌检测亚阵列的位置；图右边一个向左的方框型箭头标识了本次芯片检测的样品，以及根据PPR判定的菌种归属。图8是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测三株副溶血弧菌(VP)后，根据从扫描图提取的芯片杂交检测信号强度值计算的PPR均值；对芯片上8个亚阵列检测该样品的PPR进行了比较。图9是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测沙门氏菌的一个菌株0705YS0167的检测结果扫描图。图左边纵向排列的向右方框型箭头标识Biosafood-8芯片上8个食源性致病菌检测亚阵列的位置；图右边一个向左的方框型箭头标识了本次芯片检测的样品，以及根据PPR判定的菌种归属。图IO是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测三株沙门氏菌(Sal)后，根据从扫描图提取的芯片杂交检测信号强度值计算的PPR均值；对芯片上8个亚阵列检测该样品的PPR进行了比较。图11是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测志贺氏菌的一个菌株L一SH166的检测结果扫描图。图左边纵向排列的向右方框型箭头标识Biosafood-8芯片上8个食源性致病菌检测亚阵列的位置；图右边一个向左的方框型箭头标识了本次芯片检测的样品，以及根据PPR判定的菌种归属。图12是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测三株志贺氏菌(Shi)后，根据从扫描图提取的芯片杂交检测信号强度值计算的PPR均值；对芯片上8个亚阵列检测该样品的PPR进行了比较。图13是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测金黄色葡萄球菌的一个菌株05ST028的检测结果扫描图。图左边纵向排列的向右方框型箭头标识了Biosafood-8芯片上8个食源性致病菌检测亚阵列的位置；图右边的一个向左的方框型箭头标识了本次芯片检测的样品，及根据PPR判定的菌种归属。图14是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测三株金黄色葡萄球菌(SA)后，根据从扫描图提取的芯片杂交检测信号强度值计算的PPR均值；对芯片上8个亚阵列检测该样品的PPR进行了比较。图15是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测空肠弯曲菌的一个菌株07C42的检测结果扫描图。图左边纵向排列的向右方框型箭头标识Biosafood-8芯片上8个食源性致病菌检测亚阵列的位置；图右边一个向左的方框型箭头标识了本次芯片检测的样品，以及根据PPR判定的菌种归属。图16是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测三株空肠弯曲菌(CJ)后，根据从扫描图提取的芯片杂交检测信号强度值计算的PPR均值；对芯片上8个亚阵列检测该样品的PPR进行了比较。图17是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测大肠弯曲菌(CC)的检测结果扫描图。图左边纵向排列的向右方框型箭头标识了Biosafood-8芯片上8个食源性致病菌检测亚阵列的位置；图右边的一个向左的方框型箭头标识了本次芯片检测的样品，以及根据PPR判定的菌种归属。图18是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测一株大肠弯曲菌(CC)后，根据从扫描图提取的芯片杂交检测信号强度值计算的PPR;对芯片上8个亚阵列检测该样品的PPR进行了比较。图19是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测大肠埃希菌的一个菌株EC882364的检测结果扫描图。图左边纵向排列的向右方框型箭头标识了Biosafood-8芯片上8个食源性致病菌检测亚阵列的位置；图右边的一个向左的方框型箭头标识了本次芯片检测的样品，以及根据PPR判定的菌种归属。图20是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测三株大肠埃希菌(EC)后，根据从扫描图提取的芯片杂交检测信号强度值计算的PPR均值；对芯片上8个亚阵列检测该样品的PPR进行了比较。图21是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测Lambda噬菌体的检测结果扫描图。图左边纵向排列的向右方框型箭头标识了Biosafood-8芯片上8个食源性致病菌检测亚阵列的位置；图右边的一个向上的方框型箭头标识了本次芯片检测的样品。图22是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测一个Lambda噬菌体样品后，根据从扫描图提取的芯片杂交检测信号强度值计算的PPR;对芯片上8个亚阵列检测该样品的PPR进行了比较。图23是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测人全基因组DNA的检测结果扫描图。图左边纵向排列的向右方框型箭头标识了Biosafood-8芯片上8个食源性致病菌检测亚阵列的位置；图右边的一个向上的方框型箭头标识了本次芯片检测的样品。图24是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测一个人全基因组DNA后，根据从扫描图提取的芯片杂交检测信号强度值计算的PPR;对芯片上8个亚阵列检测该样品的PPR进行了比较。图25是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测一株肺炎链球菌(SP)的检测结果扫描图。图左边纵向排列的向右方框型箭头标识了Biosafood-8芯片上8个食源性致病菌检测亚阵列的位置；图右边的一个向上的方框型箭头标识了本次芯片检测的样品。图26是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测一株肺炎链球菌(SP)后，根据从扫描图提取的芯片杂交检测信号强度值计算的PPR;对芯片上8个亚阵列检测该样品的PPR进行了比较。图27是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测一株猪链球菌(SS)的检测结果扫描图。图左边纵向排列的向右方框型箭头标识了Biosafood-8芯片上8个食源性致病菌检测亚阵列的位置；图右边的一个向上的方框型箭头标识了本次芯片检测的样品。图28是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测一株猪链球菌(SS)后，根据从扫描图提取的芯片杂交检测信号强度值计算的PPR;对芯片上8个亚阵列检测该样品的PPR进行了比较。图29是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测一株粪链球菌(SF)的检测结果扫描图。图左边纵向排列的向右方框型箭头标识了Biosafood-8芯片上8个食源性致病菌检测亚阵列的位置；图右边的一个向上的方框型箭头标识了本次芯片检测的样品。图30是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测一株粪链球菌(SF)后，根据从扫描图提取的芯片杂交检测信号强度值计算的PPR;对芯片上8个亚阵列检测该样品的PPR进行了比较。图31是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测一株脑膜炎奈瑟氏菌(NM)的检测结果扫描图。图左边纵向排列的向右方框型箭头标识了Biosafood-8芯片上8个食源性致病菌检测亚阵列的位置；图右边的一个向上的方框型箭头标识了本次芯片检测的样品。图32是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测一株脑膜炎奈瑟氏菌(NM)后，根据从扫描图提取的芯片杂交检测信号强度值计算的PPR;对芯片上8个亚阵列检测该样品的PPR进行了比较。图33是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测一株铜绿假单胞菌(PA)的检测结果扫描图。图左边纵向排列的向右方框型箭头标识了Biosafood-8芯片上8个食源性致病菌检测亚阵列的位置；图右边的一个向上的方框型箭头标识了本次芯片检测的样品。图34是用本发明所述的基因芯片(命名为Biosafood-8芯片)检测一株铜绿假单胞菌(PA)后，根据从扫描图提取的芯片杂交检测信号强度值计算的PPR;对芯片上8个亚阵列检测该样品的PPR进行了比较。图35是Biosafood-8芯片检测18个种属样品的PPR按照8个目标食源性致病菌检测亚阵列的方式进行排列比较汇总。具体实施方式一、基因芯片检测目标菌种的确定本发明拟从上述菌种中选择广东省比较常见的8种食源性致病菌用于检测基因芯片的研制，它们分别是单增李斯特菌(LM)、霍乱弧菌(VC)、副溶血弧菌(VP)、沙门氏菌(Sal)、志贺氏菌(Shi)、金黄色葡萄球菌(SA)、空肠弯曲菌(CJ)和大肠埃希菌(EC)。样品来源所有细菌菌株均来自广东省疾病预防控制中心菌毒种库。以下将针对这8种食源性致病菌研制的寡核苷酸检测基因芯片命名为"Biosafood-8芯片，，。二、寡核苷酸(Oligo)探针的设计针对8种食源性致病菌的89个检测靶基因共设计了351个探针，其中包括l个阳性对照探针和3个阴性对照探针(表4一1)。针对8种食源性致病菌设计的基因芯片检测探针，长度都是70mer，其它参数如退火稳定Tm和GC%含量等也都是按照设计参数，进行严格控制。最终确定并用于芯片制作的探针序列见下表(表1表10)。表1Biosafood-8芯片上集成探针概括<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>为了质量控制和数据的可靠性检验，在芯片阵列上设计了与样品检测探针平行的阳性对照探针和阴性对照探针。阳性对照探针一个，阴性对照探针三个。它们的设计参数与普通样品检测探针的设计参数完全一样，譬如，探针长度均为70mer，退火温度和GCX含量也在严格控制的范围。它们的差别主要是在来源方面。l井阴性对照为人血白蛋白基因片段；2弁阴性对照为人血红蛋白基因片段；3#阴性对照为连续串连的人为指定序列"ATCG"，没有生物学编码功能；阳性对照探针为与限制性接头序列匹配的样品扩增标记引物的两次串连重复序列，然后在这个重复序列的两端再补加部分引物序列至总长度为70bp。表2:经过优化改进Lmo"ocj;toge"s(LM)的检测探针共47个<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>17AGTTAGAGCCCGTTAATGGGTGATAGCGTGCCTTTTGTAGAATGAACCGGCGAGTTACGATTTGTTGCM18AAGCGGAGCCGTAGCGAAAGCGAGTCTGAATAGGGCGCATAAGTAACAGGTCGTAGACCCGAAACCAGGT19TGTGGGTAGCGGAGAAATTCCAATCGAACTTGGAGATAGCTGGTTCTCTCCGAAATAGCTTTAGGGCTAG20GGCCCTTCTCGGGTTACCGAATTCAGATAAACTCCGAATGCCATGTACTTATACTCGGGAGTCAGACTGC21TCTTTAGAGGTTCGTGGTAGGAGAGCGTTCTAAGGGCGGTGAAGTCAGACCGGAAGGACTGGTGGAGCGC22ATATCTAAGGTTTCCTGAGGAAGGCTCGTCCGCTCAGGGTTAGTCGGGACCTAAGCCGAGGCCGATAGGC23AGGGAATCGCACGAATGGAAATGTGCGTCCAAGCAGTGAGTGTGAGAAGTAGGCAAATCCGCTTCTCGCG24AGTACTGCCCGTACCGCAAACCGACACAGGTAGATGAGGAGAGAATCCTAAGGTGAGCGAGAGAACTCTC25TATAGGGGCTGACGCCTGCCCGGTGCTGGAAGGTTAAGAGGAGTGCTTAGCTTCGGCGAAGGTACGAATT26GAAGATGCAGGTTACCCGCGACAGGACGGAMGACCCCGTGGAGCTTTACTGCAACCTGATATGGAATGT27GCTAGCATACGAGGAGGCAATGGTGGGATACTACCCTGGCTGTATGACCATTCTAACCCGCCACGCTTAG28GGATGGAAATCATTCGCAGAGTGTAAAGGCACAAGGGAGCTTGACTGCGAGACTGACAAGTCGAGCAGGG29GCGCAGGAAATTTGAGAGGAGCTGTCCTTAGTACGAGAGGACCGGGATGGACACACCGCTGGTGTACCAG30TGTCTGGTAGTTATGGCGAGAAGGTCACACCCGTTCCCATCCCGAACACGGTAGTTAAGCTTCTCTGCGC31GATGCATCTGCATTCAATAAAGAAAATTCMTTTCATCCATGGCACCACCAGCATCTCCGCCTGCAAGTC32CCATGGCACCACCAGCATCTCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATCGAAAAGAAACACGCGGATGAAAT33AGGATTGGATTACAATAAAAACAATGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTGACAAATGTGCCGCCAAGA34AAGCTGTAAATAATAGCTTGAATGTAAACTTCGGCGCAATCAGTGAAGGGAAMTGCMGAAGAAGTCAT35ATGTTAATGAACCTACAAGACCTTCCAGATTTTTCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCT36AGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCAATCTCAAGTGTGGCGTATGGCCGTCAAGTTTAT37CTGGAGCGAAAACAATAAAAGCAAGCTAGCTCATTTCACATCGTCCATCTAmGCCAGGTAACGCAAGA38ATTAATGTTTACGCYAAAGAATGCACTGGTTTAGCTTGGGAATGGTGGAGAACGGTAATTGATGACCGGA39GACCGGAACTTACCACTTGTGAAAAATAGAAATATCTCCATCTGGGGCACTACGCTTTATCCGAAATATA40CAACAATCGCATCCGCAAGCACTGTAGTAGTCGAAGCTGGTGATACTCTTTGGGGTATCGCACAAAGTAA41CTGAAGTAAAACAAACTACACAAGCAACTACACCTGCRCCTAAAGTAGCAGAAACGAAAGAAACTCCAGT42AATGCTACTACACACGCTGTTMAAGCGGTGACACTATTTGGGCTTTATCCGTAAMTACGGTGTTTCYG43CATGGGGTGGTAACGGACCAACTACATTTGATTGCTCTGGTACACTAAATATGTATTTGCTAAAGCGGG44CTCCCTTCCACGTACTTCTGGCGCACAATACGCTAGCACTAGMTCTCTGAATCTCAAGCMMCCT<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>97GTACGGGGTATTGTAATCGTTGGCTTTTGACCAGCAACGCCGCCATTCAAGTTTCTCCGCAGGCTATGCA98GTGTGGCGCTTTCCTTGGCGGGTTCGGGTGGGGCTTCTTTTCTTGATTTCGATAGTTTAGGCCGTGCTAC99TCGGGTCGGGTTAGGGTTGAACCATTTGGATTACTCAAAAGTGTAAACAAAGTTAAGAGCTAAATCATCC100CTGACGGAATCAACCAAAGCGGTGACAAAGCAGGTTCAACCGTTTACAGCGCGAAAGGTACTTCTCTAGA101GAAGTTGGTGGCCGTGCTGAAGCTCGCCTATCTCTGAAAGATGGTAAGGCACAAGACAACTCTCGCGTAC102CTAGGCGTAAAAGCAAGCTACCGTTTTGCTGACCGTAACGCTGTTGACGCAATGGGTAATGTTGTAACTG103GGTGAAGATGGTTACTCTCTGTCTGCTATCTACACTTTCGGTGACACTGGCTTTAACGTAGGTGCTGGCT104TGCTAGCCGCTTCTTACCGCATGGAAAACCTGTACTTCGCAGGACTGTTCACTGACGGTGAGCTAGCGAA105CTATCGACGCAACTTACTACTTCAAGCCAAACTTCCGCTCTTACATCTCTTACCAGTTCAATCTGCTAGA106GGCTATCGGTCTACGTTACGACTTCTAATTGmACTTCAGGTCACACGCCAAACGCCTGCTCACTAGCA107CGGCCTAGCCGTACTTGCAGCCCTMGCTCCGCTCCTGTATTTGCTCACCAAGAAGGTGACTTTATTGTG108GGTCCAATACTACTTTGGTGAAGCTAATTCGACTTTCCGTCCATATGTTGGTGCGGGTTTGAATTACACC109TGACAACATCAGTTTTGAAGTCCTCGCTGCTACGCCATTTTCACATAAGATTTCTACCTCTGGTGGTGAG110AACCTACAAAGCAGGTGCAGATGCCAAATCCACGGATGTTGAAATCAATCCTTGGGTATTTATGATCGCG111GGCTCTCGTGAATCTCGCATTTACTGGCGTATCTACAACAAGGCTGCTCAGCTTGGTTTAGATATGCACT112CGACGTTCTGCTCAATATCGAGGGGTATTTTGCAGGTTTGTGCGCGTACTCGGCCTCAATTATCAATTCC113CTGTACTTACGTCAATTGTGTGCACCAAAGTGTTTCTGTMTCCCTTGATTTGAAAACCTGTTACCAACC114ACTCCACACTAAGGCGGAGTTCTTGGATATTTTGGCAGCTTGTTTTTGCTGCTTAAATTTGGGCTACGCG115GTCACTGTACTTACGTCAATTGTGTGCACCAAAGTGTTTCTGTAATCCCTTGATTTGAAAACCTGTTACC116AGCTGATGAGGCAAAGAATCCTTTCACTGGTACAGCTATGGGGATTTTCTCATTTCCACGAAACTCTGCA117CGAATAAAGCATTCGCAATTACAGTCGGTGGCTTGACCCAAGCACAATGTAAGACTTTGGTTACAAGCGT118GCTGCTACTGGCGCTGGCGTAATTAAGTCCATTGCACCAGGAAGTGCCAACTTAAACCTAACTAATATCA119GGCCTCTGCCGTATTAGGGATGGCATTGGTCGCTGCTGGGAGTTATTACAAGCGGGAAGCTGAACTCATG120GGGTATTATGGGTGTGGTCTCAGCGGGTGTTGTTACGCTGGCTCAGCGTGCGATTGATTCGCAGAATATG121AGCTAGCTAATGGTTTGGTCAGCCTTGGTAAGGTTTCAGCTGATGAGGCAAAGMTCCTTTCACTGGTAC122GCTACTGGCGCTGGCGTAATTAAGTCCATTGCACCAGGAAGTGCCAACTTAAACCTMCTAATATCACGC123GGCCTCTGCCGTATTAGGGATGGCATTGGTCGCTGCTGGGAGTTATTACMGCGGGAAGCTGMCTCATG124TGCAATGTATCCAGCCACGCCGAMACTCGGTGTTATAGCGTTCACCCAGTAATTTGACACTCTGTGCCC<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表4:V.parahaemolyticus(VP)的检测探针，共33个<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>149GACAAACACCMAATAACACATTCAAGTGTTCTTGGAATTTGAGTCCGGCAAMTCGAGTCTGCATCATG150AAACGTCTGCGTGAGCTATCGTTCTTGMCTCAGGCGmC窗CAAGCTTATTGATG淑GCGAAGCGG151GGTGGTATTCAAGCGTTCGTTCAGCACTTAAACACCAACAAAACACCAATCATCGAGAAAATCTTCCACT152TTCTGTTTCACCAACAACATTCCACAGCGCGATGGTGGTACTCACCTTGCTGGTTTCCGTGCGGCACTAA153GAACTATACATTGTGGAGGGTGACTCTGCGGGTGGTTCAGCTMGCAGGGTCGTMTCGTMGAATCAGG154GATCTATCGACTGTTGGTCGTATGAAGTTTAACAGCTCTATCGGTCGTGAAGATGCTCAAGAGCAAGGCA155CATGGACCAAAACAACCCGTTATCAGAAGTAACGCACAAGCGTCGTATTTCTGCATTGGGTCCTGGCGGT156CCTATCTGCAATCGAAGAAGGCCAATTCGTTATCGCTCAGGCGAACGCTAAGCTAAACGAAGATGGTACT157GCTCAGTACATGGACGTTGCGACAAACCAGGTTGTATCTATCGCTGCATCGCTTATCCCGTTCCTAGAAC158GYTGACATCCTACATGACTGTGAACATTAATGATAAAGACTATACAATGGCAGCGGTGTCTGGCTATAAG159GATCCTTGTTTGGACATCAACCGCTCATCGTCTGTCGATTACATGTACACCCACGCATTGCGCTCTGAGT160CCAACAACAGCAACTCACCGCTATGTTGCAGAGAAAATGCTAGAAAGTAGCAACAACTTAGCCGAGTACC161GCACGCAAGAAAACCAAACCTATACCTATGTTCGCTGTTGGTATCGCACCAGCTACTCGAAAGATGATCC162AACAMGTGGTTGCACTCGGTGACAGCTTGTCTGATACAGGCAACATCTTTAACGCATCACAATGGCGCT163ATTGCCAAAGCGAAGAACCTTCCGCTCTACAACTGGGCAGTTGGCGGCGCGGCTGGTGAGAACCAATACA164GTACTTAACCTACGCAAAACTGGCGAAGAACTACAAACCAGCAAACACCTTGTTTACGCTTGAGTTTGGT165GTACTGTTTCCAGTTCGTTGTTTTGTAGCGAGGTTTCGGCATGAGACTAGGGGAATTAACTTACTTAGCC166TTTACCGTCATATAGGCGCTTAACCATTTTGAGCCTGAAGTCGTGAAAATAGATTGACCGTGAACGCTTT167GTAATTCGCTCGCTGACCAACAAAGCGGCAACGAAGTTGTACGATTAGGAAGCAACGAAAGCCGTATACT168MCGAGCTTCACGAGTTTGTTTGGCGTGAGCAAGGTTTTGAGGTGGATGACTCAAGCCTGACTCAAGCGA169TGCCTTCTATTGAGCAGTGCATTGAACGCTACGTTAAGCACCATCCAGMGACTCGTTACCAGTGGAAGT170GCTGATTTTGAACTACATTCATGACAGCAACCACTCGTATGAGAACGTGACATTGCGTATTTTCGCAGGT171AGTGGTTGGTTGTACTGGGGCAGTGACCTTAAAGTTGAGCAAGTGCTTACATCAAATGAATGGCAGTCAA172CCAACAGACATCTGCAAATAAAGGAGGCCAGCATGAAGATTAAAGTAGCATCTGCGGTTTTGGCCGTATC173GGCGATTACATTCGCGTGGCAAACATCAAACTGTTCGCACAAGGCTCGACGGCTGAATCGACAATTMTA表5Salmonellaspp.(Sal)的检测探针，共31个<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>249TCGGATAGCGATTCAGATTCAGACAGCGATTCAGACTCAGATAATGACTCAGACTCAGACAGCGATTCGG250GCAGCTTGCTTACTTACTGCTGTACCTGTTATGAAAGTGTTCAAGTATTTTTATTCAAATCGCGGTCCAG251AGAGGTAGTTGATGGTGGTTTCCGCGTAAATGGTAAAGAAGTTAAATCATTCAGTGAACCAGATGCAAGC252ACAGGTGCTGCTAAAGCTATCGGTAAAGTTATTCCTGAAATCGATGGTAAATTAGATGGTGGTGCACAAC253AAGCTCCAACATGAAGATGGCTATCGTGTCACAATCGTTGACGATAATAGCAATACAATCGCACATACAT254GATTATGGCTCAGGTACTGCTATCCACCCTCAAACAGGTGAATTATTAGCACTTGTAAGCACACCTTCAT255CTAAGTAGCTCAGCAAATGCATCACAAACAGATAAYGGCGTAAATAGAAGTGGTTCTGAAGATCCAACAG256GTCGCTTTGCCCTTGGGTCATGCGTTGGTTCAATTCTTGGGCCAATCCTTCGGAAGATAGCATCTTTCCT257GGATGTATCGCCGAAGCAAGTTGTTTCAGCAGCGACAGCATGTATTCCATTCTTAGMAATGATGACTCA表8C.jejuni(CJ)的检测探针，共17个SEQIDNo.5'------探针序列------3'258ATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATATTGCGC259GAAACCCTGACGCAGCAACGCCGCGTGGAGGATGACACTTTTCGGAGCGTAAACTCCTTTTCTTAGGGAA260GGTGCAAGCGTTACTCGGAATCACTGGGCGTAAAGGGCGCGTAGGCGGATTATCAAGTCTCTTGTGAAAT261AGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATAGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTA262TCATGGCCCTTATGCCCAGGGCGACACACGTGCTACAATGGCATATACAATGAGACGCAATACCGCGAGG263TAGCTTGCTAGAACTTAGAGACAGGTGCTGCACGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA264GGTCTTGTACTCACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGATTTCACTCGAAGCCGGAATACTAAACTAGTTA265GTAAGGAGTGCTGGAGCGAATAGAAGTGAGCATGCAGGCATGAGTAGCGATAATTAATGTGAGAATCATT266TGGCAAATTGGTTAATATTCCAATACCAACATTAGTGTGCGATGGAAGGACGCTTAGGGCTAAGGGGGCT267TAATGTTGCCCGTACCGTAAACCGACACAGGTGGGTGGGATGAGTATTCTAAGGCGCGTGGMGAACTCT268AGCGGTGCTGATTTAGTACCTATTACTCCTATTACCCCACCTTTAACTAGAACAAGCAATAGTGCCAACA269CTAGCGGAGCAGCTTTAACGGTTTGGGCTTTAGCACAAGGAAATTGGATTTGGGGCTATACTTTAATCGA270GTCCATTATCCTTGYGATGCAAGCAATCACGCACAMTGTGGAAACTTATCCCTATGAGCAATACAGCGG271GTTGTAGGCGGGCTTACACCTATTCATCAATTTGTCAAAGTAGGTGAGGGTTGTATGATAGCAGGAGCAA272GAAGGGATTTTATTAAACACCTCTATTGCAAGCGTTGCTAGTGTTGCAGGGTTTAGTGTCCCAAGCTCTA<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>三、Biosafood-8芯片的制作1、Biosafood-8芯片探针的合成Biosafood-8探针组共有351个，其中LM探针组47个、VC探针组93个、VP探针组33个、Sal探针组31个、Shi探针组31个、SA探针组22个、CJ探针组17个、EC探针组73个、1个阳性对照和3个阴性对照，共计351个。委托美国IDT(IntegratedDNATechnologies,Inc.)合成。按IDT公司合成后提供的"01igoSpecificationSheet"配制40uM探针原液；将探针溶液转入384孔板。2、Biosafood-8芯片阵列的设计Biosafood-8芯片设计的目的是为了同时检测LM、VC、VP、Sal、Shi、SA、CJ和EC等8种食源性致病菌，因此，在该芯片上，将检测这8种致病菌的探针，分别以每一个菌的检测探针构建一个亚阵列；然后再将这平行的8个亚阵列构建为一个大阵列。该Biosafood-8芯片大阵列的8个亚阵列，从上到下，分别是亚阵列1为LM探针组；亚阵列2为CV探针组；亚阵列3为VP探针组；亚阵列4为Sal探针组；亚阵列5为Shi探针组；亚阵列6为SA探针组；亚阵列7为CJ探针组；亚阵列8为EC探针组。每个亚阵列末尾，在探针数不足以形成一个方针的地方，均以空白代替。譬如第一个亚阵列LM阵列的最后7个阵列位点(L3:R34—54)均为空白点。将整个Biosafood-8大阵列的阳性对照和阴性对照探针放在整个大阵列的最后一个亚阵列EC阵列的末尾，即L30:R34—45位置为阳性对照探针，L30:R46—48、L30:R49—51和L30:R52—54分别为三个阴性探针。这8个亚阵列之间，分别以一行空白作为间隔。每个样品打印3个点，最终打印成18X3X30的阵列(图1)。每个大阵列在芯片片基上重复打印两次。两个大阵列在芯片上的布局见图2。3、Biosafood-8芯片阵列的打印按照芯片点样仪的操作说明，按照Biosafood-8阵列的设计要求，编制芯片点样运行程序。启动点样程序，开始点样；芯片点样程序运行完毕后，取出384孔板，用封膜密封，转至RT暗处存放。芯片打印好后，分别用下列两种方法检査芯片打印质量和效果。方法1:取出在高湿环境中过夜处理的芯片，在显微镜TE2000-E(Eclipse,Nikon)下观察探针点的形态。记录了芯片探针点在片基上的各种形态，包括，扩散、融点、不规则、大小不一、阵列错位等。方法2:用GenePix4100A芯片扫描仪(AxonInstruments,Inc.)扫描整张芯片，扫描参数的设置为PMTgai『550;分辨率为10um;选择Cy3单波长扫描。最后将获得的扫描图像，以"multilayerTiff"格式存盘。四、基因芯片的样品检测1.细菌的培养从菌种库中取出经过传统方法鉴定确认的菌株，按照各自特定的条件复苏和分离培养；收集适量菌苔，用于DNA提取。2.基因组DNA的提取常规方法提取人基因组DNA。采用常规纯手工提取或离心柱式试剂盒(上海生工公司)提取细菌基因组DNA。进行DNA的浓度和纯度的测定。3.样品的标记用于芯片检测的样品的荧光染料标记方法使用限制性通用接头(RestrictionalGeneralAdaptor)样品标记法[LiL,etal.AmodifiedrestrictiondisplayPCRmethodinsample-labellingofDNAmicroarray.JVirolMethods.2003;114(1):71-75]。用于芯片检测的待检测样品，经过Sau3AI酶切断裂为短片段后，这些片段的两端与一个同该酶的切口匹配的通用接头连接，然后用一条与该通用接头配对的通用引物，进行经过Sau3AI限制性切割的样品片段的扩增和标记。用5'端标记了Cy3-UP(5，>Cy3-GTTTGGCTGGTGTGGATC〈3',Cy3-UP)作为引物，它能与样品DNA的Sau3AI酶切片段两端的RAF-RAR接头进行特异性结合，从而以PCR扩增的方式标记样品DNA片段。接头序列如下RAF:5'>GATCCACACCAGCCAAACCCA<3';MW:6378RAR:5'>GGTTTGGCTGGTGTG<3';MW:47754.芯片的杂交4.1预杂交(1).将芯片浸入预热至55°C的预杂交液；(2).55°C放置150min;(3).室温下用0.1SSC(洗脱液III)清洗共3次，每次用IKA-WEAKE脱色摇床150rpm轻摇5分钟；(4).转至纯水，放置30秒；(5).用ChipMate(Tomy，PMC—082)离心甩干芯片；然后于洁净处放置待用。4.2杂交(1).在标记样品沉淀管中加入20LdH20，20L2xHybridizationBuffer(加入体积可随盖片大小灵活调整)，振荡混匀；(2).95。C保温10min;然后用Minispin桌上离心机在13000rpm离心2min;(3).RT暗处放置，准备用于上载到芯片阵列。(4).取40yL样品于经过预杂交的阵列上；(5).在该阵列上盖上己硅烷化处理的12mmX24mm盖玻片；(6).置入VersArrayTM芯片杂交盒，然后在杂交盒两端小孔内各加入20PL水，以保持其湿度；(7).将载有芯片的杂交盒置于预热到55。C的水浴锅，在55。C保温23小时或者过夜。4.3芯片杂交后清洗(1).从55°C水浴中取出杂交盒，RT放置3分钟；(2).从杂交盒中轻轻取出芯片，注意不要触动盖玻片；(3).在室温条件下用自来水冲洗掉杂交液和盖玻片；(4).将芯片转至预热至55°C的洗脱液I中，在55。C水浴中放置10min;(5).将芯片转至洗脱液II中，室温下用IKA-WEAKE脱色摇床150rpm振荡3min;(6).在洗脱液洗脱液m中洗涤3min;(7).用ChipMate(Tomy，PMC—082)最大转速(3500rpm)离心甩干芯片；然后置于芯片储存盒(Cat.No.:430052，北京博奥生物有限公司)，于洁净暗处放置，等待扫描检测。5.芯片扫描(1).开启GenePix4100A芯片扫描仪(AxonInstruments,Inc.),预热lOmin以上；(2).开启电脑，运行GenePixPro5.1(AxonInstruments,Inc.)芯片扫描程序；(3).点击"HardwareSettings"图标，打开运行参数设置对话框；(4).各项设置的参数如下波长532nm;PMTgain=550;Filter:575DF35;PixelSize:10uM;Linestoaverage:1;FocusPosition:0uM;(5).用"ViewScanArea"命令选择芯片的扫描范围；(6).点击标签为"Image"界面右上角的"DataScan"图标，开始芯片扫描；(7).在芯片扫描过程中，可以运用放大镜工具，放大扫描区域，观察扫描图的细节；(8).扫描结束后，点击存盘图标，将获得的扫描图像，以"multilayerTiff"格式存盘。6.芯片扫描数据的提取与分析(1).开启电脑，运行GenePixPro5.1;(2).打开已经存储的芯片扫描图片；(3).按照阵列和亚阵列定义提取数据的点阵；(4).将定义的点阵阵列的大小和距离与实际扫描的芯片点阵进行拟合；(5).调整左、中和右定位点，确保所有的探针信号点完全拟合；(6).选择多个亚阵列，重复上述拟合操作；(7).点击数据提取界面右侧的"DataExtraction"图标，提取数据，将图像数据转换为数值数据；(8).点击结果保存按钮，储存提取的数据结果；(9).同时，可以将提取的数据，以"TXT"文件的形式导出；(10).在保存数据选项中，选择"ExportDataAs"，同时选择导出数据的格式为"TXT";(11).将导出的TXT格式数据用"Excel"软件打开；(12).在Excel软件中计算探针的信号均值；(13).对所有的探针信号均值进行汇总；(14).按照信号均值的大小进行数据排序；(15).根据定义的阳性探针信号值筛选阵列中所有的阳性探针；(16).计算每个样品检测阵列的PPR;(17).根据计算所得的PPR作统计图；(18).根据统计图中显示的结果判定样品的归属。7.芯片检测的灵敏度分析将被检测样品和样品标记接头按照IO倍的比例向下稀释，寻找芯片检测样品的绝对量下限值。(1).取单增李斯特菌样品LM1(06LM1407)，其原始浓度为631.6ng/mL。首先将该样品稀释20倍，使其终浓度约为30yg/mL(实为31.58yg/mL);(2).取接头原液(20pM)10uL，加入10uL纯水，稀释成为10yM的浓度，共20uL;(3).再按照下表(表3—4)的稀释方案，同时对样品溶液和接头溶液进行系列IO倍稀释操作。实验设计中，共考察了6个样品浓度梯度值，起始浓度为30ug/mL，最低下限浓度为0.3ng/mL;每次加入的样品量均为3uL。8.甩Biosafood-8芯片检测已知参考样品的验证性评价用包括8个食源性致病菌检测亚阵列的Biosafood-8芯片全阵列，逐一检测了8个种属的目标菌，即单增李斯特菌3株、英诺克李斯特菌3株、伊氏李斯特菌1株、霍乱弧菌3株、副溶血弧菌3株、沙门氏菌3株、志贺氏菌3株、金黄色葡萄球菌3株、空肠弯曲菌2株和大肠埃希菌3株。用Biosafood-8芯片检测一个样品后，用芯片扫描仪读取芯片阵列探针与标记样品杂交的信号强度值，以芯片扫描图(TIFF)的格式记录存盘。然后用GenePixPro5.1软件分析并提取每一个芯片探针与样品杂交检测的信号强度值，转换为数值数据；以TXT文件的形式导出到Exel表进行阳性探针数量的分析；对于用芯片检测一个致病菌样品的结果分析和判读方式，在这里我们通过分析发现，使用每一个芯片阵列检测样品后阵列上的PPR作为参数指标，即直观，又快捷方便。每检测一个样品后，分别分析8个亚阵列检测该样品后的PPR，并根据PPR的高低排序，确定PPR最高的亚阵列；最后，以PPR最高的亚阵列所属的菌种为检测样品的结果判定菌种。因此，在本次的数据分析中，全部使用阵列的PPR来判断芯片检测一个样品的特异性和准确性。8.1Biosafood-8芯片检测李斯特菌属样品的结果广东省食品中常见的李斯特菌属细菌有单增李斯特菌，英诺克李斯特菌和伊氏(绵羊)李斯特菌。在用Biosafood-8芯片检测李斯特菌属的三个不同的李斯特菌菌种单增李斯特菌、英诺克李斯特菌和伊氏李斯特菌时，LM亚阵列显示的PPR分别为68.79%、51.77%、59.57%。因此，初步检测数据显示，这三个不同菌种用Biosafood-8芯片可以区分开来。用Biosafood-8芯片检测单增李斯特菌(LM)，共检测了3个菌株样品。图3显示了Biosafood-8芯片检测菌株编号为04LM233的单增李斯特菌的芯片扫描图；图4显示了用该芯片检测三个菌株后，用三个菌株检测的PPR均值进行数据分析比较的结果。结果显示，Biosafood-8芯片检测三个LM样品后，LM亚阵列报告的PPR最高，平均PPR为68.79%，而其它7个检测亚阵列的平均PPR最高不超过25.5%;LM亚阵列的PPR显著高于其它亚阵列的PPR;因此Biosafood-8芯片检测结果实际检测样品是完全符合的。8.2Biosafood-8芯片检测VC样品的结果用Biosafood-8芯片检测霍乱弧菌(VC)，共检测了3个菌株样品。图5显示了Biosafood-8芯片检测菌株编号为V07—56的霍乱弧菌的芯片扫描图6显示了该芯片检测三个菌株后，用三个菌株检测的PPR均值进行数据分析比较的结果。结果显示，Biosafood-8芯片检测三个VC样品后，VC亚阵列报告的PPR最高，平均PPR为54.12%，而其它7个检测亚阵列的平均PPR最高不超过24.3%;VC亚阵列的PPR显著高于其它亚阵列的PPR;因此Biosafood-8芯片检测结果实际检测样品是完全符合的。8.3Biosafood-8芯片检测VP样品的结果用Biosafood-8芯片检测副溶血弧菌(VP)，共检测了3个菌株样品。图7显示了Biosafood-8芯片检测菌株编号为L—EP080的副溶血弧菌的芯片扫描图；图8显示了该芯片检测三个菌株后，用三个菌株检测的PPR均值进行数据分析比较的结果。结果显示，Biosafood-8芯片检测三个VP样品后，VP亚阵列报告的PPR最高，平均PPR为66.67%，而其它7个检测亚阵列的平均PPR最高不超过19.7%;VP亚阵列的PPR显著高于其它亚阵列的PPR;因此Biosafood-8芯片检测结果实际检测样品是完全符合的。8.4Biosafood-8芯片检测Sal样品的结果用Biosafood-8芯片检测沙门氏菌(Sal)，共检测了3个菌株样品。图9显示了Biosafood-8芯片检测菌株编号为0705YS0167的沙门氏菌的芯片扫描图；图10显示了该芯片检测三个菌株后，用三个菌株检测的PPR均值进行数据分析比较的结果。结果显示，Biosafood-8芯片检测三个Sal样品后，Sal亚阵列报告的PPR最高，平均PPR为55.91%，而其它7个检测亚阵列的平均PPR最高不超过21.6%;Sal亚阵列的PPR显著高于其它亚阵列的PPR;因此Biosafood-8芯片检测结果实际检测样品是完全符合的。8.5Biosafood-8芯片检测Shi样品的结果用Biosafood-8芯片检测志贺氏菌(Shi)，共检测了3个菌株样品。图11显示了Biosafood-8芯片检测菌株编号为L-SH166的志贺氏菌的芯片扫描图；图12显示了该芯片检测三个菌株后，用三个菌株检测的PPR均值进行数据分析比较的结果。结果显示，Biosafood-8芯片检测三个Shi样品后，Shi亚阵列报告的PPR最高，平均PPR为53.76%，而其它7个检测亚阵列的平均PPR最高不超过50.6%;Shi亚阵列的PPR明显高于其它亚阵列的PPR;因此Biosafood-8芯片检测结果实际检测样品是完全符合的。值得注意的是，虽然Sal亚阵列检测PPR明显低于Shi亚阵列的阳性率，但在检测Shi样品时，前者的PPR显得偏高，说明Sal亚阵列中的部分探针的特异性表现不理想，在该芯片的下一轮优化改进时，还需要不断增加检测Shi样品的特异性探针。8.6Biosafood-8芯片检测SA样品的结果用Biosafood-8芯片检测金黄色葡萄球菌(SA)，共检测了3个菌株样品。图13显示了Biosafood-8芯片检测菌株编号为05ST028的金黄色葡萄球菌的芯片扫描图；图14显示了该芯片检测三个菌株后，用三个菌株检测的PPR均值进行数据分析比较的结果。结果显示，Biosafood-8芯片检测三个SA样品后，SA亚阵列报告的PPR最高，平均PPR为65.15%，而其它7个检测亚阵列的平均PPR最高不超过39.1%;SA亚阵列的PPR显著高于其它亚阵列的PPR;因此Biosafood-8芯片检测结果实际检测样品是完全符合的。但是，值得注意的是，LM亚阵列的探针组在检测SA样品时，其PPR较高；这很可能与LM与SA均为革兰氏阳性菌有关，因为在用Biosafood-8芯片检测其它革兰氏阳性菌如猪链球菌、粪链球菌及肺炎链球菌时，LM亚阵列也显示了较高的PPR。即使这样，由于SA亚阵列的PPR显著高于LM亚阵列的阳性率，因此它并不影响检测结果的判定。8.7Biosafood-8芯片检测CJ/CC样品的结果弯曲杆菌属是一类主要寄生于哺乳动物和禽类肠道的革兰阴性杆菌。对人类致病的主要是空肠弯曲菌和大肠弯曲菌。这两个同属的菌种，通过Biosafood-8芯片的CJ亚阵列检测探针组，可以明确清楚地鉴定并区分开来。8.7.1Biosafood-8芯片检测CJ样品的结果用Biosafood-8芯片检测空肠弯曲菌(CJ)，共检测了3个菌株样品。图15显示了Biosafood-8芯片检测菌株编号为07C42的空肠弯曲菌的芯片扫描图；图16显示了该芯片检测三个菌株后，用三个菌株检测的PPR均值进行数据分析比较的结果。结果显示，Biosafood-8芯片检测三个CJ样品后，CJ亚阵列报告的PPR最高，平均PPR为88.24%，而其它7个检测亚阵列的平均PPR最高不超过6.5%;CJ亚阵列的PPR显著高于其它亚阵列的PPR;因此Biosafood-8芯片检测结果实际检测样品是完全符合的。8.7.2Biosafood-8芯片检测CC样品的结果用Biosafood-8芯片检测了1个大肠弯曲菌(CC)样品。图17显示了Biosafood-8芯片检测该菌的芯片扫描图；图18显示了该芯片检测大肠弯曲菌后，用检测PPR进行数据分析比较的结果。结果显示，Biosafood-8芯片检测CC样品后，CJ亚阵列报告的PPR最高，平均PPR为58.82%，而其它7个检测亚阵列的平均PPR最高不超过9.7%;CJ亚阵列的PPR显著高于其它亚阵列的PPR;由于大肠弯曲菌与空肠弯曲菌属于同一个属，同源性很高，因此Biosafood-8芯片检测结果实际检测样品是完全符合的。但是Bisafood芯片检测空肠弯曲菌时CJ亚阵列的PPR为88.28%，而检测大肠弯曲菌时CJ亚阵列的PPR为58.28%。因此，用该芯片检测同属的两个不同菌种空肠弯曲菌和大肠弯曲菌的PPR有显著差异，完全可以清楚地将两个菌种区分开来。8.8Biosafood-8芯片检测EC样品的结果用Biosafood-8芯片检测大肠埃希菌(EC)，共检测了3个菌株样品。图19显示了Biosafood-8芯片检测菌株编号为EC882364的大肠埃希菌的芯片扫描图；图20显示了该芯片检测三个菌株后，用三个菌株检测的PPR均值进行数据分析比较的结果。结果显示，Biosafood-8芯片检测三个EC样品后，EC亚阵列报告的PPR最高，平均PPR为47.95%，而其它7个检测亚阵列的平均PPR最高不超过36.6%;EC亚阵列的PPR显著高于其它亚阵列的PPR;因此Biosafood-8芯片检测结果实际检测样品是完全符合的。总结Biosafood-8芯片检测上述8个食源性致病菌种属的检测结果，发现该芯片能够通过集成的8个目标菌检测探针亚阵列，特异而又准确的显示被检测的目标菌样品。在检测目标菌样品时，先根据样品杂交检测结果，同时分析芯片上8个亚阵列的PPR;然后，根据每个亚阵列的PPR就可以确定PPR最高的亚阵列；最后就可以判定，PPR最高的那个亚阵列对应的菌种，就是被检测样品所属的菌种。理论上，Biosafood-8芯片上的这8个食源性致病菌检测亚阵列，在检测目标菌种时，PPR应该为100X，譬如，VC亚阵列上，集成的全都是VC基因组上特定耙基因的检测探针，因此在检测VC样品时，VC探针应该都能找到向匹配的靶DNA片段。但在实际检测中，因为样品标记方法的缺陷，不可能实现让VC样品的全基因组片段全部被标记上，因此，在VC亚阵列上，就会存在一定数量的假阴性探针(详见讨论部分)。该芯片上其它亚阵列的情况也类似。该Biosafood-8芯片在检测亚阵列对映的目标样品时，实际的PPR分别是LM亚阵列检测LM样品的PPR为68.79%，检测同属的Lin为51.77%，Liv为59.57%;VC亚阵列检测VC样品54.12%;VP亚阵列检测VP样品66.67%;Sal亚阵列检测Sal样品55.91%;Shi亚阵列检测Shi样品53.76;SA亚阵列检测SA样品65.15%;CJ亚阵列检测CJ样品88.24%，检测同属的CC样品58.82%;EC亚阵列检测EC样品47.95%。有上面这组数据可以看出，Biosafood-8芯片上的8个食源性致病菌检测亚阵列检测目标菌种的PPR，针对每一个亚阵列，是一个较稳定的值，但是针对不同的亚阵列，变化范围加大，最低的是大肠埃希菌亚阵列47.95%，最高的是空肠弯曲菌阵列88.24%;而所有这8个亚阵列的PPR都不低于47%。因此可以把45%这个略低于上述最低的EC亚阵列PPR的值设定为用Biosafood-8芯片检测食源性致病菌目标菌和非目标菌的一个临界值。也就是说，当用Biosafood-8芯片检测一个未知的可疑食物中毒细菌样品时，当芯片上8个亚阵列检测结果报告的PPR，如果没有一个亚阵列超过45%，那么，就可以认为该被检测样品为这8个种属之外的其它细菌样品。这只是根据上述检测数据提出的一个判断样品的一个初步的假设。这个假设是否成立，还需要用Biosafood-8芯片检测更多种类、更多数量的样品，来验证这个假设。下面用一些非目标菌样品进行检测评估，就是验证这个假设的一部分工作。9、用Biosafood-8芯片检测其它非目标菌样品的结果为了全面评价Biosafood-8芯片检测的特异性和可靠性，发明人特别用Biosafood-8芯片试验性地检测了除上述8个菌以外的其它有一定代表性的生物样品，如Lambda噬菌体、人基因组、肺炎链球菌、猪链球菌、粪链球菌、铜绿假单胞菌和脑膜炎奈瑟氏菌等非目标菌样品；结果发现，在这些被检测样品中，除了链球菌属的三个革兰色阳性菌在LM亚阵列的PPR偏高外，Biosafood-8芯片检测其余样品都显示了很好的检测特异性。用Biosafood-8芯片检测了1个Lambda噬菌体样品。图21显示了Biosafood-8芯片检测该样品的芯片扫描图；图22显示了该芯片检测病毒Lambda噬菌体DNA后，用检测PPR进行数据分析比较的结果。结果显示，Biosafood-8芯片检测Lambda噬菌体样品后，针对8个食源性致病菌检测的亚阵列的PPR普遍很低，其中仅VC和Sal两个亚阵列个个别探针阳性，但PPR都没有超过3.3%;其余亚阵列.的PPR均为0.00%。因此Biosafood-8芯片检测Lambda噬菌体的非特异性杂交信号是极低的。用Biosafood-8芯片检测了1个人全基因组DNA样品。图23显示了Biosafood-8芯片检测该样品的芯片扫描图；图24显示了该芯片检测人全基因组DNA后，用检测PPR进行数据分析比较的结果。结果显示，Biosafood-8芯片检测人全基因组DNA样品后，针对8个食源性致病菌检测的亚阵列的PPR普遍很低，其中仅VC、Sal、Shi、和EC四个亚阵列个个别探针阳性，但PPR都没有超过9.7%;其余亚阵列的PPR均为0.00%。因此Biosafood-8芯片检测人基因组DNA样品的非特异性杂交信号是极低的。用Biosafood-8芯片检测了1个肺炎链球菌样品。图25显示了Biosafood-8芯片检测该菌的芯片扫描图；图26显示了该芯片检测肺炎链球菌后，用检测PPR进行数据分析比较的结果。结果显示，Biosafood-8芯片检测肺炎链球菌样品后，针对8个食源性致病菌检测的亚阵列的PPR普遍较低，但其中有LM、SA和CJ三个亚阵列的PPR较高，但PPR都没有超过34.1%;其余亚阵列的PPR都很低，没有超过9.7%。因此Biosafood-8芯片检测肺炎链球菌样品的非特异性杂交信号是较低的。用Biosafood-8芯片检测了1个猪链球菌样品。图27显示了Biosafood-8芯片检测该菌的芯片扫描图；图28显示了该芯片检猪链球菌后，用检测PPR进行数据分析比较的结果。结果显示，Biosafood-8芯片检测猪链球菌样品后，针对8个食源性致病菌检测的亚阵列的PPR普遍较低，但其中有LM和CJ两个亚阵列的PPR较高，但PPR都没有超过42.6%;其余亚阵列的PPR都很低，没有超过29.1%。因此Biosafood-8芯片检测猪链球菌样品的非特异性杂交信号是较低的。值得注意的是，LM亚阵列检测猪链球菌样品是，显示了较高的PPR42.55%。这说明猪链球菌基因组上与Biosafood-8芯片的LM探针组中的探针有高同源性的序列较多，在检测组链球菌样品时，要特别留意。但是，根据前面的数据可以看出，LM亚阵列检测目标样品LM及其同属的Lin或者Liv的PPR都在51%以上，因此还是可以将它们明确地区分开来。用Biosafood-8芯片检测了1个粪链球菌样品。图29显示了Biosafood-8芯片检测该菌的芯片扫描图；图30显示了该芯片检测粪链球菌后，用检测PPR进行数据分析比较的结果。结果显示，Biosafood-8芯片检测粪链球菌样品后，针对8个食源性致病菌检测的亚阵列的PPR普遍较低，但其中LM亚阵列的PPR较高，但PPR都没有超过36.2%;其余亚阵列的PPR都很低，没有超过23.6%。因此Biosafood-8芯片检测粪链球菌样品的非特异性杂交信号是较低的。用Biosafood-8芯片检测了1个脑膜炎奈瑟氏菌样品。图31显示了Biosafood-8芯片检测该菌的芯片扫描图；图32显示了该芯片检测脑膜炎奈瑟氏菌后，用检测PPR进行数据分析比较的结果。结果显示，Biosafood-8芯片检测脑膜炎奈瑟氏菌样品后，针对8个食源性致病菌检测的亚阵列的PPR普遍较低，但其中CJ亚阵列的PPR较高，但PPR都没有超过29.5X;其余亚阵列的PPR都很低，没有超过19.4%。因此Biosafood-8芯片检测脑膜炎奈瑟氏菌样品的非特异性杂交信号是较低的。用Biosafood-8芯片检测了1个铜绿假单胞菌样品。图33显示了Biosafood-8芯片检测该菌的芯片扫描图；图34显示了该芯片检测铜绿假单胞菌后，用检测PPR进行数据分析比较的结果。结果显示，Biosafood-8芯片检测铜绿假单胞菌样品后，针对8个食源性致病菌检测的亚阵列的PPR普遍较低，但其中Sal和CJ两个亚阵列的PPR较高，但PPR都没有超过29.5%;其余亚阵列的PPR都很低，没有超过19.4%。因此Biosafood-8芯片检测铜绿假单胞菌样品的非特异性杂交信号是较低的。总结分析用Biosafood-8芯片检测8个目标菌之外的其它样品，结果显示，这些非目标菌样品，用Biosafood-8芯片检测，都显示了较低或很低水平的杂交非特异性。这组检测评估数据，结合前面Biosafood-8芯片检测8个种属的目标食源性致病菌的检测数据，完全证实了该Biosafood-8芯片检测样品的正确性。同时，前面提出的用Biosafood-8芯片亚阵列检测PPR45%作为区分目标试验性致病菌与其它非特异性样品的临界值的假说，通过后面这部分样品的检测验证，仍然是正确的。用Biosafbod-8芯片检测这些非目标菌样品，亚阵列PPR最低的为0.00%，而最高的为LM亚阵列检测猪链球菌样品的42.55%。通过综合分析LM亚阵列检测所有样品的区分能力，可以看出，LM亚阵列检测目标样品的特异性显著高于非目标菌样品。因此，通过上述18种已知参考种属样品的全面检测分析，初步证实，本发明研制的Biosafood-8食源性致病菌检测芯片，能够清楚正确地检测出8种目标食源性致病菌，也能够明确地排除8个目标食源性致病菌种属以外的其它非目标菌样品。上述对Biosafood-8芯片的验证性评估，是在一块芯片8个目标菌亚阵列的框架下，一次评估检测整个芯片检测一个样品的特异性和正确性；或者说是以"8个亚阵列一个样品的方式或者角度"，整个Biosafood-8芯片的检测性能。这也是以Biosafood-8芯片的实际应用的方式，或者说模拟Biosafood-8进行实际样品检测的方式进行的验证性评估。为了进一步评估Biosafood-8芯片的检测性能，充分利用Biosafood-8检测18个种属的样品后获得的数据所提供的信息，下面进一步从"一个亚阵列18个样品的角度"，考察分析Biosafood-8芯片的检测性能。10、对Biosafood-8芯片上每个亚阵列检测特异性的验证性评估在用18块Biosafood-8芯片检测了18个不同种属的样品后，实际上获得全部检测数据，可以分为两组数据。第一组数据是，从样品的角度看，每次被检测的一个样品，都经过一块芯片上8个亚阵列的检测，从而获得针对8个亚阵列同时检测这一个样品的8个PPR数据。通过分析这组数据，可以确定整个Biosafood-8芯片检测每一个样品的特异性；上述比较分析在上一部分已经完成。第二组数据是，从Biosafood-8芯片上每一个亚阵列的角度看，每一个亚阵列都检测18个样品，获得了18个PPR数据。通过提取归纳分析Biosafbod-8芯片检测18个不同种属来源的样品的结果数据，以Biosafood-8芯片上每一个亚阵列作为考察的对象，分析了该芯片上单个亚阵列的样品检测性能。结果显示，本次实际检测18个种属样品后进行PPR的排序与比较证实，每一个目标食源性致病菌检测亚阵列检测相应目标菌的PPR最高，实际检测结果与预期值完全一致(图35)。其余样品，虽然也显示出不同程度的PPR，但普遍明显低于目标样品的PPR。通过这18个种属的已知参考样品的初步验证性检验证实，Biosafood-8芯片上的8个食源性致病菌检测亚阵列可以清晰而又明确地区分目标致病菌样品和非目标致病菌样品。〈110><120><130〉<160〉<170〉SEQUENCELISTING(序列表)广东省疾病预防控制中心食源性致病菌检测的复合型基因芯片351Patentlnversion3.4<210><211><212〉<213><400〉ccgatgttgagyccactgct170画人工序列1tggtgcacatattcgtacactacttcttacgctattttatcgttatatgc6070<210>2<211>70<212>讓<213>人工序列<400>2ccgatgttgatggtgcacatattcgtacactacttcttacgctattttatcgttatatgc60gyccactgct70<210>3<211>70<212>讓<213>人工序列<400〉3gaaaaacaacctttacttcgtagaagtaaattggttaagttagaaagggcgcacggtgga60tgccttggca70<210〉4<211〉70<212>醒<213>人工序列<400>4gagaggtt8Ctctcttttatgtcagataaagt8tgcaaggcactatgcttg38gcatcgc60gccactacat70<210>5<211>70<212〉醒〈213〉人工序列<400>5tatagctcagctggttagagcgcacgcctgataagcgtgaggtcgatggttcgagtccat60ttaggcccac70<210>6〈211>70<212>DNA<213>人工序列〈400〉6ggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgaacgaacggaggaagagcttgctctt6070〈210〉7<211〉70<212>DNA<213>人工序列<400>7tgagtaacacgtgggcaacctgcctgtaagttggggataactccgggaaaccggggctaa60taccgaatga70<210>8<211>70〈212〉腿<213>人工序列<400>8gcgcatgccacgcttttgaaagatggtttcggctatcgcttacagatgggcccgcggtgc60attagctagt70<210>9<211>70<212>DNA<213>人工序列<400>9gaacaaggataagagtaactgcttgtcccttgacggtatctaaccagaaagccacggcta60actacgtgcc70<210>10<211>70<212>DNA<213〉人工序列<400>10gcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgcgcgcaggc60ggtcttttaa70<210>11<211〉70<212>DNA<213>人工序列<400>11gcaacccttgattttagttgccagcatttagttgggcactctaaagtgactgccggtgca603gCCgg3gg370〈210>12〈211〉70<212〉DNA<213>人工序列<400>12caaagggtcgcgaagccgcgaggtggagctaatcccataaaactattctcagttcggatt60gtsggctgC370<210>13<211>70〈212>DNA<213〉人工序列〈400〉13gagtttgtaacacccgaagtcggtagggtaacctttatggagccagccgccgaaggtggg60acagataatt70<210〉14〈211〉70<212>腿<213〉人工序列<400>14gttaagttagaaagggcgcacggtggatgccttggcactaggagccgaagaaggacggga60ctaacaccga70<210>15<211>70<212>腿〈213>人工序列<400>15ggat8gtatccttscgtgaatacstagcgtgsggsaggcsgaxccsgggsactgssscst60ctaagtacct70<210>16<211>70<212〉DNA<213〉人工序列<400>16agaaagttataaatgaagcggtxtggaaaggcccgccaaagacggtaacgtgcccggtagt60tg333tggCt70<210>17<211>70<212>腿<213>人工序列<400〉17agttagagcccgttaatgggtgatagcgtgccttttgtagaatgaaccggcgagttacga60tttgttgcaa70<210〉18<211>70<212>腿<213>人工序列〈400〉18aagcggagccgtagcgaaagcgagtctgaatagggcgcataagtaacaggtcgtagaccc60gaaacc8ggt70〈210〉19<211>70<212>DNA〈213>人工序列<400〉19tgtgggtagcggaga肌ttccaatcgaacttggagatagctggttctctccgaaatagct60tt3gggCt3g70<210>20<211>70<212>麵〈213>人工序列<400〉20ggcccttctcgggttaccgaattcagataaactccgaatgccatgtacttatactcggga60gtcagactgc70<210>21<211>70<212>廳<213>人工序列<400>21tctttagaggttcgtggtaggagagcgttctaagggcggtgaagtcagaccggaaggact60ggtggagcgc70<210>22<211〉70<212>醒<213>人工序列<400>22atatctaaggtttcctgaggaaggctcgtccgctcagggttagtcgggacctaagccgag60gccgataggc70<210>23<211>70<212>丽<213>人工序列<400>23agggaatcgcacgaatggaaatgtgcgtccaagcagtgagtgtgagaagtaggcaaatcc60gcttctcgcg70<210>24〈211〉70<212>麵〈213〉人工序列<400〉24agtactgcccgtaccgcaaaccgacacaggtagatgaggagagaatcctaaggtgagcga60gagaactctc70<210〉25<211>70〈212〉画<213>人工序列<400>25tataggggctgacgcctgcccggtgctggaaggttaagaggagtgcttagcttcggcgaa60ggtacgaatt70<210>26〈211>70〈212〉腿<213>人工序列〈400〉26gaagatgcaggttacccgcgacaggaxggaaagaccccgtggagctttactgcaacctga60tatggaatgt70〈210〉27〈211〉70<212>函<213>人工序列<400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