专利名称：一种食源性致病菌细胞死活的鉴别方法
技术领域：
本发明涉及微生物细胞活性检测方法，具体涉及一种食源性致病菌细胞死活的鉴别方法。
背景技术：
据世界卫生组织估计，全世界每年数以亿计的食源性疾病患者中，70%是由于各 种致病性微生物污染食品和饮用水引起。我国过去十年间食物中毒发生情况的统计表明， 微生物食物中毒居各类食物中毒病源的首位，约占食物中毒规模的40%，导致的中毒人数 占总中毒人数的一半以上。沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、大肠杆 菌、志贺氏菌、肉毒梭菌、单增李斯特菌等都是重要的食源性致病菌。其中，副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种嗜盐性细菌，主要分布于沿 岸海水、海河交界处及海产品中，并能以水和水生生物等为媒介，人食用了受该菌污染的海 产品后，会引起人类肠胃炎或食物中毒。轻症患者会出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐等症状， 重症患者还会脱水、休克昏迷，甚至死亡。近年来，副溶血性弧菌引起的食物中毒次数略高 于沙门氏菌引起的食物中毒次数，发生规模以及人群暴露规模亦呈明显上升趋势，成为微 生物食源性疾病的首要病因，特别是在一些沿海城市，由该菌引起的食物中毒占细菌性食 物中毒总数的61%以上，严重威胁人们的身体健康，越来越受到水产养殖和公共卫生机构 的重视。志贺菌(Shigella)通称痢疾杆菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，具有高 度传染性和严重危害性。据报道，每年因志贺氏菌引起食物中毒事件十分频繁，尤其以牲畜 禽肉和乳品的污染较为严重。人体在感染后会出现恶心、呕吐、腹痛等症状，严重威胁着消 费者的身体健康，造成了巨大的经济损失。因此，建立快速、灵敏、特异、简便有效的检测食 源性致病菌的方法具有重要意义。目前，食源性致病菌的检测方法主要采用增菌、选择性培养、生理生化鉴定、传统 PCR、实时定量荧光PCR等分子生物学方法以及血清学反应等技术。但以DNA为基础的PCR 检测方法因其能从活细胞和死细胞中扩增出目的基因，从而无法有效地区分活细胞和死细 胞，死细胞或自由状态的DNA已经没有危害性却仍然被检测出来，易出现假阳性结果，具有 较低的特异性和准确性。因而研究发明一种快速有效区分活细胞和死细胞的方法在食品卫 生检验及进出口商品检疫工作中十分重要。EMA(ethidium monoazide)是一种DNA结合染料，能渗透到细胞壁或细胞膜不完 整的死细胞内，在光激活的作用下，易形成氮宾化合物进而与DNA或其它分子共价结合，而 这种结合是不可逆的结合，从而抑制死细胞DNA的扩增，即未出现特异性扩增条带；而活细 胞完整的细胞壁或细胞膜能阻止EMA渗透到活细胞内，从而对活细胞的DNA不起作用。
发明内容
本发明目的在于根据现有PCR技术检测食源性致病菌时存在无法区别活细胞和 死细胞，检测的特异性和准确性较低的问题，通过将EMA选择渗透性和PCR检测技术相结合，建立一种快速、有效检测鉴别副溶血弧菌及其他食源性致病菌的死活细胞的新方法。本发明目的通过以下技术方案予以实现一种食源性致病菌细胞死活的鉴别方法，包括如下步骤取食源性致病菌细胞菌 悬液，加入终浓度为5 50 y g/mL的EMA并置于黑暗中3 lOmin后，冰浴条件下用卤素 灯曝光5 15min，提取菌液DNA，进行PCR扩增和电泳分析，当出现特异性扩增条带时，则 食源性致病菌细胞为活细胞；未出现特异性扩增条带时，食源性致病菌细胞为死细胞。本发明鉴别方法中，所述PCR扩增可以为如下步骤(1)取EMA处理后的菌液离心、弃上清、洗涤，加入TE重悬后100°C水浴，冷却、离 心，取上清液作为PCR模板；(2)PCR 反应体系为10 Xbuffer 缓冲液(含 20mmol/L Mg2+) 5 u L, lOmmol/LdNTP 2ii L，0. 6iimol/L 弓| 物 2ii L，TapDNA 聚合酶 1 y L(5U/y L)，DNA 模板 4 y L，加水补足到 50 u L ；PCR 反应循环参数为94°C预变性 5min，94°C 30s，58°C 30s，72°C 30s, 30 个循环，终 延伸 72 °C 7min。作为一种优选方案，本发明鉴定方法包括如下步骤(l)EMA处理食源性致病菌死/活细胞取一定浓度的食源性致病菌活/死细胞菌悬液各lmL置无菌离心管中，分别加入 终浓度为5 50 y g/mL的EMA并置于黑暗中3 lOmin，然后将离心管置于冰浴中且打开 管盖，用650W卤素灯曝光5 15min。(2)经EMA处理后菌液DNA模板的制备取EMA处理后菌液lmL于无菌离心管中，10000r/min离心5min，弃上清，用生理盐 水洗涤2 3次，加入TE 100 u L重悬，100°C水浴lOmin,冰浴中冷却lOmin, 12000r/min离 心5min，取上清液作为PCR模板。(3)PCR扩增反应PCR 反应体系10 X buffer 缓冲液(含 20mmol/L Mg2+)5u L, 10mmol/L dNTP2 u L, 0. 6u mol/L 引物 2 ii L，TapDNA 聚合酶 1 u L (5U/ u L)，DNA 模板 4u L,加水补足到 50 u L。PCR 反应的循环参数94°C预变性 5min ；94°C 30s,58°C 30s,72°C 30s，30 个循环； 终延伸72 °C 7min。(4)结果判定取5 u LPCR产物点样于琼脂糖凝胶中，100V电压电泳30min，在凝胶成像系统 中观察结果，当出现特异性扩增条带时，即为食源性致病菌活细胞阳性，当未出现特异性扩 增条带时，即为食源性致病菌活细胞阴性(即死细胞)。目前，容易引起食物中毒的食源性致病菌主要有副溶血弧菌和志贺氏菌等，因此 本发明中，主要以这两种菌为例来进行阐述。当受鉴定的菌为副溶血弧菌时，PCR扩增中所用的特异性引物是tlh基因引物，上 游引物序列如SEQ ID N0:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO 2所示。当受鉴定的菌为志贺氏菌时，PCR扩增中所用的特异性引物是ipaH基因引物，上 游引物序列如SEQ ID N0 3所示，下游引物序列如SEQ ID N0 4所示。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明鉴别方法可以快速检测出食源性致病菌特别是副溶血弧菌细胞的死活，避免在实际样品检测中产生假阳性结果，为食源性疾病的预防和控制提供可靠依据，为食品 卫生检验、进出口商品检疫工作提供科学方法和理论基础，可以广泛用于多个领域。
图1为EMA处理对副溶血弧菌活、死细胞PCR扩增的影响，其中，M是DL2000 DNA marker ；1 10是EMA处理不同浓度的副溶血弧菌活细胞；11 13是EMA处理不同浓度的 副溶血弧菌死细胞；14是阴性对照；图2为EMA处理对志贺氏菌活、死细胞PCR扩增的影响，其中，M是DL2000DNA marker ；2 7是EMA处理不同浓度的志贺氏菌活细胞；8 11是EMA处理不同浓度的志贺 氏菌死细胞；12是阴性对照。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1(l)EMA处理不同浓度的副溶血弧菌活/死细胞取不同浓度的副溶血弧菌活/死细胞菌悬液各lmL置无菌离心管中，分别加入终 浓度为5 50ii g/mL的EMA并置于黑暗中3 lOmin，将离心管置于冰浴中且打开管盖， 650W卤素灯曝光5 15min。(2)经EMA处理后副溶血弧菌DNA模板的制备取EMA处理后菌液lmL于无菌离心管中，10000r/min离心5min，弃上清，用生理盐 水洗涤2 3次，加入TE 100 u L重悬，100°C水浴lOmin,冰浴中冷却lOmin, 12000r/min离 心5min，取上清液作为PCR模板。(3)PCR扩增反应引物合成引物序列如下，扩增片段长度约为450bp。上游引物序列如SEQ ID NO 1所示，下游引物如SEQ ID NO 2所示。PCR 反应体系10 X buffer 缓冲液(含 20mmol/L Mg2+) 5 u L, lOmmol/L dNTP2 u L, 0. 6u mol/L 引物 2 ii L，TapDNA 聚合酶 1 u L (5U/ u L)，DNA 模板 4u L,加水补足到 50 u L。PCR 反应的循环参数94°C预变性 5min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s, 30 个循环； 终延伸72 °C 7min。(4)结果判定取5 ii L PCR产物点样于1 %琼脂糖凝胶中，100V电压电泳30min，在凝胶成像系 统中观察结果，当在450bp处出现特异性扩增条带时，即为副溶血弧菌活细胞阳性，当在 450bp处未出现特异性扩增条带时，即为副溶血弧菌活细胞阴性。实施例2(l)EMA处理不同活细胞比例的副溶血弧菌混合菌悬液将副溶血弧菌活细胞菌悬液和死细胞菌悬液(2. OX 107CFU/mL)配制含有100%、 75%,50%,25%,20%,10%,5%,4%,3%,2%,1%>0% (均为体积百分数)的活细胞菌悬 液混合体系，分别加入终浓度为5 50 y g/mL EMA并置于黑暗中3 lOmin，将离心管置于冰浴中且打开管盖，650W卤素灯曝光5 15min。(2)经EMA处理后副溶血弧菌DNA模板的制备取EMA处理后菌液lmL于无菌离心管中，10000r/min离心5min，弃上清，用生理盐 水洗涤2 3次，加入TE 100 u L重悬，100°C水浴lOmin,冰浴中冷却lOmin, 12000r/min离 心5min，取上清液作为PCR模板。(3)PCR扩增反应PCR 反应体系10 X buffer 缓冲液(含 20mmol/L Mg2+) 5 u L, lOmmol/L dNTP2 u L, 0. 6u mol/L 引物 2 ii L，TapDNA 聚合酶 1 u L (5U/ u L)，DNA 模板 4u L,加水补足到 50 u L。PCR 反应的循环参数94°C预变性 5min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s, 30 个循环； 终延伸72 °C 7min。(4)结果判定取5 ii L PCR产物点样于1 %琼脂糖凝胶中，100V电压电泳30min，在凝胶成像系 统中观察结果，当在450bp处出现特异性扩增条带时，即为副溶血弧菌活细胞阳性，当在 450bp处未出现特异性扩增条带时，即为副溶血弧菌活细胞阴性。实施例3(l)EMA处理不同浓度的志贺氏菌活/死细胞取不同浓度的志贺氏菌活/死细胞菌悬液各lmL置无菌离心管中，分别加入终浓 度为5 50 ii g/mL的EMA并置于黑暗中3 lOmin，将离心管置于冰浴中且打开管盖，650W 卤素灯曝光5 15min。(2)经EMA处理后志贺氏菌DNA模板的制备取EMA处理后菌液lmL于无菌离心管中，10000r/min离心5min，弃上清，用生理盐 水洗涤2 3次，加入TE 100 u L重悬，100°C水浴lOmin,冰浴中冷却lOmin, 12000r/min离 心5min，取上清液作为PCR模板。(3)PCR扩增反应引物合成引物序列如下，扩增片段长度约为250bp。上游引物如SEQ ID NO 3所示，下游引物如SEQ ID NO 4所示。PCR 反应体系10 X buffer 缓冲液(含 20mmol/L Mg2+) 5 u L, lOmmol/L dNTP2 u L, 0. 6u mol/L 引物 2 ii L，TapDNA 聚合酶 1 u L (5U/ u L)，DNA 模板 4u L,加水补足到 50 u L。PCR 反应的循环参数94°C预变性 5min ；94°C 30s，58°C 30s，72°C 30s，30 个循环； 终延伸72 °C 7min。(4)结果判定取5 ii L PCR产物点样于琼脂糖凝胶中，100V电压电泳30min，在凝胶成像系统 中观察结果，当在250bp处出现特异性扩增条带时，即为志贺氏菌活细胞阳性，当在250bp 处未出现特异性扩增条带时，即为志贺氏菌活细胞阴性。
权利要求
一种食源性致病菌细胞死活的鉴别方法，其特征在于包括如下步骤取食源性致病菌细胞菌悬液，加入终浓度为5～50μg/mL的EMA并置于黑暗中3～10min后，冰浴条件下用卤素灯曝光5～15min，提取菌液DNA，进行PCR扩增和电泳分析，当出现特异性扩增条带时，则食源性致病菌细胞为活细胞；未出现特异性扩增条带时，食源性致病菌细胞为死细胞。
2.根据权利要求1所述食源性致病菌细胞死活的鉴别方法，其特征在于所述PCR扩增 步骤如下(1)取EMA处理后的菌液离心、弃上清、洗涤，加入TE重悬后100°C水浴，冷却、离心，取 上清液作为PCR模板；(2)PCR反应体系为10Xbuffer缓冲液(含 20mmol/L Mg2+) 5 u L, lOmmol/LdNTP 2 u L, 0. 6u mol/L 引物 2 ii L，TapDNA 聚合酶 1 u L(5U/ u L)，DNA 模板 4u L,加水补足到 50 u L ； PCR反应循环参数为94°C预变性5min，94°C 30s,58°C 30s,72°C 30s，30个循环，终延伸 72 °C 7min。
3.根据权利要求1或2所述食源性致病菌细胞死活的鉴别方法，其特征在于所述食源 性致病菌为副溶血弧菌或志贺氏菌。
4.根据权利要求3所述食源性致病菌细胞死活的鉴别方法，其特征在于鉴别副溶血弧 菌细胞死活时所用的特异性引物是tlh基因引物，上游引物序列如SEQ ID NO :1所示，下游 引物序列如SEQ ID NO 2所示。
5.根据权利要求3所述食源性致病菌细胞死活的鉴别方法，其特征在于鉴别志贺氏菌 细胞死活时所用的特异性引物是ipaH基因引物，上游引物序列如SEQ ID NO :3所示，下游 引物序列如SEQ ID NO 4所示。
全文摘要
本发明公开了一种食源性致病菌细胞死活的鉴别方法。本发明鉴别方法包括如下步骤取食源性致病菌细胞菌悬液，加入终浓度为5～50μg/mL的EMA并置于黑暗中3～10min后，冰浴条件下用卤素灯曝光5～15min，提取菌液DNA，进行PCR和电泳分析，当出现特异性扩增条带时，则食源性致病菌细胞为活细胞；未出现特异性扩增条带时，食源性致病菌细胞为死细胞。通过本发明鉴别方法，可以快速检测出食源性致病菌特别是副溶血弧菌细胞的死活，避免在实际样品检测中产生假阳性结果，为食源性疾病的预防或控制提供可靠依据，也为食品卫生检验、进出口商品检疫工作提供科学方法和理论基础。
文档编号C12Q1/68GK101845492SQ201010105729
公开日2010年9月29日 申请日期2010年1月29日 优先权日2010年1月29日
发明者孙远明, 李青, 王丽, 钟青萍 申请人:华南农业大学