专利名称：：运用复合荧光pcr技术检测食源性致病弧菌的方法
技术领域：
：本发明涉及细菌检验技术，具体地说是运用荧光PCR反应来检测致病弧菌，特别是食源性致病弧菌的技术。
背景技术：
：食品中常见的致病菌是引起食物中毒的主要原因之一，可导致多种疾病发生，严重威胁着人们的健康，其中弧菌是危害较为严重的食源菌。快速、准确的检測食品中的致病菌是有效预防和控制病原菌感染的前提条件。随着分子生物学的发展，食品检验检疫工作中的细菌鉴定方法已经从传统的简单生化实验水平上向分子生物学的方法如PCR、探针杂交等技术发展，但是分子生物学的检测方法在短期内仍然难以代替传统的生化鉴定，目前分子生物学方法主要用于大量样品的初筛。需要检测的食源性弧菌主要包括以下几种副溶血弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌。
发明内容针对上述目标菌，本发明克服了现有技术中的缺点，提供一种运用复合荧光PCR技术快速低成本的检测副溶血弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌的方法。该方法包括应用该方法检测食源性病原微生物的所使用的引物组和与之配套的PCR反应条件。其中引物、探针的全部序列如下引物引物序列一5，CAACAATAAATTGTTGTTTTGTCAGCT弓I物序列二5'GGGCTATAGCTCAGCTGGGAGA引物序列三5，GAAAGATAAACACCAACAACACATT弓I物序列四5'CGATTAGCTCCACCACTGACTTC弓I物序列五5，CGAAGTCAGTGGTGGAGCTAATC引物序列六5'TGGTTTAGAAAGTTTAGAGTATCTTAGTGT本发明提供了更加快速和低成本通过荧光PCR方法检测食源性致病弧菌的方法。本发明是通过以下技术方案实现的(1)设计特异性寡核苷酸引物用于荧光染料嵌合荧光PCR技术检测(2)整合各引物使之不相互干扰。(3)以引物序列组，扩增待测样品模板，进行目的基因的特异性扩增(4)扩增过程中使用荧光PCR仪进行实时荧光光强度测量并在PCR反应结束后进行所合成DNA片段的熔解曲线的测定，并将数据传输至电脑通过配套软件进行分析可以观察到各种病原微生物的特异性熔解曲线的峰值。本发明用特异性的引物组扩增金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、15种肠杆菌和5种弧菌的基因组均产生荧光信号，并生成相应的熔解曲线峰值，均未发现假阳性和假阴性的结果。本发明中荧光PCR反应体系中各组分构成比例如下成分浓度加样量PCR体系预混合物2倍12.5fiL荧光嵌合法所用引物序列一1Ofimol/L0.3jiL荧光嵌合法所用引物序列二10阿ol/L荧光嵌合法所用引物序列三10拜ol/L0.6^L荧光嵌合法所用引物序列四10拜oI/L0.3|iL荧光嵌合法所用引物序列五10阿ol/L0.3jtL荧光嵌合法所用引物序列六10pmol/L0单DNA样品双蒸水总体积25nL荧光PCR扩增程序及测定扩增片段的熔解温度程序为(1)95*0IO分钟；(2)95"15秒；(3)65"C30秒；(4)回到第2步，重复40次；(5)95*C2分(6)梯度升温601C至95*C每秒上升0.2"0。荧光PCR结果在扩增过程中使用荧光PCR仪进行实时荧光光强度测量，并在PCR扩增程序结束后进行梯度升温测定扩增片段的熔解温度.将数据传输至电脑通过配套软件进行分析可以观察到进行特异性扩增产生的荧光，得到对副溶血弧菌的特异性片段所特有的熔解曲线双峰值(主峰85"Ci(U"C和次峰761C±0.31C);创伤弧菌的特异性片段所特有的熔解曲线双峰值(主峰761Cia3^C和次峰8化±0.30;霍乱弧菌的特异性片段所特有的熔解曲线三峰值(主峰74*C±0.3"、第一次峰77t:士0.3r和第二次峰84"0±0.3")。如果得到对副溶血弧菌的特异性片段所特有的熔解曲线双峰值(主峰85TC士0.3"C和次峰761C±0.3*C):则证明待测样品中含有副溶血弧菌，如果得到对创伤弧菌的特异性片段所特有的熔解曲线双峰值(主峰76"±0.3"和次峰84"±0.3")则证明待测样品中含有创伤弧菌如果得到对霍乱弧菌的特异性片段所特有的熔解曲线三峰值(主峰74X^t(U"C、第一次峰77"±0.3"和第二次峰84"±0.3")则说明待测样品中含有霍乱弧菌。与现有技术相比，本发明的有益效果是基于荧光PCR的鉴定方法适用于直接从患者含菌体液、食品和体液培养物等临床样品中扩增靶基因，从而细菌，而且使用本方法只需要一次一管荧光PCR反应就能够检测出副溶血弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌是否存在，能够节约检测成本和时间。荧光PCR方法具有检测准确、特异性强、灵敏度高的特点，可以快速、准确地鉴定特异的目标细菌。它用PCR的方法扩增细菌靶基因，避免了反复培养，节约时间；PCR鉴定方法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确。图1某待测带鱼样品中复合荧光PCR技术检测待测样品DNA，SYBRGreen荧光信号强度。图2某待测带鱼样品中复合荧光PCR技术检测待测样品DNA,扩增产物熔解温度峰值。图3某待测鱼丸样品中复合荧光PCR技术检测待测样品DNA,SYBRGreen荧光信号强度。图4某待测鱼丸样品中复合荧光PCR技术检测待测样品DNA，扩增产物熔解温度峰值。图5某待测海带样品中复合荧光PCR技术检测待测样品DNA,SYBRGreen荧光信号强度。图6某待测海带样品中复合荧光PCR技术检测待測样品DNA,扩增产物熔解温度峰值。具体实施例方式下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述。实施例l样本某处出口带鱼。用常规生理、生化方法检测出副溶血弧菌疑似菌落，然后进行如下复合荧光PCR技术检测食源性致病菌的检测1.样品处理(1)取100克待检样品，粉碎。(2)溶解于1升营养肉汤中37"培养8小时。2.DNA抽提取营养肉汤lmL在冰浴中静置5分钟，然后在室温下12000转/分钟，离心5分钟，弃上清液，加入100nL溶菌酶溶液，371C保温10分钟，补加TE缓冲液50(HiL,振荡混匀。加同体积Tris饱和鼢(pH8.0),强烈振荡，12000转/分钟离心3分钟，取上清液，重复酚抽提。取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(2mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，12000转/分钟，离心5分钟，弃上清，加70%冷乙醉洗涤一次，室温下12000转/分钟，离心5分钟，弃上清，加入50jiLTE溶液，置-20TC保存。3.PCR扩增PCR反应体系中各组分构成比例如下成分浓度加样量PCR体系预混合物2倍12早荧光嵌合法所用引物序列一10拜ol/L0.3jiL荧光嵌合法所用引物序列二10拜ol/L0早荧光嵌合法所用引物序列三1(Hunol/L0.6pL荧光嵌合法所用引物序列四10拜1/L0.3jiL荧光嵌合法所用引物序列五10阿ol/L0.3jiL荧光嵌合法所用引物序列六10,ol/L0.6^LDNA样品14双蒸水总体积25fiL荧光PCR扩增程序及测定扩增片段的熔解温度程序为(1)95"CIO分钟；(2)95"C15秒；(3)65"C30秒(4)回到第2步，重复40次；(5)95*02分；(6)梯度升温60"至951C每秒上升0.2匸。PCR共进行2管PCR实验，其中DNA样品所加入的分别为本待测样品DNA:无样品的阴性对照。4.被检测样品荧光PCR图谱观察荧光PCR过程中可以观察到本待测样品产生了明显的SYBRGreen荧光，结果如图1。阴性对照在PCR过程中没有产生SYBRGreen荧光结果，在通过观测扩增产物熔解温度的荧光曲线，可以发现副溶血弧菌的特征双峰值(主峰85<0±0.3<0和次峰7610±0.3<0)如图2。图1中的曲线所代表的SYBRGreen荧光强度信号是样品中DNA扩增结果。图2中的曲线所代表的熔解温度峰值是样品中副溶血弧菌的特征峰值(主峰85^Cia3"C和次峰76"±0.310)。实验表明样品中含有副溶血弧菌。3天后，通过常规微生物培养和生化检测证明，所检验的目的菌落为副溶血弧菌，将其中一个菌株命名为CIQV6。荧光PCR检验结果与生化检测结果一致。实施例2样本某处出口鱼丸。用常规生理、生化方法检测出创伤弧菌疑似菌落，然后进行如下复合荧光PCR技术检测食源性致病弧菌的检测1.样品处理(1)取100克待检样品，粉碎。(2)溶解于1升营养肉汤中371C培养8小时。2.DNA抽提取营养肉汤lmL在冰浴中静置5分钟，然后在室温下12000转/分钟，离心5分钟，弃上清液，加入100jiL溶菌酶溶液，37*0保温10分钟，补加TE缓冲液500nL,振荡混匀。加同体积Tris饱和酚(pH8.0)，强烈振荡，12000转/分钟离心3分钟，取上清液，重复酚抽提。取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(2mol/L),混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，12000转/分钟，离心5分钟，弃上清，加70%冷乙醇洗涤一次，室温下12000转/分钟，离心5分钟，弃上清，加入50nLTE溶液，置-20TC保存。3.PCR扩增PCR反应体系中各组分构成比例如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>双蒸水9.1^L总体积25jiL荧光PCR扩增程序及测定扩增片段的熔解温度程序为(1)95*0IO分钟(2)951C15秒；(3)65*C30秒；(4)回到第2步，重复40次(5)95"2分；(6)梯度升温60"至95X:每秒上升0,2"C。PCR共进行2管PCR实验，其中DNA样品所加入的分别为本待测样品DNA;无样品的阴性对照。4.被检测样品荧光PCR图谱观察荧光PCR过程中可以观察到本待测样品产生了明显的SYBRGreen荧光，结果如图3。阴性对照在PCR过程中没有产生SYBRGreen荧光结果，在通过观测扩增产物熔解温度的荧光曲线，可以发现创伤弧菌(主峰76"±0.3*0和次峰84*0±0.310)如图4。图3中的曲线所代表的SYBRGreen荧光强度信号是样品中DNA扩增结果。图4中的曲线所代表的熔解温度峰值是样品中创伤弧菌的特征峰值(主峰76*0±0.3*0和次峰84"±0.3")"C。实验表明样品中含有创伤弧菌。3天后，通过常规微生物培养和生化检测证明，所检验的目的菌落为创伤弧菌，将其中一个菌株命名为CIQVll。荧光PCR检验结果与生化检测结果一致。实施例3样本某处出口海带。用常规生理、生化方法检测出霍乱弧菌疑似菌落，然后进行如下复合荧光PCR技术检测食源性致病菌的检测1.样品处理(1)取100克待检样品，粉碎，(2)溶解于1升营养肉汤中37X:培养8小时，2.DNA抽提取营养肉汤lmL在冰浴中静置5分钟，然后在室温下12000转/分钟，离心5分钟，弃上清液，加入l(KHiL溶菌醸溶液，37"保温10分钟，补加TE缓冲液5(XHiL,振荡混匀。加同体积Tris饱和酚(pH8.0),强烈振荡，12000转/分钟离心3分钟，取上清液，重复酚抽提。取上清液，加入O.l倍体积的乙酸钠(2mol/L),混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，12000转/分钟，离心5分钟，弃上清，加70%冷乙醇洗涤一次，室温下12000转/分钟，离心5分钟，弃上清，加入5(HiLTE溶液，置-20X;保存，3.PCR扩增PCR反应体系中各组分构成比例如下-成分浓度加样量PCR体系预混合物2倍12单荧光嵌合法所用引物序列一0.3jiL荧光嵌合法所用引物序列二1O萍ol/L0早荧光嵌合法所用引物序列三io拜iyL0单荧光嵌合法所用引物序列四1(Hunol/L荧光嵌合法所用引物序列五1O拜ol/L荧光嵌合法所用引物序列六10萍ol/L0单DNA样品双蒸水9.叫总体积25荧光PCR扩增程序及测定扩增片段的熔解温度程序为(1)95"CIO分钟(2)95"C15秒；(3)65"C30秒(4)回到第2步，重复40次(5)951C2分；(6)梯度升温601C至每秒上升0.210。PCR共进行2管PCR实验，其中DNA样品所加入的分别为本待測样品DNA:无样品的阴性对照。4.被检測样品荧光PCR图谱观察荧光PCR过程中可以观察到本待测样品产生了明显的SYBRGreen荧光，结果如图5。阴性对照在PCR过程中没有产生SYBRGreen荧光结果，在通过观測扩增产物熔解温度的荧光曲线，可以发现霍乱弧菌的特征峰值(主峰7410±0.3"、第一次峰77TCiO,3lC和第二次峰84tl±0.3r)。图5中的曲线所代表的SYBRGreen荧光强度信号是样品中DNA扩增结果.图6中的曲线所代表的熔解温度峰值是样品中霍乱弧菌的特征峰值(主峰74*C±0.31C、第一次峰77"±0.310和第二次峰841C±0.3r〉T。实验表明样品中含有霍乱弧菌.5天后，通过常规微生物培养和生化检测证明，所检验的目的菌落为霍乱弧菌，将其中一个菌株命名为CIQV30。荧光PCR检验结果与生化检测结果一致，序列列表SEQUENCELISTING<110>中华人民共和国天津出入境检验检疫局<120>运用复合荧光PCR技术检测食源性致病弧菌的方法<130>2007118<160>6<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>27<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer—bind<222>(1)..(27)<400>1caacaata助ttgttgttttgtoagct27<210>2<211>22<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer一bind<222>(1)"(22)<400>2鹏ctatagctoagct鹏aga<210>3<211>25<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer一bind<222>(1)..(25)<400>3gaaagataaacaccaacaacacatt<210>4<211>23<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer一bind<222>(1)"(23)<400>4cgattagctccaccactgac加<210>5<211>23<212>DNA<213>人工合成<220><221>jnimer一bind<222>(1)..(23)<400>cgaagtcagtggtggagctaate<210>6<211>30<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer—bind<222>(1)"(30)<400>6tggtttagaaagtttagagtatcttagtgt30权利要求1.一种运用复合荧光PCR技术检测食源性致病弧菌的方法，其特征在于，所使用的引物组序列如下引物引物序列一5’CAACAATAAATTGTTGTTTTGTCAGCT引物序列二5’GGGCTATAGCTCAGCTGGGAGA引物序列三5’GAAAGATAAACACCAACAACACATT引物序列四5’CGATTAGCTCCACCACTGACTTC引物序列五5’CGAAGTCAGTGGTGGAGCTAATC引物序列六5’TGGTTTAGAAAGTTTAGAGTATCTTAGTGT。2.根据权利要求1所述的一种运用复合荧光PCR技术检測食源性致病弧菌的方法,其特征在于，PCR反应体系1中各组分构成比例如下成分PCR体系预混合物引物序列一引物序列二.引物序列三引物序列四引物序列五引物序列六DNA样品双蒸水总体积3.根据权利要求1所述的-浓度2倍10pmol/L10^mol/L10|xmol/L10拜ol/L加样量12单0.3fiL0.6fiL0.3fiL0单9.1425，-种运用复合荧光PCR技术检測食源性致病弧菌的方法,其特征在于，荧光PCR扩增程序及測定扩增片段的熔解温度程序为(1)951CIO分钟(2)95"15秒(3)651C30秒(4)回到第(2)步，重复40次(5)95"2分(6)梯度升温60*C至95"C每秒上升0.210,4.权利要求1所述的一种运用复合荧光PCR技术在检測食源性致病弧菌方面的应用。全文摘要本发明公开了一种运用复合荧光PCR技术检测食源性致病弧菌的方法，属于细菌检验
技术领域：
，主要的技术方案是设计了引物组序列。致病弧菌是食品中常见的致病菌，感染弧菌后影响十分严重。快速、准确的检测食品中的致病弧菌是有效预防和控制病原菌感染的重要条件。需要检测的食源性致病弧菌主要包括以下几种副溶血弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌。针对上述目标菌，本发明克服了现有技术中的缺点，提供一种运用复合荧光PCR技术快速低成本的检测副溶血弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌的方法。该方法可以使用一管PCR反应，能够初筛出上述几种病原微生物。文档编号C12Q1/04GK101113473SQ200710057580公开日2008年1月30日申请日期2007年6月7日优先权日2007年6月7日发明者佳于,寅刘,叶露萌,唐丹舟,张宏伟,李永君,郑文杰,魏亚东,黄熙泰申请人:天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心;南开大学