专利名称：玉米Opaque5基因的分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种玉米0paque5基因的分子标记及其应用。
背景技术：
玉米(Zea mays)是世界上分布最广的粮食作物之一，栽培面积仅次于小麦和水 稻，位居世界第三位。它是全世界同时也是我国主要的粮食和饲料作物。据FAO统计，从 1998年起，玉米总产量已超过小麦和水稻成为世界第一大粮食作物。玉米的主要生产性状 包括产量和品质两个方面。由于玉米的主要用途是作为饲料，因此籽粒的营养品质是更为 重要的指标。玉米籽粒的营养品质主要是在蛋白方面。玉米籽粒含有约10%的蛋白，但由 于储藏蛋白氨基酸种类上的偏好，因此有些必需氨基酸比较缺乏，其中最重要的是赖氨酸 的含量。因此一般玉米籽粒的蛋白品质较差，只有高赖氨酸的玉米才具有较好的蛋白品质。 此外，玉米籽粒的含油量也是一个重要的营养品质。从饲料的角度，在蛋白和淀粉含量较为 一致的情况下，含油量越高的玉米则具备越好的营养品质。玉米在品质性状的改造上有赖于一些籽粒的突变体。在玉米中有一类与蛋白品质 相关的突变体，被称为高赖氨酸突变体。这类突变体一般具有不透明或粉质的籽粒，在玉米 遗传上被称为Opaque或Floury突变体。这类突变体能够显著改善玉米籽粒中赖氨酸等必 需氨基酸的含量，从而显著提高玉米在蛋白水平的营养品质。其中最为有名的是0paqUe2 突变体(02)，02已经被广泛应用在高赖氨酸玉米的育种实践中。此外，0paqUe5(简称05) 也是一个类似的高赖氨酸突变体。对05突变体的遗传学分析，表明05是单基因控制的隐 性突变，能够引起玉米籽粒的不透明(Opaque)性状(见附图3和图4)。由图可知，与野生 型籽粒相比，05突变体籽粒总油量提高约30%，籽粒中高含量的主要油脂种类(棕榈酸、油 酸和亚油酸)其含量也普遍高于野生型籽粒，其中棕榈酸、油酸和亚油酸分别比野生型提 高25%、38%和22%。05突变体籽粒中其它重要油脂种类含量也显著比野生型籽粒高，其 中最明显的是硬脂酸C18:0提高约55%，亚麻酸C18:3含量提高一倍。与在高赖氨酸玉米 育种中已经广泛应用的02 —样，研究发现05突变体籽粒的赖氨酸含量也明显高于野生型 籽粒，因此也是一个能提高籽粒蛋白品质的重要突变体。同时我们实验室的研究结果表明， 05不仅可以提高籽粒的赖氨酸含量，而且也能显著提高籽粒的含油量。我们用高效液相色 谱方法分别测定了 05突变体和野生型籽粒的油脂含量，研究发现05突变体的油脂含量普 遍高于野生型，尤其是C18 0硬脂酸，C18 3亚麻酸等脂肪酸链的含量显著高于野生型。这 为高油玉米的育种提供了一个新的途径。如能将05突变体引入生产品种，则能进一步提高 籽粒的含油量，培育出高油脂含量的玉米新品种。因此，05突变体可以同时改善玉米籽粒 的蛋白和油脂含量品质，对培育综合品质更高的玉米油很好的应用价值。经典的遗传学研究将05基因定位在第7号染色体长臂的Bin7. 02。目前05基因 尚未被克隆，而且05基因至今尚未通过杂交育种被很好地利用，主要是因为05由隐性基因 突变引起，通过杂交选育需要较长的时间。DNA分子标记辅助育种是一项新的育种技术，该 技术是通过利用与目标性状基因紧密连锁的DNA分子标记对控制目标性状的基因进行间接选择的现代育种技术。该技术对目标基因的转移，不仅可在早期进行准确、稳定的选择， 而且可克服再度利用隐性基因识别难的问题，从而加速育种进程，提高育种效率。与常规育 种相比，该技术可提高育种效率2-3倍。DNA分子标记辅助育种技术的关键是(1)获得的分子标记应该是能够区分育种 过程中杂交亲本(纯合05类型和纯合野生型类型)以及它们杂交子代(Fl代)的共显性 标记；(2)获得的共显性分子标记位于该基因在染色体物理位置的两侧；(3)两侧的DNA分 子标记都应该与控制目标性状的基因紧密连锁。但是，以往研究中并没有获得位于05基因 染色体物理位置两侧的与其紧密连锁的共显性DNA分子标记，故无法对该基因所控制的目 标性状进行DNA分子标记辅助选择。所以，对于该种标记的获得和鉴定是对控制玉米籽粒 含油量农艺性状的05基因进行DNA分子标记辅助育种的基础。
发明内容
本发明的目的之一在于提供玉米0paqUe5基因的分子标记。本发明的目的之二在于提供该分子标记的用途。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案一种玉米0paque5基因的分子标记，其特征在于扩增DNA片断SSR9890的特异性引物及碱基序列为正向引物从5'端至 3'端为CATGCACCCTTTAGTGTAACAC ；反向引物从5 ‘端至 3 ‘端为GGTACATACATGCAATTTTCGT ；扩增DNA片断SSR7673的特异性引物及碱基序列为正向引物从5'端至 3,端为GCCGCTTTAATTTGGCTATTAT ；反向引物从5'端至 3'端为GCATTGGCAAGAGCACACTA。一种上述的玉米0paqUe5基因的分子标记在检测和区分玉米育种过程中杂交亲 本以及它们杂交子代类型中的应用。本发明中使用的遗传资源玉米0paque5突变体是上海大学宋任涛教授在2004年 6月回国时向美国美国伊利诺伊大学厄本那香槟分校的玉米遗传学合作中心索取的。经查 证该遗传种质为美国伊利诺伊大学厄本那香槟分校的艾尔.皮特尔博士和马蒂萨克斯博 士于1993年1月向玉米遗传学合作中心捐赠的。本发明利用高油玉米(05/05)与其他具 优良性状的玉米杂交获得Fl代，Fl代自交后筛选具有目的性状的高油玉米F2，F2代多次 自交，最终获得稳定的纯合体。本发明提供的2个位于05基因染色体物理位置两侧的与其紧密连锁的共显性DNA 分子标记，以及利用这两个共显性DNA分子标记对05基因进行分子标记辅助选择的方法。 利用这两个分子标记能对玉米任何时期和任何组织的DNA进行基因型鉴定，检测杂交育种 子代各单株中05基因的存在与否以及杂合或纯合状态。这种检测方法的准确性高，操作简 单，为利用05基因的DNA分子标记辅助育种提供重要的技术手段。
图1是玉米籽粒野生型(+/+)图2为玉米籽粒纯合突变体外形图(05/05)；
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图3比较了 05和野生型籽粒中含量较高的主要油脂种类C16:0(棕榈酸)、 〇18:1(油酸)、(18:2(亚油酸)和总OIL的含量变化图；图4比较了 05和野生型籽粒中其它重要油脂种类C14:0 (豆蔻酸)、C16:1 (棕榈 油酸)、C18:0(硬脂酸)、C18:3(亚麻酸)、C20:0(花生酸)、C20:1(花生油酸)、C22:0(山 嵛酸)、C24:0 (木焦油酸)共8种植物中主要脂肪酸的含量变化。图5是用于进行05基因定位的BC群体构建路线；图6是标记SSR9890在BC群体中的分离情况，其中05/05为纯合体；05/+为杂合 体；-为负对照；图7是标记SSR7673在BC群体中的分离情况，其中05/05为纯合体；05/+为杂合 体；-为负对照；图8是本发明中分子标记在玉米七号染色体长臂上的示意位置，其中CEN7代表七 号染色体着丝粒，TEL代表端粒；图9是标记SSR9890在不同自交系间的多态情况；-为负对照；图10是标记SSR7673在不同自交系间的多态情况。-为负对照。
具体实施例方式下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常 规条件,如分子克隆(Molecular Cloning =A Laboratory Manual, 3rd ed.)或植物分子生 物学一实验手册(Plant Molecular Biology-Α Laboratory Manual, Melody S. Clark 编， Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例一利用05突变体(05/05)培育高油玉米把05突变纯合体(05/05)与其他具有优良生产性状的玉米杂交，然后Fl代自交， 在F2代中分离出高油玉米籽粒的双隐性纯合体。该双隐性纯合体经多代自交，轮回选择， 逐代选择籽粒发育好，含油量高的种子，最终获得稳定的双隐性纯合体，高油分自交系或群 体。利用不同亲缘关系的但都为同类高油双隐性材料作为亲本，组配杂交种。Fl杂交种经 隔离种植，即获得高油商品玉米。由于05突变体的特性，该高油品质同时也具有高赖氨酸 品质。实施例二 两个共显性分子标记的获得及与05连锁关系的确定图1和图2为玉米籽粒野生型(+/+)与玉米籽粒纯合突变体外形图。通过纯合突 变体(05/05)与纯合野生型(+/+)杂交获得Fl (05/+)，然后以Fl为母本，纯合突变体为父 本进行回交构建回交(BC)群体，参见图5。BC群体中出现了基因型分离，包含05/+与05/ 05两种基因型，具有05/+基因型的与+/+基因型的籽粒均为非Opaque的野生型类型幼苗 正常，具有05/05基因型的籽粒为Opaque的突变体类型。本发明通过经典的遗传定位获知05基因定位在玉米第7号染色体的长臂上 (Bin7.02)。通过在05位点附近为纯合突变体和纯合野生型的植株构建的回交群体(BC)， 提取纯合突变体、野生型以及BC群体各单株的基因组DNA。在前人粗定位的基础上，通过 筛选已有的SSR分子标记，获取有多态性的SSR类型分子标记(umc2092与umcl393)，将05 基因定位于分子标记umc2092与umcl393之间。然而这两个标记和05的连锁性并不十分
5紧密，在实际使用上仍有一定的问题。因此根据umc2092与umcl393之间已知的B73基因 组序列(http://www. genome, arizona. edu/fpc/maize)，设计引物。扩增 DNA 片断 SSR9890 的特异性引物及碱基序列为正向引物从5'端至 3'端为CATGCACCCTTTAGTGTAACAC ；反向引物从5 ‘端至 3 ‘端为GGTACATACATGCAATTTTCGT ；扩增DNA片断SSR7673的特异性引物及碱基序列为正向引物从5'端至 3,端为GCCGCTTTAATTTGGCTATTAT ；反向引物从5'端至 3'端为GCATTGGCAAGAGCACACTA。通过测序以及序列比对，获得纯合突变体与纯合野生型亲本间的序列差异，并通 过所测序列开发标记，获得能够区分育种过程中杂交亲本(纯合05类型和纯合野生型类 型)以及它们杂交子代(Fl代)的共显性分子标记SSR9890与SSR7673。以遗传学中两点与三点测验对这2个共显性分子标记与05基因的遗传连锁关系 进行分析表明，这两个标记位于05基因染色体物理位置的两侧，并且均与该基因紧密连锁 (见附图 8)。以 SSR9890 与 SSR7673 对 05 与 B73、Mol7、W22、W64A 和 BSSS53 进行 PCR 扩 增和凝胶电泳分析表明，SSR9890在05与Mol7、W22都具有多态性(见附图9)，SSR7673在 05与Mol7、W22、W64A和BSSS53都具有多态性(见附图10)。使用这对标记进行辅助选择 准确度很高，在背景Mol7和05纯合野生型中，标记SSR9890的交换率为9. 52X10—4，标记 SSR7673的交换率为9. 52 X 10_4，使用这两个标记确定05基因的错选率仅为9. 06X 10_7。分子标记在不同的基因组背景下PCR扩增，观察带型，判断与05的连锁关系，参见 图6和图7。实施例三分子标记在不同亲本间的多态性鉴定提取05、野生型和五种育种中广泛使用的自交系B73、W22、Mo 17、W64A和BSSS53的 基因组DNA，通过PCR反应分析在不同品种间的多态性。结果表明，使用本发明中的分子标 记SSR7673可以区别05与Mol7、W22、W64A和BSSS53这四种自交系。在以W22、Mol7、W64A 和BSSS53这四种自交系为背景导入05基因进行优质蛋白玉米育种时，分子标记SSR7673 可以起到对05基因进行辅助选择的作用，参见图7。分子标记SSR9890可以区别05与W22、 M017这两种自交系，参见图8。实施例四SSR9890和SSR7673对05基因分子标记辅助选择的方法利用这两个共显性分子标记SSR9890和SSR7673，可以鉴定05的基因型。分子标 记SSR9890和SSR7673对某一杂交组合中的子代进行分析，两侧标记同为野生型(Mol7)类 型条带植株的基因型即为野生型，两侧的分子标记同为杂合体(如Fl)类型条带植株的基 因型即为杂合体，两侧的分子标记同为05/05纯和突变体类型条带植株的基因型即为突变 体。通过这两个分子标记对杂交育种时子代各个单株进行基因型鉴定的准确性很高，错选 概率仅为9. 06X10_7，所以这两种分子标记对利用05基因进行育种时具有重要的辅助作 用。
权利要求
一种玉米Opaque5基因的分子标记，其特征在于扩增DNA片断SSR9890的特异性引物及碱基序列为正向引物从5′端至3′端为CATGCACCCTTTAGTGTAACAC；反向引物从5′端至3′端为GGTACATACATGCAATTTTCGT；扩增DNA片断SSR7673的特异性引物及碱基序列为正向引物从5′端至3′端为GCCGCTTTAATTTGGCTATTAT；反向引物从5′端至3′端为GCATTGGCAAGAGCACACTA。
2.一种根据权利要求1所述的玉米0paqUe5基因的分子标记在检测和区分玉米育种过 程中杂交亲本以及它们杂交子代类型中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种玉米Opaque5基因的分子标记及其应用。本分支标记扩增DNA片断SSR9890的特异性引物及碱基序列为正向引物从5′端至3′端为CATGCACCCTTTAGTGTAACAC；反向引物从5′端至3′端为GGTACATACATGCAATTTTCGT；扩增DNA片断SSR7673的特异性引物及碱基序列为正向引物从5′端至3′端为GCCGCTTTAATTTGGCTATTAT；反向引物从5′端至3′端为GCATTGGCAAGAGCACACTA。利用这两个分子标记能对玉米任何时期和任何组织的DNA进行基因型鉴定，检测杂交育种子代各单株中O5基因的存在与否以及杂合或纯合状态。这种检测方法的准确性高，操作简单，为利用O5基因的DNA分子标记辅助育种提供重要的技术手段。
文档编号C12Q1/68GK101948830SQ20101019317
公开日2011年1月19日 申请日期2010年6月4日 优先权日2010年6月4日
发明者刘虎, 宋任涛, 张晓维, 王刚, 王桂凤, 王飞, 陈超, 高强 申请人:上海大学