玉米oxs2基因家族、其编码蛋白及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及玉米0XS2基因家族、其编码蛋白及应用。【背景技术】
[0002] 目前，世界上的许多耕地都有轻度的重金属污染，这些重金属污染物主要有镉、 铜、锌、镍、钴、铅、砷等。这些重金属污染主要是由于长期使用磷酸肥料、污水处理不利、工 业废料的污染、农业灌溉的不科学造成的。植物体在面对这些重金属胁迫时一方面会产生 活性氧（R0S)。在植物中，大多数金属产生活性氧（R0S)是重金属毒性的间接作用结果。这 种间接的作用包括它们与抗氧化系统的反应，扰乱电子传递链，或者扰乱新陈代谢的必需 元素的合成。植物体中，重金属胁迫所造成的另一个较严重的结果就是脂质的过氧化，这种 脂质的过氧化可以导致生物膜的损伤。丙二醛（MDA)是生物膜中多不饱和脂肪酸的一种重 要的分解产物，可以用来作为生物膜氧化胁迫的指示剂。重金属会导致植物体出现很多的 病症。以镉为例，镉（Cd)是一种高毒性的重金属。镉处理会抑制植物的很多生理过程，比 如光合作用、细胞延长、固氮和矿物营养吸收等。耕地中镉的正常含量不能超过100 mg/kg。 植物体处于镉胁迫时，就会出现光合效率降低、水分吸收降低以及营养吸收降低等性状。植 物在含有过多的隔的土壤中，会出现萎黄病、生长抑制并最终导致植物体死亡。
[0003] 玉米(学名：為a船_^)是重要的粮食作物和饲料来源，也是全世界总产量最高的 粮食作物，目前也是我国种植面积最大的农作物。现代科技条件下，玉米深加工被广泛应用 于食品工业，医药工业和化学工业，具有广阔的应用前景。但是，随着耕地污染的加重，各种 主要的农作物的产量，包括玉米在内都受到严重的影响。所以，研究玉米中的抗性基因及其 功能，对于提高玉米以及其他粮食作物的增产具有重大意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供玉米0XS2基因家族、其编码蛋白及应用。
[0005] 本发明所采取的技术方案是： 玉米0XS2蛋白，其含有如下（1)- (4)任一项所示的氨基酸序列： (1) SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列； (2) SEQ ID N0. 4所示的氨基酸序列； (3) SEQ ID N0. 6所示的氨基酸序列； (4) SEQ ID N0. 2或SEQ ID N0. 4或SEQ ID N0. 6所示的氨基酸序列经取代、缺失和/ 或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后且具有提高植物抗逆功能的序列。
[0006] 编码玉米0XS2蛋白的基因。
[0007] 玉米0XS2蛋白AT3片段，其含有如下（1)- (3)任一项所示的氨基酸序列： (1) SEQ ID N0. 7所示的氨基酸序列； (2) SEQ ID N0. 9所示的氨基酸序列； (3) SEQ ID N0. 7或SEQ ID N0. 9所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多 个氣基酸和/或末端修饰后且具有提尚植物抗逆功能的序列。
[0008] 编码AT3片段的基因。
[0009] 含有玉米0XS2蛋白编码基因序列或AT3片段编码基因序列的重组载体、重组菌或 转基因细胞系、转基因植物株系。
[0010] 玉米0XS2蛋白、其编码基因或AT3片段、其编码基因在培育抗逆植物中的应用。
[0011] 玉米0XS2蛋白、其编码基因或AT3片段、其编码基因在抗逆植物辅助育种中的应 用。
[0012] 所述抗逆性状包括抗重金属污染，抗氧化胁迫、抗高温胁迫、抗低温胁迫、抗盐碱、 抗旱、抗病虫害中的至少一种。
[0013] 所述重金属包括镉、汞、金、银、铜、铁、铅、砷、铬中的至少一种。
[0014] -种抗逆植物的培育方法，包括将玉米0XS2蛋白编码基因序列或AT3片段编码基 因序列转入受体植物中，得到转基因植物；所述转基因植物与受体植物相比，其对逆境的抗 性提尚°
[0015] 本发明的有益效果是： 本发明在玉米中克隆了 0XS2的两个同源基因办与这两个基因的表达 都可以被重金属胁迫诱导。当它们在拟南芥中大量表达时，可以特异性地增强拟南芥抗重 金属镉（Cd)的能力。因此，这两个基因将具有极大的潜力应用于培育具有抗重金属的转基 因作物中，从而提高粮食作物的产量。
【附图说明】
[0016] 图1为与办似以基因PCR产物的1%的琼脂糖凝胶电泳图； 图2为玉米中与似Z7的基因结构示意图（蓝色长方型：ANKYRIN重复序列； 红色长方形：锌指结构域；绿色方框：多聚谷氨酰胺序列；倒三角：预测出核序列；黑色长 条:AT3片段；所有蛋白编码区中并不存在内含子。数字表示从转录起始位点开始的DNA基 因组位置）； 图3为qRT-PCR检测的与办的相对表达量(生长15天的玉米植株使其 处于0或者200剛CdCl2处理下，误差线表示三次独立实验的标准差）； 图4为滴板检测片段在粟酒裂殖酵母中的组成型表达(用转化空 载体的酵母作为负对照，三角形表示，浓度依次十倍稀释）； 图5拟南芥种子种植在水平放置的1/2MS与含有75 y M CdCl2浓度的1/2MS培养基 上11天(每种转基因植株的三个独立的转基因株系被用来检测）； 图6为生长在1/2MS与含有75 yM CdClJ^l/2MS培养基上11天的拟南芥幼苗（5 棵)的鲜重(每个株系不少于20棵幼苗被用来测量，误差线表示三次独立重复实验的标准偏 差）； 图7为拟南芥种子种植在竖直放置的1/2MS与含有75 y M CdCl2浓度的1/2MS培养 基上11天(每种转基因植株的三个独立的转基因株系被用来检测)。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0018] 以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、 DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子 克隆实验指南》（第三版）（Sambrook J, Russell DW，Janssen K, Argentine J.黄培堂 等译，2002,北京：科学出版社），或按照制造厂商所建议的条件。
[0019] -、材料与方法 1、生物材料与处理： 本实验采用的玉米品种为中国岭南广泛种植的甜玉米。野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana)米用 Columbia (Col-0)生态型。
[0020] 本实验基因的克隆与玉米的Cd处理均采用华南地区广泛种植的品种：丰甜1号。 在玉米种子发芽9天（5天浸泡于水中，4天置于空气中）后，将种子转移至MS水状态培养 基上生长。生长条件：22°C，16/8光周期。生长过程中，1天补充2次氧气，每次半小时。当 玉米在水培养基上生长五天后，将所有的小植物分为两部分，一部分放置于含有200 iiM 0(1(：12的MS水培营养液中，一部分更换不含Cd的营养液正常生长，同时，开始以置换营养液 的时间为零点，以此后的〇小时、3小时、6小时、12小时、24小时、48小时开始收集植株的叶 片。每3个植株的叶片为一个样品，液氮速冻，-80°C储存。
[0021] 2、转基因拟南芥的获得 拟南芥种子用1比13的次氯酸钠消毒两次共8分钟，再用无菌水洗6次共六分钟，种 于MS培养基。含有种子的MS培养基放入4°C冰箱春化3d，然后置于光照培养箱中以20°C 16 h、20°C 8 h为一光周期培养。培养10 d后将幼苗移至营养土 ：輕石：珍珠岩=1 :1 :1的 塑料盒中定期浇水培养至开花，然后用于基因转化。
[0022] 运用电转法将带有ZwfliSS与基因的表达载体pCambia3300导入根癌农杆 菌GV3101中。筛选抗利福平和卡那霉素的农杆菌进行菌落PCR。挑选阳性的菌落摇菌，扩 配，用浸花法浸染拟南芥。在含100呢/mL除草剂（ppt)的1/2MS培养基上筛选T。的种子 代幼苗)，取T i代和Col野生型植株的叶片提取DNA，以野生型与突变体为阴性对照进行 PCR鉴定，选取阳性株。每种转基因拟南芥得到大约十株T1代植株，通过分离比，筛选这四 种转基因拟南芥的单位点插入纯合体种子保存，并从中对每个转化随机挑选3个株系作为 后续研究的材料再进行抗性检测。我们对作为研究材料所有独立株系进行RT-PCR验证，发 现转基因均有较高的表达。
[0023] 3、酵母的抗性检测 在长有酵母的EMM固体筛选培养基上挑选菌落，加入到含有3-5mlEMM液体筛选培养基 的50ml离心管