中，充分分散、混匀。250rpm，30°C，摇床上摇2-18小时（0D>0. 3)。稀释母液 至0D=0. 1，250rpm，30°C，摇床上摇4-8小时，使0D值略大于0. 3,稀释调节0D值至0. 3。以 0. 30D的酵母液为母液，分别稀释到1/10,1/100,1/1000倍不同浓度梯度，各取3 y L溶液， 依次滴至含有不同浓度diamide，H202, Cd的EMM固体筛选培养基上。30°C倒置培养5-7 天。
[0024] 二、实验结果 1、玉米fliXS基因的克隆 以中国南方地区广泛种植的甜玉米丰甜1号为材料，提取其基因组，并以其基因组DNA 为模板，设计引物克隆广东甜玉米中的％AiSa与基因，引物序列如表1所述。利 用高保真 DNA 聚合酶（High-Fidelity DNA Polymerase) PCR 反应体系。取 50 yL PCR 产 物进行1%的琼脂糖凝胶电泳分析，如图1所述。取目标条带进行测序，所得基因 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其所编码的蛋白序列如SEQ ID NO. 2所示；基 因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，其所编码的蛋白序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0025] 表 1PCR 引物
2、玉米fliSS基因家族信息 如图2所示，Zm0XS2b与Zm02Ll蛋白都含有两个锚蛋白重复序列和两个锌指结构域。
[0026] 3、玉米0XS2家族基因响应重金属Cd诱导 为了检验办fliSS家族基因在玉米中的表达情况，我们用水培的方法将刚发芽9天的玉 米植株种植在营养液中，一半的样品用含有200剛CdClJ^MS营养液处理，一半在无CdCl2 的MS营养液中生长。在Cd处理后的0，3，6，12，24，48小时收集三棵植株的叶片。qRT-PCR的 实验技术用来检测这两个基因的表达情况。如图3所示，在没有胁迫处理的条件下，ZMZiS? 家族基因在不同的时间点表达的水平较一致，其中，％的表达水平较高。然而，在转移 至含有CdCl^ MS培养基的3小时后，办幼与办似Z7的表达量与未处理的样品相比升 高了大约两倍。随着处理时间的延长，ZMZiS幼的表达量逐步下降，然而的表达量 在Cd处理的第24小时达到最高值，48小时又有回落。综合来看与可以被 Cd瞬时激活。这表明，家族基因有潜在的功能可能参与植物中重金属胁迫抗性的调 控。
[0027] 4、玉米0XS2家族基因在酵母中的抗性检测 我们克隆了％AiSa和基因全长，并克隆到酵母表达载体pARTl中，转化酵母。 如图4所示，在酵母中过量表达与可以增强酵母对二酰胺的抗性。因为化 学物质二酰胺能够直接引起氧化反应，所以Zm0XS2b与Zm02Ll有可能在氧化胁迫响应机制 上起作用。
[0028] 我们进一步在与中筛选出一段AT3序列，并将这些小片段的DNA 序列加上启动子ATG转入酵母表达载体pARTl中，在酵母中验证其抗性。如图4所示，抗性 检测结果表明，Zm0XS2b的AT3片段的转基因酵母具有抗二酰胺氧化胁迫的能力。因此，我 们推测玉米0XS2家族基因的AT3片段与玉米的抗性相关，具有极大的潜力应用于培育具有 抗逆性状的转基因作物中。
[0029] ZMZiS幼的AT3片段如SEQ ID N0. 7所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID N0. 8所 示；的AT3片段如SEQ ID NO. 9所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示。
[0030] 5、玉米0XS2家族基因在拟南芥中的抗性检测 为了进一步在植物中验证Zm0XS2家族基因在植物中的功能，我们将其转化拟南芥以 进行抗性检测。通过花序侵染法，得到大约各10株以Col为背景的与过 表达转基因拟南芥的独立株系。通过分离比，筛选这四种转基因拟南芥的单位点插入纯合 体种子保存，并从中对每个转化随机挑选3个株系作为后续研究的材料。我们对作为研究 材料所有独立株系进行RT-PCR验证，发现转基因均有较高的表达。
[0031] 随后，我们对这些转基因拟南芥WT 幼)和WT (Z滅汉7)以及它们的野生型对 照进行了胁迫的处理。如图5和图6所示，在正常的生长条件下，野生型转基因株系生长状 况一致。当用的75 yM CdCl2处理时，以野生型为背景过量表达与的转 基因拟南芥的叶子的伸长状态明显好于野生型，同时转基因植株的鲜重也明显高于野生型 (图6)。当培养基在同种条件下垂直放置时，以Col为背景过量表达与的 转基因拟南芥的根的生长状态也明显的好于野生型（图7)。
[0032] 以上实验结果表明，在拟南芥中大量表达刀〃与基因，可以特异性地 增强拟南芥抗重金属镉（Cd)的能力。因此，这两个基因将具有极大的潜力应用于培育具有 抗逆性状的转基因作物中，从而提高粮食作物的产量。
[0033] 我们再后续的实验中发现了玉米0XS2家族基因中的另一个同源基因办似Xfe，其 核苷酸序列如SEQ ID N0. 5所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0. 6所示。经序列分析， 与ZMZiX幼、具有较高的同源性。因此我们预测ZMZiXfe基因同样具有极 大的潜力应用于培育具有抗逆性状的转基因作物中，从而提高粮食作物的产量。
【主权项】
1. 玉米0XS2蛋白，其含有如下（1)- (4)任一项所示的氨基酸序列： (1) SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列； (2) SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列； (3) SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列； (4) SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列经取代、缺失和/ 或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后且具有提高植物抗逆功能的序列。2. 编码权利要求1所述玉米0XS2蛋白的基因。3. 玉米0XS2蛋白AT3片段，其含有如下（1) - (3)任一项所示的氨基酸序列： (1) SEQ ID NO. 7所示的氨基酸序列； (2) SEQ ID NO. 9所示的氨基酸序列； (3) SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 9所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多 个氣基酸和/或末端修饰后且具有提尚植物抗逆功能的序列。4. 编码权利要求3所述AT3片段的基因。5. 含有权利要求2或4所述基因序列的重组载体、重组菌或转基因细胞系、转基因植物 株系。6. 玉米0XS2蛋白、其编码基因或AT3片段、其编码基因在培育抗逆植物中的应用，其 中，所述玉米0XS2蛋白如权利要求1所示，所述AT3片段如权利要求3所示。7. 玉米0XS2蛋白、其编码基因或AT3片段、其编码基因在抗逆植物辅助育种中的应用， 其中，所述玉米0XS2蛋白如权利要求1所示，所述AT3片段如权利要求3所示。8. 根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述抗逆性状包括抗重金属污染，抗 氧化胁迫、抗高温胁迫、抗低温胁迫、抗盐碱、抗旱、抗病虫害中的至少一种。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述重金属包括镉、汞、金、银、铜、铁、铅、 砷、铬中的至少一种。10. -种抗逆植物的培育方法，包括将权利要求2或4所述的基因转入受体植物中，得 到转基因植物；所述转基因植物与受体植物相比，其对逆境的抗性提高。
【专利摘要】本发明公开了玉米OXS2基因家族、其编码蛋白及应用。玉米OXS2蛋白家族中的ZmOXS2b的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示，其编码基因如SEQ？ID？NO.1所示；ZmO2L1的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.4所示，其编码基因如SEQ？ID？NO.3所示。本发明所克隆到的两个玉米OXS2基因都可以被重金属胁迫诱导。酵母抗性检测表明，这两个基因的异源表达可增强酵母抗氧化剂二酰胺的能力，ZmOXS2b的功能片段AT3也可以增强酵母抗二酰胺的能力。当它们在拟南芥中大量表达时，可以增强拟南芥抗镉（Cd）的能力。该家族的另外一个成员ZmOXS2a与其他两个成员高度同源，预测具有相同的功能。因此，这三个基因将具有极大的潜力应用于培育具有抗逆特性的转基因作物中，从而提高粮食作物的产量。
【IPC分类】C07K14/415, C12N15/82, A01H5/00, C12N15/29
【公开号】CN105037516
【申请号】CN201510362669
【发明人】区永祥, 李勇青, 贺立龙
【申请人】中国科学院华南植物园
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月25日