狗牙根‘Tifway’脱水素蛋白Dehydrin-L及其编码基因和探针的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明狗牙根'Tifway'干旱胁迫响应过程中的一种重要保护蛋白脱水素蛋白 Dehydrin-L及其编码基因和探针，具体涉及一种狗牙根'Tifway'脱水素蛋白Dehydrin-L 及其编码基因和探针。
【背景技术】
[0002] 狗牙根（Cynodondactylon)是非常重要的暖季型草坪草，为禾本科多年生草本植 物，具有发达的根茎和匍匐茎，生长速度快、再生能力强、成坪快、耐热、耐践踏、质地纤细、 色泽好等优点，在国内外广泛用于运动场、游憩场、公园及固土护坡草坪等。因此是暖季型 草坪草中坪用价值最高、应用最广的草种之一，享有暖季型草坪草"当家草种"之称，极具社 会、经济和生态价值。狗牙根的抗旱能力十分强，年蒸散量低于400mm，仅是玉米、小麦等农 作物年需水量的四分之一左右，有些抗旱的狗牙根品种（如'Tifway'）在年降雨量250_ 以下仍能良好生长，因此是建植节水草坪的优良材料。
[0003] 脱水素（dehydrin)属于LEA- II家族，是植物体内的一种具有高度热稳定性、亲水 性的LEA蛋白（late embryogensis abundant proteins)，能够在植物胚胎发育后期以及逆 境下大量表达，广泛存在于植物界。它能在植物处于干旱等逆境条件下表达，其在逆境下表 达的强弱与植物抗逆能力有密切联系，在抗性植株中的表达量要高于对逆境敏感的植株。 由此显示，它与植物的抗旱有着密切的关系。
[0004] 狗牙根'Tifway'是狗牙根中最为耐旱的品种之一。通过蛋白免疫印迹和基因表达 分析，确定脱水素与'Tifway'耐旱密切相关。我们通过建立'Tifway'干旱10天的cDNA 抑制消减文库，从中获得了一个新基因的EST序列，它与报道的大麦脱水素蛋白DHN4基因 相似性极高，表明该基因编码脱水素蛋白。RT-PCR结果证明，该基因随着干旱程度的增大而 表达量升高，在"Tifway"中的表达量显著高于干旱敏感狗牙根品种中的表达量，由此显示 了该脱水素基因在狗牙根抗旱过程中起到了重要的作用。
[0005] 脱水素的编码基因已从多种植物中克隆出来，包括：拟南芥、水稻、大麦、橡树、红 海榄等。但对于草坪草植物脱水素的克隆、表达模式及蛋白序列尚不清楚。目前，未有任何 与狗牙根脱水素蛋白结构及其编码基因序列相关的文献报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于填补狗牙根'Tifway' Dehydrin-L基因的克隆、表达模式分析 以及狗牙根'Tifway' Dehydrin-L蛋白的空白，本发明还提供了一种编码上述蛋白质的核 酸序列以及检测所述核酸序列的探针；本发明公开了狗牙根'Tifway' Dehydrin-L蛋白及 其核酸序列在狗牙根'Tifway'干旱胁迫过程中的表达模式，为今后利用基因工程技术对 Dehydrin-L基因表达的时空特性进行调控，从而为提高狗牙根抗干旱胁迫能力与育种工作 提供了理论依据，具有很大的应用价值。
[0007] -方面，本发明提供了具有干旱胁迫响应功能及保护功能的狗牙根'Tifway'脱水 素Dehydrin-L蛋白，所述蛋白质是由如SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或 由SEQ ID N0. 4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有狗牙 根'Tifway'脱水素Dehydrin-L蛋白特征的蛋白质。该蛋白质在不同干旱胁迫阶段过程中 在细胞中的表达量存在较大差异。
[0008] 优选的，所述蛋白质为SEQ ID N0. 4所示氨基酸序列经过1~50个氨基酸的缺失、 插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1~20个以内氨基酸而得到的序列。
[0009] 进一步优选的，所述蛋白质为SEQ ID N0. 4所示氨基酸序列中1~10个氨基酸被 性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。
[0010] 另一方面，本发明提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列。
[0011] 优选的，所述核酸序列具体为：（a)碱基序列如SEQ ID N0. 3第1~543位所示； 或（b)与SEQ ID N0. 3第1~543位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；或（c)能与 SEQ ID N0. 3第1~543位所示的核酸进行杂交的序列。
[0012] 优选的，所述核酸序列具体为SEQ ID N0. 3第1~543位所示的核酸序列中1~ 90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60个以内核苷酸形成的 序列。
[0013] 此外，本发明还提供了一种检测上述核酸序列的探针，所述探针为具有上述核酸 序列8~100个连续核苷酸的核酸分子，该探针可用于检测样品中是否存在编码狗牙根 'Tifway' Dehydrin-L基因相关的核酸分子。
[0014] 在本发明中，"分离的DNA"、"纯化的DNA"是指，该DNA或片段已从天然状态下位 于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开， 而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。
[0015] 在本发明中，术语"狗牙根'Tifway' Dehydrin-L蛋白编码序列"指编码具有狗牙 根'Tifway'脱水素Dehydrin-L蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0. 3所示的第 1~543位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID N0. 3所示的第1~ 543位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的 序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID N0.3所示的第1~543位核苷酸序列同源性低 至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID N0. 4所示的序列。该术语还包括与SEQ ID N0. 3 所示的核苷酸序列的同源性至少70 %的核苷酸序列。
[0016] 该术语还包括能编码天然狗牙根'Tifway' Dehydrin-L蛋白的相同功能、SEQ ID NO. 3所示序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：通常为1~90个核苷酸的 缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加为60个以内核苷酸。
[0017] 在本发明中，术语"狗牙根'Tifway' Dehydrin-L蛋白"指具有狗牙根 'Tifway'Dehydrin-L蛋白活性的SEQ ID N0. 4所示序列的多肽。该术语还包括具有与天 然狗牙根'Tifway'Dehydrin-L蛋白相同功能的、SEQ ID N0. 4序列的变异形式。这些变异 形式包括（但并不限于）：通常为1~50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端 和/或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨 基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或 数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括狗牙根'Tifway' Dehydrin-L蛋 白的活性片段和活性衍生物。
[0018] 本发明的狗牙根'Tifway' Dehydrin-L蛋白的变异形式包括：同源序列、 保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与 狗牙根'Tifway' Dehydrin-L相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用狗牙根 'Tifway' Dehydrin-L蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。
[0019] 在本发明中，"狗牙根'Tifway'Dehydrin-L保守性变异多肽"指与SEQ ID N0. 4所 示的氨基酸序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。 这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
[0020] 表 1
[0021]
[0022]
[0023] 发明还包括狗牙根'Tifway'Dehydrin-L蛋白或多肽的类似物。这些类似物与狗 牙根'Tifway' Dehydrin-L相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响 序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导 变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定 点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基 (如D-氨基酸）的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸（如0、y -氨基酸）的 类似物。