专利名称：转基因玉米mon863品系特异定量pcr检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术，涉及基因的定量的分析方法。
背景技术：
国际上很多国家对转基因产品实施限量标识和进口，而我国尚无具体的转基因产品标识阈值。为了打破欧盟等国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒，同时弥补和完善我国转基因生物及产品定量检测技术体系，更好地保护消费者对转基因产品的知情权和选择权，建立一种新型转基因玉米M0N863品系特异定量PCR精准检测技术已成为必要。并且目前关于转基因玉米M0N863的检测技术，主要集中在普通的定性PCR方法和标准，尚无关于检测转基因玉米M0N863及产品的品系特异性某特定位点(基因序列)的定量 PCR精准检测技术。
发明内容
本发明的目的主要是提供一种扩增效率高、准确度高的检测转基因玉米M0N863 及产品的品系特异性某特定位点的定量PCR精准检测技术。本发明通过下述技术方案实现
转基因玉米M0N863品系特异定量PCR检测方法，主要包括以下步骤
(1)合成具有以下核苷酸序列的引物及与引物配合使用的荧光探针， 上游引物序列，Event863-F 5' -CTACTTGTTCGGATGGGTGTTC-3，
下游引物序列，Event863-R 5' -CCTTTATCGCAATGATGGCA-3’ 荧光探针序列，Event863-P 5' -FAM-CCCCAAAGTGTACCAAGCTTTCCGAT-TAMRA-3'；
(2)制备M0N863品系的DNA稀释液；
(3)配制PCR反应体系；
(4)定量PCR检测。进一步，步骤(1)所述合成的引物及荧光探针的浓度都为lOMfflol/l，步骤(2)所述制备的DNA稀释液的浓度为50ng/^l。为了达到最好的检测效果，步骤(3)所述的配制PCR反应体系，即将3μ1的DNA稀释液加入到25μ1反应体系中，所述25μ1的反应体系包括以下组分
Taqman Master mix12. 5M-I
上游引物ιμ
下游引物ιμ
荧光探针0. 5 μι
水IOul。作为最优的反应条件，所述PCR反应条件为95°C预变性10min，l个循环；95°C变性15s，59°C退火60s，45个循环。本发明具有以下优点及有益效果1、本发明打破了欧盟等国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒。2、本发明弥补和完善了我国转基因生物及产品定量检测技术体系。3、本发明提供的检测技术可更好地保护消费者对转基因产品的知情权和选择权。4、本发明扩增效率高、准确度高。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的实施方式并不限于此。 实施例转基因玉米M0N863品系特异定量PCR检测方法，主要包括以下步骤 (1)合成具有以下核苷酸序列的引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物序列，Event863-F 5' -CTACTTGTTCGGATGGGTGTTC-3，
下游引物序列，Event863-R 5' -CCTTTATCGCAATGATGGCA-3’
荧光探针序列，Event863-P 5' -FAM-CCCCAAAGTGTACCAAGCTTTCCGAT-TAMRA-3'。本实施例引物及荧光探针合成后的浓度都为lOMmol/l。以上引物和荧光探针的核苷酸序列是针对转基因玉米M0N863及产品的品系特异性某特定位点，即外源基因与玉米基因组DNA的整合位点设计，通过该设计就可以精准检测转基因玉米中M0N863的转化事件。(2)制备M0N863品系的DNA稀释液；即采用常规的DNA提取手段，从转基因玉米 M0N863中提取出浓度为50ng/^l的DNA稀释液。(3)配制PCR反应体系；即将3ul制备好的DNA稀释液加入25ul反应体系中即可。以上25ul反应体系包括以下组分
Taqman Master mix12. 5M-I
上游引物ιμ
下游引物ιμ
荧光探针0. 5 μι
水 ομ 。Taqman Master mix 采用的是 ABI 公司生产的 Taqman Master mix。(4)定量 PCR 检测。根据上述PCR反应体系，在以下PCR反应条件下对产物进行扩增并检测，所述PCR 反应条件为95°C预变性10min，l个循环；95°C变性15s，59°C退火60s，45个循环。本实施例中采用的是ABI公司生产的7500型荧光定量PCR仪器。对本实施例的方法数据连续重复做15个平行样品，对所述15个样品进行了检测， 其检测数据如表1。表 权利要求
1.转基因玉米M0N863品系特异定量PCR检测方法，其特征在于，主要包括以下步骤(1)合成具有以下核苷酸序列的引物及与引物配合使用的荧光探针， 上游引物序列，Event863-F 5' -CTACTTGTTCGGATGGGTGTTC-3，下游引物序列，Event863-R 5' -CCTTTATCGCAATGATGGCA-3’ 荧光探针序列，Event863-P 5' -FAM-CCCCAAAGTGTACCAAGCTTTCCGAT-TAMRA-3'；(2)制备M0N863品系的DNA稀释液；(3)配制PCR反应体系；(4)定量PCR检测。
2.根据权利要求1所述的转基因玉米M0N863品系特异定量PCR检测方法，其特征在于，步骤(1)所述合成的引物及荧光探针的浓度都为lOMfflol/l，步骤(2)所述制备的DNA稀释液的浓度为50ngAa。
3.根据权利要求2所述的转基因玉米M0N863品系特异定量PCR检测方法，其特征在于，步骤(3)所述的配制PCR反应体系，即将3μ1的DNA稀释液加入到25μ1反应体系中，所述25μ1的反应体系包括以下组分Taqman Master mix12. 5M-I上游引物ιμ 下游引物ιμ 荧光探针0. 5 μι水IOul。
4.根据权利要求1或3所述的转基因玉米Μ0Ν863品系特异定量PCR检测方法，其特征在于，所述PCR反应条件为95°C预变性lOmin，1个循环；95°C变性15s，59°C退火60s，45 个循环。
全文摘要
本发明属于生物技术，涉及基因的定量分析方法，具体是指转基因玉米MON863品系特异定量PCR检测方法。本发明采用设计的特异性上游引物Event863-F、下游引物Event863-R、荧光探针Event863-P、与MON863品系的DNA稀释液以及TaqmanMastermix和水配制成PCR反应体系；进行定量PCR检测。本发明主要建立了一种高扩增效率、高准确度的Taqman定量PCR检测技术，适用于国内农业转基因生物及产品监督检验、进出境口岸转基因生物及产品检验、企业内部进口原材料含转基因MON863品系生物成分检测。
文档编号C12Q1/68GK102409093SQ20111036362
公开日2012年4月11日 申请日期2011年11月17日 优先权日2011年11月17日
发明者刘文娟, 宋君, 尹全, 常丽娟, 张富丽, 王东, 郭灵安, 雷绍荣 申请人:四川省农业科学院分析测试中心