基于lamp的转基因玉米m0n863基因快检试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明涉及生物检测试剂及方法，具体是指转基因玉米M0N863的环介导等温扩增引物的设计及其环介导等温扩增检测试剂和方法。本发明针对M0N863基因整合图谱中Cry3Bbl基因和tahspl7基因的连接区域设ii^一套引物，由两对引物构成，特异性好。检测方法包括基因组的提取、环介导等温扩增以及显色反应，操作简便、灵敏度高、反应快速、结果判定方便。另外本发明的试剂盒由引物、反应液、BstDNA聚合酶、显色剂等组成，利用该试剂盒检测M0N863品系，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、肉眼判定结果等优点，为转基因植物检测提供了有效、快速的检测方法。
【专利说明】基于LAMP的转基因玉米M0N863基因快检试剂盒及检测方 法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及生物检测试剂及方法，基于环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP),涉及一种转基因植物检测方法，具体涉及一种用于检 测转基因玉米M0N863特定基因Cry3Bbl和tahspl7的环介导等温扩增引物及其环介导等 温扩增检测方法。
【背景技术】
[0002] M0N863为孟山都公司产品，抗虫基因为Cry3Bbl，来自苏云金芽孢杆菌熊本亚种 (B. thuringiensis subsp. KumamotoensisXCrySBbl蛋白对鱗翅目家族的昆虫具有抗性， 由于公众对转基因食品安全性的质疑，各国设定了相应的限量标准。并且目前基于M0N863 品系的检测技术，主要集中在普通的定性及定量PCR方法和标准，尚无关于检测转基因玉 米M0N863品系特定位点的环介导等温检测技术。
[0003] 环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification method, LAMP)是Notomi等于2000年发明的一种新型的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基 因的6个区域设计4-6条特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase)在等温条件下（60-65°C)反应，在Ih内即可完成核酸扩增反应，目的片段可以 扩增109倍。该方法具有特异性强、灵敏度高、扩增效率高、省时、操作简单等优点，在核酸 检测方面具有明显优势。
[0004] 本发明具有较高的检测灵敏度，最低检测限可达约4个单倍体基因组拷贝数，为 转基因植物检测提供了一种快速的筛检方法。
【发明内容】
[0005] 为了建立了一种针对于转基因玉米M0N863的恒温检测方法，本发明的一个目的 是提供了一套环介导等温扩增技术快速检测用引物；本发明的第二个目的是建立了环介导 等温扩增检测方法；根据检测方法实现了本发明的第三个目的，提供了使用上述检测用引 物的试剂盒；本发明的试剂盒和检测方法具有简便、灵敏、快速、特异性好等特点，提供了一 种扩增效率高、准确度高的检测转基因玉米M0N863的检测方法。
[0006] 本发明的第一个目的提供的用于M0N863鉴定的环介导等温扩增的引物，包括两 条外引物（M0N863-F3/M0N863-B3)、两条内引物（M0N863-FIP/M0N863-BIP)、两条环引物 (M0N863-LF/M0N863-LB)，该引物组对于检测M0N863具有特异性。上述引物的核苷酸序列 分别为：
【权利要求】
1?转基因玉米MON863品系环介导等温扩增的检测用引物，其特征在于，所述引物为一 套特征引物，一套引物由三对引物组成，一对引物为外引物，一对引物为内引物，一对引物 为环引物，序列分别为：
2. -种转基因玉米M0N863品系的检测方法，其特征在于，权利要求1的引物是以 M0N863的Cry3Bbl基因和tahspl7基因的连接片段为靶基因设计的，通过环介导等温扩增 方法用权利要求1所述的检测引物对样品的DNA选择性扩增所述的靶基因片段，确认是否 存在有扩增产物。
3. 根据权利要求2所述的转基因玉米M0N863体系的检测方法，其特征在于，该检测方 法具体为： (1) 模板的提取：将样品磨成粉末，称IOOmgilOmg样品，用CTAB方法提取基因组。 (2) 环介导等温扩增体系包括：1.4-2.0禮〇1仰？、2-811111§304、0.6-1.01甜菜碱， 0? 2-1. 6iiM 外引物（M0N863-F3，M0N863-B3)、0. 2y M 内引物（MON863-FIP，MON863-BIP)， 0.8liM 环引物（MON863-LF，MON863-LB)、3.0-10.0U Bst DNA 聚合酶、lx Thermopol buffer (包含：20mM Tris-HCl (pH8. 8@25。(：），IOmM KC1，IOmM(NM) 2S04, 2mM MgS04, 0. 1%. Triton X-100)。 (3) 环介导等温反应产物的检测： 利用电泳检测、荧光检测环介导反应产物是否有扩增产物。
4. 转基因玉米M0N863品系环介导等温扩增技术快速诊断试剂盒，其特征在于，该试剂 盒包括如权利要求1所述的引物组、权利要求 3所述的反应液、Bst DNA聚合酶以及一张阳 性定量标准曲线。
5. 根据权利要求5所述的转基因玉米M0N863品系环介导等温扩增技术快速诊断试剂 盒，其特征在于，所述的引物组由体积比为1:1:6:6:4:4的上下游外引物、上下游内引物与 上下游环引物组成。
6. 根据权利要求5所述的转基因玉米M0N863品系环介导等温扩增技术快速诊断试剂 盒，其特征在于，反应液是由体积比为5:8:1:10的lx Thermopol buffer、l_4_2. OmM dNTP、 2-8mM MgS04、0. 6-L OM 甜菜碱组成。
7. 根据权利要求5所述的转基因玉米M0N863品系环介导等温扩增技术快速诊断试剂 盒，其特征在于，Bst DNA聚合酶每微升含3-10个活性单位。
8. 根据权利要求5所述的转基因玉米MON863品系环介导等温扩增技术快速诊断试剂 盒，其特征在于，试剂盒还包括2〇X SYBR GREEN I荧光染料，稀释后可作为显色剂，以及一 份定量标准曲线图。
9. 根据权利要求3所述的转基因玉米MON863品系环介导等温扩增技术快速诊断试剂 盒，其特征在于，普通定性环介导等温扩增反应程序： 64°C反应40min。反应所使用的仪器 为普通PCR，水浴锅以及恒温培养箱。
10.根据权利要求3所述的转基因玉米M0N863品系环介导等温扩增技术快速诊断试 剂盒，其特征在于，定量环介导等温扩增反应程序：64°C反应40min，85°C放置3min，终止反 应。反应所使用的仪器为定量PCR。
【文档编号】C12Q1/68GK104212880SQ201310313904
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年7月24日 优先权日:2013年7月24日
【发明者】黄昆仑, 许文涛, 闫兴华, 翟百强, 罗云波, 徐瑗聪, 商颖, 董凯 申请人:北京福德安科技有限公司, 中国农业大学