基于SYBRGreenI的LAMP定量方法的建立及应用的制作方法
【专利摘要】本发明建立了一种结合SYBR?GreenⅠ的环介导等温扩增技术定量检测斱法，具体是在定性LAMP斱法的基础上，对影响定量的各个因素进行调整，最终确定了一个新的定量LAMP反应体系。利用本发明检测沙门氏菌以及单增李斯特菌得到了良好的检测结果，结果重现性好。
【专利说明】基于SYBRGreen I的LAMP定量方法的建立及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物检测试剂，具体涉及基于SYBR Green I的环介导等温扩增技术定量方法的建立。
【背景技术】
[0002]环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermal amplificat1n method,LAMP)是Notomi等于2000年发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4-6条特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在等温条件下(60-65°C)反应,在15_60min内即可完成核酸扩增反应。目前，该技术在微生物、病毒、真菌、转基因生物等领域中得到了广泛的应用。
[0003]SYBR Green I,是DNA小沟结合染料，与dsDNA有较高的亲和力。在游离状态时，SYBR Green I发出微弱的荧光，随着反应的进行，产生大量的双链DNA产物，SYBR Green I与之结合后，荧光信号会增强800-1000倍。SYBR Green I结合PCR用于定量PCR检测已经得到广泛的应用。
[0004]本发明将SYBR Green I与环介导等温扩增技术相结合，建立了基于SYBR Green I的环介导等温扩增技术定量检测方法。具有较高的灵敏度和稳定性，检测结果重现性好，为细菌、转基因等核酸定量检测提供了技术支持，本发明在实现了在恒温条件下检测靶序列，更加的省时快速。
【发明内容】
[0005]本发明建立了一种新型的环介导等温扩增技术定量检测方法，即结合SYBR GreenI染料的环介导等温扩增技术定量检测方法。该方法具有灵敏度高、操作简单、快速、准确等优点，使用普通的定量PCR仪即可在Ih内完成检测。
[0006]本发明首先对影响环介导等温扩增技术定性体系的各个因素进行了优化，在定性LAMP方法的基础上，对影响定量的各个因素进行调整之后优化，包括以下内容:
(I)dNTP浓度的优化，dNTP是核酸扩增的原料之一，每种碱基浓度为
0.1, 0.2，0.3，0.4，0.5mM 进行优化。
[0007](2) Mg2+浓度的优化，Mg2+浓度对酶活力有重要的影响，浓度分别为1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0mM 时进行优化。
[0008](3) Bst DNA聚合酶浓度的优化，对Bst DNA聚合酶的使用量分别为
3.2，4.8，6.4，8，9.6U 时进行了优化。
[0009](4)甜菜碱浓度的优化，甜菜碱在环介导等温扩增反应中是比较关键的试剂之一，在浓度分别为O, 0.4,0.6, 1.0, 1.4M时进行优化。
[0010](5)外引物与内引物的浓度比，在外引物:内引物分别为1:2，1:4，1:6，1:8，1:10时进行优化。
[0011](6)环引物浓度的优化，使用量为0.8，0.6，0.4，0.2，OmM时进行优化(7)孔间差异试验，将装有同样试剂的反应管放于PCR仪不同的位置，观察是否具有孔间差异。
[0012] 本发明建立的LAMP定量体系为:总体积25 μ L，包括:0.1-0.5mM dNTP、l_9mMMgS04、0.4-1.4M 甜菜碱，0.4_1.6μ M 外引物(M0N863-F3, Μ0Ν863_Β3)、0.2 μ M 内引物(M0N863-FIP，M0N863-BIP)、3.2-9.6U Bst DNA聚合酶、Ix Thermopol buffer (包含:20mMTris-HCl (pH 8.8 i 25°C )，10 mM KCl, 1mM (NH4) 2S04, 2 mM MgS04, 0.1%.TritonX-100), I μ L 20x SYBR Green I，ddH20补足至 25 μ L。LAMP定量检测程序为:3 min 64。。，50 个循环:64°C 30 s,64°C 30 s。
[0013]
【专利附图】
【附图说明】
图1环介导等温扩增技术定性检测方法dNTP、Mg2+、Bst DNA聚合酶、甜菜碱浓度的优化。
[0014]图2基于SYBR Green I染料的环介导等温扩增技术定量检测方法dNTP、Mg2+、Bst DNA聚合酶、甜菜碱浓度的优化。
[0015]图3基于SYBR Green I染料的环介导等温扩增技术定量检测方法环引物浓度的优化。
[0016]图4基于SYBR Green I染料的环介导等温扩增技术定量检测方法空间差异实验。
[0017]图5基于SYBR Green I染料的环介导等温扩增技术定量检测方法用于检测沙门氏菌的扩增曲线与标准曲线。
[0018]图6基于SYBR Green I染料的环介导等温扩增技术定量检测方法用于检测单增李斯特菌的扩增曲线与标准曲线。
【具体实施方式】
[0019]实施例1对沙门氏菌的定量检测实验材料
沙门氏菌Salmonella spp.(strains CGMCC 1.0090)培养过夜，提基因组DNA，采用文献报道的引物验证本发明建立的基于SYBR Green I染料的环介导等温扩增技术定量检测方法。所用引物序列如下:
Sal-FIP:GGCGTGAGAGATCCACCTG-
GAATGCGCCGTAATAGCGGTC
Sal-BIP:CACCATTATGGAAACGCTTA-
TCCGCCGGATACAGCTGAAGCATC
Sal -F3:GCCATTCCACATCGAAGAGGT
Sal -B3:ATGAGAACATCAATGGTATGGC
实验方法
制备了五个不同的沙门氏菌基因组浓度(105，104，103，102，10pg/>L)的样品，以这些样品为模板进行扩增。结果发现，测试的所有样品都可以被检测到(图5)。这说明最低检测限为1pg0
[0020]由定量软件得出基因组初始浓度的对数与对应的Cq值之间的标准曲线和线性回归方程(5)。该标准曲线的回归方程为:y = _5.331x+47.345，R2=0.997。其中:x为基因组初始浓度的对数值，y为Cq值，R2为线性相关系数。R2为0.997，这表明建立的基于SYBRGreen I LAMP定量检测沙门氏菌是可行的。
[0021]实施例2对单增李斯特菌的定量检测实验材料
单增李斯特氏菌L.monocytogenes (strains CMCC 55004)培养过夜，提基因组DNA,采用文献报道的引物验证本发明建立的基于SYBR Green I染料的环介导等温扩增技术定量检测方法。所用引物序列如下:
LM - FIP:GGAAGGTCTTGTAGGTTCATTAA
CAGGAAAATGCAAGAAGAAGTCA
LM - BIP:TCGGCAAAGCTGTTACTAAAG
AGCTTGAGATATATGCAGGAGGA
LM -F3:TAAACTTCGGCGCAATCA
LM -B3: CAAATAAACTTGACGGCCAT
实验方法
制备了五个不同的单增李斯特菌基因组浓度(105，104，103，102，lOpg/μL)的样品，以这些样品为模板进行扩增。结果发现，测试的所有样品都可以被检测到(图6)。这说明最低检测限为10pg。
[0022]由定量软件得出基因组初始浓度的对数与对应的Cq值之间的标准曲线和线性回归方程(图4-6)。该标准曲线的回归方程为:y = -4.609x + 41.993，R2=0.978。其中:x为基因组初始浓度的对数值，y为Cq值，R2为线性相关系数。R2为0.997，这表明建立的基于SYBR Green I LAMP定量检测单增李斯特菌是可行的。
【权利要求】
1.一种结合SYBR Green I染料的环介导等温扩增技术定量检测方法，其特征在于，本发明的的反应体系如下:
总体积 25 μ L，包括:0.1-0.5mM dNTP、l_9mM MgS04、0.4-1.4M 甜菜碱，0.4-2.0 μ M外引 *(M0N863-F3，M0N863-B3)、0.2yMrt 引物(MON863-FIP, ΜΟΝ863_ΒΙΡ)、3.2-9.6UBst DNA 聚合酶、Ix Thermopol buffer (包含:20mM Tris-HCl (pH8.8i25 °C ), 1mMKCl, 1mM(NH4) 2S04, 2mM MgS04, 0.1%.Triton X-100)，I μ L20x SYBR Green I，ddH20 补足M 25 μ L0
2.一种结合SYBR Green I染料的环介导等温扩增技术定量检测方法，其特征在于，对反应体系的各个因素进行优化: (1)dNTP,每种碱基浓度为0.1, 0.2，0.3，0.4，0.5mM进行优化；
(2)Mg2+，浓度为 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0mM 时进行优化； (3)Bst DNA聚合酶，使用量分别为3.2，4.8，6.4，8，9.6U时进行优化； (4)甜菜碱，浓度分别为0，0.4,0.6, 1.0, 1.4M时进行优化； (5)外引物与内引物的浓度比，在外引物:内引物分别为1:2，1:4，1:6，1:8，1:10时进行优化； (6)环引物浓度的优化，使用量0.8，0.6，0.4，0.2，OmM时进行优化； (7)孔间差异试验，将装有同样试剂的反应管放于PCR仪不同的位置，观察是否具有孔间差异。
3.根据权利要求2的反应体系，其特征在于，确定的最终反应体系如下:
0.4mM dNTP、5mM MgS04、L OM 甜菜碱，L 2 μ M 外引物(M0N863-F3, Μ0Ν863_Β3)、(λ 2 μ M内引 ^ (M0N863-FIP, M0N863-BIP),6.4U Bst DNA 聚合酶、Ix Thermopol buffer (包含:20mM Tris-HCl(pH8.8i25 °C ), 1mM KCl, 10mM(NH4)2S04, 2mM MgS04, 0.1%.TritonX-100)，I μ L20x SYBR Green I, ddH20 补足至 25 μ L。
4.根据权利要求1、2和3所述的反应体系，其特征在于，相应的LAMP定量检测程序为:3min64°C，50 个循环:64°C 30s,64°C 30s。
5.根据权利要求1、2和3所述的反应，其特征在于，所使用的设备是普通的PCR，定量PCR,水浴锅以及恒温培养箱。
6.根据权利要求3的确定的反应体系，其特征在于，检测沙门氏菌，最低检测限为1pg0
7.根据权利要求3的确定的反应体系，其特征在于，检测单增李斯特菌，最低检测限为1pg0
【文档编号】C12Q1/06GK104178559SQ201310312629
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年7月24日 优先权日:2013年7月24日
【发明者】许文涛, 黄昆仑, 闫兴华, 翟百强, 罗云波, 徐瑗聪, 董凯 申请人:北京福德安科技有限公司, 中国农业大学, 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心