一种整体蛋白质定量分析方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种蛋白质分子的分析方法，尤其是涉及一种整体蛋白质定量分析方法，主要涉及与生物质谱相关的系统生物学、蛋白质组学等技术领域。
【背景技术】
[0002]近两三年来，商业化的高质量分辨、高质量测量精度质谱仪有了飞跃式发展，也就是轨道阱质谱仪的出现。轨道阱质谱仪跟傅里叶变换离子回旋共振质谱仪分辨率和精度相当；但价格相对便宜，质谱采集速度更快、解离效率更高。该质谱仪的相对普及为分子量相对较大的整体蛋白的质谱及串级质谱分析提供了坚实的基础。在整体蛋白定量标记方面，基于SILAC的体内标记和基于TMT的体外标记，由于靶向氨基酸的非完全标记(如重的赖氨酸或精氨酸在SILAC中的非完全替代)和非靶向氨基酸的非选择性标记(如苏氨酸的TMT标记)，其应用范围受到了比较大的限制。二甲基(同位素，isotopic或同重，isobaric)标记由于其试剂易得，标记效率高，在多肽定量方面得到了广泛的研究和应用；我国科学家在这个定量技术方面也做出了巨大的贡献，发展了多种不同形式的二甲基标记；其中中国科学院大连化学物理研究所张玉奎院士和张丽华研究员课题组发展的N端同重二甲基标记和复旦大学杨亢原教授和陆豪杰教授课题组发展的赖氨酸ε-氨基的胍化保护组合起来可直接应用于蛋白的定量标记，有较好的前景。
[0003]在整体蛋白质数据库新算法和引擎发展方面，中国专利CN103389335A、CN104359967A、CN104765984A 公布了同位素轮廓指纹比对算法(isotopic envelopefingerprinting, iEF)，直接在原始数据上进行匹配离子的搜索和蛋白质的鉴定。该算法无需对实验数据进行“去同位素”预处理，可以节省相应的时间；根据各个离子中是否有同位素峰缺失和同位素峰相对强度的偏差对理想及非理想实验数据进行很好的区分，保证蛋白鉴定的可信度；根据已知重叠离子的同位素峰相对强度关系对重叠实验数据进行有效的解析。基于该算法申请人成功地开发了整体蛋白数据库搜索引擎ProteinGoggle，在单个标准蛋白(泛素、肌红蛋白)及整体蛋白质组混合物(组蛋白H4家族翻译后修饰异构体、大肠杆菌)的定性鉴定中，表现出较高的可信度和较好的应用前景。在定量分析方面，ProteinGoggle有着它内在的和独特的潜在优势；一方面基于同位素轮廓及其中每个同位素的指纹比对可以快速精确地搜索同位素或同重标记的定量离子对；另一方面，搜索过程中每个离子中每个同位素峰的实验强度都被记录和输出，可以用来直接计算相对定量比。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种标记效率高、无需预先对部分官能团进行保护、准确度高的整体蛋白质定量方法。
[0005]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0006]—种整体蛋白质定量分析方法，包括以下步骤:
[0007](I)将两组不同生理或病理条件的整体蛋白质分别作为控制组与疾病组，并分别对可能存在的一■硫键进彳丁还原，同时对疏基进彳丁烧基化保护；
[0008](2)对两组烷基化的蛋白质的氨基酸特定官能团进行全同重化学共价标记；
[0009](3)同重标记后两组蛋白质按等比例混合进行高分辨质谱和串级质谱分析得到一个数据组；
[0010](4)对数据组进行定性、定量数据库搜索，得到蛋白质的ID及疾病组每一个蛋白质相对于控制组的相对比例，即疾病条件下所有蛋白的上调或下调情况，上调或下调倍数最大的蛋白即为与该疾病发生、发展相关的蛋白。
[0011]优选地，步骤(I)中用二硫苏糖醇对可能存在的二硫键进行还原，用碘乙酰胺对所有巯基进行烷基化保护。
[0012]优选地，步骤(2)中氨基酸特定官能团包括赖氨酸ε -氨基及N端氨基，同时该方法同样适用于蛋白质序列中赖氨酸ε-氨基及N端氨基除外的其他特定官能团的全同重化学共价标记。
[0013]优选地，步骤(2)中，一组蛋白质中的氨基酸特定官能团标记为-N(CH2D)2，另一组蛋白质中的氨基酸特定官能团标记为-N(13CH3)2，单个标记后氨基的质量差异为0.00584Dao同样的，本发明方法同样适用于蛋白质序列中赖氨酸氨基及N端氨基其他全同重化学共价标记。
[0014]对于标记为-N(CH2D)JP -N( 13CH3)2的方法而言，一组蛋白质用甲醛和氘代氰基硼氢化钠标记，另一组蛋白质用13C标记甲醛和氰基硼氢化钠标记；反应过程和条件如下:烷基化的蛋白质重新溶解在乙酸钠缓冲溶液后，加入4% (v/v)甲醛溶液；在搅拌条件下加入600mM的新配制的氰基硼氢化钠溶液，室温反应I小时后，用4% (v/v)的氨水淬灭。其中，所述的乙酸钠缓冲溶液为lOOmmol/L，pH为5_6。
[0015]步骤(3)所述的等比例混合指:按照控制组与疾病组的重量、体积或摩尔量以1:1比例进行混合。
[0016]步骤(4)中对数据组进行定性、定量数据库搜索，得到蛋白质的ID及疾病组每一个蛋白质相对于控制组的相对比例为本领域的常规技术，优选使用【背景技术】中介绍的整体蛋白数据库搜索引擎ProteinGoggle，同时也可以使用其他数据库。
[0017]与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果:
[0018]1、本发明的解析方法基于所述质谱的原始二级质谱，通过计算含标记基团碎片离子的平均相对强度从而计算标记蛋白在不同生理或病理条件下的相对强度。本发明的定量方法对整体蛋白质序列中赖氨酸ε-氨基及N端氨基的同重标记和其高分辨串级质谱标记碎片离子同位素轮廓指纹比对原位数据解析，标记效率高，准确度高，适用于整体蛋白质基于高分辨串级质谱的定量分析。
[0019]2、本发明方法仅需对蛋白质进行二硫键还原，和对巯基进行