专利名称：蛋白质的固相定量方法及其专用染色剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质组学研究领域中的蛋白质的固相定量方法及其专用染色剂。
背景技术：
2D/MS(二维电泳加质谱)的分析法是蛋白质组学研究中的重要分析手段之一，而蛋白质的准确定量在电泳前的样品准备过程中非常必要。样品缓冲液[SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺电泳)上样缓冲液和IEF(等电聚焦)水化液]中的蛋白质总量的精确定量，对于保证足够的蛋白上样量以及对差异显示的不同蛋白样品之间进行可靠的比较分析至关重要。一些分光光度测定法，如Bradford、BCA(二喹啉甲酸)法及Lowry法已被广泛地应用于蛋白质的定量，但是这些液相测定法的实施常常易受一系列干扰物质的干扰，影响其准确度。这些干扰物质包括CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸)，SDS，DTT(二硫苏糖醇)，硫脲，两性电解质以及高浓度的变性剂等。此外，少量的染料如溴酚蓝也会影响读数，Bradford法尤其是这样。某些商业的试剂盒，如Bio-Rad公司(Bio-Rad实验室，加利福尼亚州，美国)的RC DC蛋白分析试剂盒和安玛西亚公司(安玛西亚，新泽西州，美国)的2-D定量试剂盒的产品说明书中声称用这些试剂盒来测定蛋白质不会受到这些干扰物质的影响，但是在检测过程中常需要进行蛋白沉淀的步骤，这不仅会消耗大量的样品，而且往往会给低浓度的蛋白样品造成严重的蛋白损失。
与上述液相测定法不同，基于固相的蛋白质测定法是一个很好的选择，通过将蛋白质固定在如硝酸纤维素膜或聚偏氟乙烯(PVDF)膜这样的固体支持物上，可以洗掉干扰物质，其结果是干扰物质不会影响测定结果。但问题是要有合适的能检测出纳克至微克级的蛋白染色方法。目前已开发的对固体膜上的蛋白质进行染色的方法有胶体金染色、胶体银染色、考马斯亮蓝染色、丽春红染色、邻苯三酚红一钼酸染色、印度墨水染色和双金属鳌合染色法等(Mitra，P.；Pal，A.K.；Basu，D.；Hati，R.N.，Astaining procedure using Coomassie brilliant blue G-250 in phosphoric acidfor detection of protein bands with high resolution in polyacrylamide gel andnitrocellulose membrane.Anal Biochem 1994，223，(2)，327-9；Lim，M.J.；Patton，W.F.；Shojaee，N.；Shepro，D.，Solid-phase metal chelate assay for quantifyingtotal proteinresistance to chemical interference.Biotechniques 1996，21，(5)，888-92，894，896-7.)。这类方法的步骤烦多，费时而且需要多种试剂。而另一种基于荧光的蛋白质定量法虽然适用于高通量，具有灵敏度高、只需少量(1微升)蛋白样品等特点，但是该方法需要昂贵的荧光探针和贵重的荧光检测仪器如荧光扫描仪、紫外透射成象系统或96孔板荧光扫描仪等(Agnew，B.J.；Murray，D.；Patton，W.F.，A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitationof protein electrophoresis samples containing detergents，chaotropes，dyes，and reducing agents.Electrophoresis 2004，25，(15)，2478-85.)。
基于上述检测方法的不足，迫切需要开发出一种快速、灵敏、高通量、耗样少且成本低廉的蛋白质定量方法，以用于蛋白质组学研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于对蛋白质进行固相定量的染色剂。
本发明所提供的染色剂，是含有体积百分浓度为0.5-1.5％染料型蓝黑墨水，0.02-0.05％吐温-20的PBS缓冲液。
所述墨水的体积百分浓度优选为1.0％，吐温-20的浓度优选为0.03％。
所述墨水品牌的选择是多种多样的，优选为驼鸟牌。
所述PBS缓冲液的配方为NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO41.44g和KH2PO40.24g，用水定容至1L，pH 7.4。
本发明的第二个目的是提供一种蛋白质的固相定量方法。
本发明所提供的蛋白质的固相定量方法，包括以下步骤1)绘制蛋白浓度的标准曲线将一系列已知浓度的蛋白标准溶液以1-2μl相同的点样量点在固相支持膜上，将膜在室温下空气干燥，洗膜，然后将膜浸于上述染色剂中，用频率为2400-2500MHz、输出功率为700-900W的微波辐射2-5分钟以辅助染色，洗膜，再对膜进行微波辐射使其干燥，将干燥的膜用矿物油或覆盖油浸润成半透明状，扫描成像。对图像进行分析，得到光密度值(OD)。然后根据不同浓度蛋白点的光密度值绘出标准曲线，横坐标为蛋白量，纵坐标为光密度值；2)将未知浓度的蛋白样品点在固相支持膜上，用与步骤1)相同的方法测定光密度值；3)将步骤2)测定的未知浓度蛋白样品的光密度值与步骤1)绘制的标准曲线进行比对，得到样品中的蛋白浓度。
在上述蛋白固相定量方法中，所述步骤1)中已知蛋白标准溶液的浓度范围可根据实际需要进行选择。步骤1)和步骤2)中的固相支持膜为硝酸纤维素膜或聚偏氟乙烯膜(PVDF)；点样量优选为1μl；洗膜方法可为用蒸馏水在2-5分钟内洗膜2-3次；辅助染色时的微波频率优选为2450MHz，输出功率优选为900W，辐射时间优选为3分钟；利用微波辐射对膜进行干燥的时间优选为3-6分钟。
可用桌面式扫描仪或或光密度计进行图像扫描，并用美国国家卫生研究院开发的软件Image J(http//rsb.info.nih.gov/ij/)进行图像分析，图像的象素值被标准光密度片校准后转换为校正过的光密度值，光密度值和蛋白量成比例，因此每个点的蛋白量对平均光密度值作图即得到标准曲线。
所述被进行固相定量的蛋白质标准优选为γ-球蛋白、肌红蛋白或转铁蛋白等。
为提高精确度，可将每种样品的点样个数设为2-4个，绘制标准曲线时取平均光密度值。
此外，若用电泳上样缓冲液配制一系列已知浓度的蛋白标准溶液，并用相同的方法绘制出标准曲线，则可对未知浓度电泳样品中的蛋白浓度进行测定。
所述电泳上样缓冲液可为SDS-PAGE上样缓冲液或IEF水化液等。
所述用于测定SDS-PAGE上样缓冲液和IEF水化液中蛋白浓度的标准曲线的动态范围可为19.5-10000ng/μl。
本发明提供了一种蛋白质的固相定量方法及其专用染色剂。该方法是以微波辅助的墨水染色法来测定电泳上样缓冲液中的蛋白质含量，即采用普通的染料型蓝黑墨水及微波辐射对点样在固相支持膜上的蛋白点进行无背景染色，再将经染色的膜经微波干燥及透明化后用扫描仪或光密度计扫描成像，经对图像进行分析得到光密度值，通过与蛋白浓度标准曲线进行比对，得到检测样品的蛋白浓度。该方法具有以下优点1)快速利用微波辐射对固相支持膜上的蛋白样品进行辅助染色使染色时间缩短至2-6分钟，传统方法则需要2小时甚至过夜(12-24小时)；同时利用微波辐射对膜进行干燥，也极大地缩短了膜的干燥时间，在900W的输出功率下，微波辐射5分钟足以使染过色的膜完全干燥，而通常空气干燥需30分钟甚至更长时间才足以使膜完全干燥。
2)灵敏度高仅需1微升的蛋白样品即可进行检测，并能产生19.5-10000ng/μl500倍的动态范围，与荧光检测方法的灵敏度相当。
3)容易扩大至高通量的分析模式所采用的固相支持膜大小可变，检测的样本数不受限制，此外，已经点完样的不同膜可以在同一个培养皿中进行染色，蛋白样本可一次性点在膜上，也可以是分步点在膜上，使得不同时间制备的蛋白样本可以被点在同一张膜上，然后再同时染色。
4)染色液可重复使用，且重复使用多次后染色能力保持不变固相支持膜上经染色的蛋白点很稳定，在室温下可以浸泡于矿物油中放置几周而颜色及形状保持不变。重复使用多次后染色液的体积可能减少，这是由于水分蒸发所致，可以通过加入与挥发体积等量的水来恢复染色液的体积。
5)成本低染色试剂廉价，仪器简单、易得。
6)检测方法简单，检测人员易于掌握。
本发明的蛋白质的固相定量方法及其专用染色剂将在蛋白质组学的研究中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1为对固定在硝酸纤维素膜上的蛋白进行微波辅助染色的流程2为不同颜色及品牌的墨水对固定在硝酸纤维素膜上的蛋白的微波辅助染色结果图3为用传统染色方法及微波辅助染色法对固定在硝酸纤维素膜上的蛋白进行染色的结果图4为溶解在SDS-PAGE上样缓冲液中的标准浓度的BSA经过微波辅助蛋白固相染色后的扫描图像及用于测定SDS-PAGE上样缓冲液中蛋白含量的标准曲线图5为溶解在SDS-PAGE上样缓冲液中的标准浓度的BSA经过微波辅助蛋白固相染色后的扫描图像及用于测定SDS-PAGE上样缓冲液中蛋白含量的标准曲线图6为检测6种不同蛋白对标准曲线光密度值的影响的结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
材料及仪器蛋白牛血清白蛋白(BSA)，γ-球蛋白，刀豆素A，肌红蛋白和卵清蛋白购自Sigma-Aldrich公司。转铁蛋白购自Merck公司。
墨水鸵鸟牌蓝黑墨水(203)，老板牌蓝黑墨水(883)，黑墨水(881)，英雄牌蓝黑墨水(232)，奥林丹牌红墨水(8201)，蓝黑墨水(8202)和纯蓝墨水(8203)均购自北京向阳文体商店。
硝酸纤维素膜Immobilon-P购自Millipore公司(Millipore，MA，美国)。
输出功率900W的微波炉购自格兰氏公司(广东，中国)。
桌面扫描仪PowerLook 2100XL购自Umax公司(世元资讯科技股份有限公司，上海，中国)。
试剂SDS-PAGE样品缓冲液100mM Tris-HCl pH 6.8，2％SDS，10％丙三醇，5％β-mercaptoethanol，0.1％溴酚蓝。
IEF水化液7M尿素，2M硫脲，2％CHAPS，1％DTT，0.5％IPG 3-10NL缓冲液。
PBS缓冲液NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO41.44g和KH2PO40.24g，用水定容至1L，DH 7.4。
其它试剂均为分析纯试剂。
实施例1、比较不同类型、颜色及品牌的墨水对固定在硝酸纤维素膜上的蛋白的微波辅助染色效果用下述实验比较不同类型、颜色及品牌的墨水对固定在硝酸纤维素膜上的蛋白的微波辅助染色效果，具体方法包括以下步骤1)配制染色剂将鸵鸟牌蓝黑墨水(203)，老板牌蓝黑墨水(883)，黑墨水(881)，英雄牌蓝黑墨水(232)，奥林丹牌红墨水(8201)，蓝黑墨水(8202)和纯蓝墨水(8203)分别与吐温-20添加到PBS缓冲液中，混匀后得到含有体积百分浓度为1.0％墨水，0.03％吐温-20的PBS缓冲液。
2)配制蛋白样品溶液将BSA的溶解在IEF水化液中，得到浓度分别为10ng/μl、100ng/μl、1000ng/μl和10000ng/μl的BSA溶液，以不含有BSA的IEF水化液为对照。
3)微波辅助染色(流程图见图1)以1微升的点样量将步骤2)的各种浓度的蛋白样品溶液点在硝酸纤维素膜Immobilon-P上，制备7块膜，将膜在室温下空气干燥后，用蒸馏水在5分钟内洗3次，然后进行微波辅助的墨水染色，即将7块别浸于装有步骤1)配制的不同染色剂的平皿中，将平皿置于输出功率为900W的格兰氏微波炉中用微波辐射3分钟，然后将膜取出，用蒸馏水洗膜2分钟，最后再用微波辐射5分钟，使膜干燥。
4)将膜用矿物油浸润成半透明状，用桌面式扫描仪(或光密度计)扫描成像。染色结果如图2所示(1，鸵鸟牌蓝黑墨水；2，英雄牌蓝黑墨水；3老板牌黑墨水；4，老板牌蓝黑墨水；5，奥林丹红墨水；6，奥林丹蓝黑墨水；7，奥林丹纯蓝墨水)，印度墨水对蛋白点染色的强度太弱无法分析(图中未显示)，而在所采用的多种染料型墨水中，只有各个品牌的蓝黑墨水能给出可用的灵敏度，其它颜色墨水如黑墨水产生的背景太深，红墨水和纯蓝墨水的灵敏度太低。染料型墨水染出的蛋白的颜色和墨水的颜色一致，这很可能是染料与蛋白特异性结合的结果。上述实验结果表明蓝黑墨水可作为灵敏染料对固定在膜上的蛋白进行定量。此外，在所有品牌的蓝黑墨水中，鸵鸟牌蓝黑墨水染色的灵敏度最高。
实施例2、比较传统染色方法及微波辅助染色法对固定在硝酸纤维素膜上的蛋白的染色效果染色剂含有体积百分浓度为1.0％鸵鸟牌蓝黑墨水，0.03％吐温-20的PBS缓冲液。
蛋白样品溶液将BSA的溶解在IEF水化液中，得到浓度分别为10ng/μl、100ng/μl、1000ng/μl和10000ng/μl的BSA溶液。
用下述实验比较传统染色方法及微波辅助染色法对固定在硝酸纤维素膜上的蛋白的染色效果，具体方法如下以1微升的点样量将各种浓度的蛋白样品溶液点在硝酸纤维素膜Immobilon-P上，以不含有BSA的IEF水化液为对照，制备6块膜，将膜在室温下空气干燥后，用蒸馏水在5分钟内洗3次，然后进行微波辅助的墨水染色，即将6块膜分别浸于装有染色剂的不同平皿中，将4个平皿置于输出功率为900W的格兰氏微波炉中用微波分别辐射1、2、3和5分钟，将另外两个平皿分别在室温下染色2小时和过夜(12-24小时)，染色结束后将膜取出，用蒸馏水洗膜2分钟，最后再用微波辐射5分钟，使膜干燥。将干燥的膜用矿物油浸润成半透明状，用桌面式扫描仪(或光密度计)扫描成像。
染色结果如图3所示，用传统方法对固定在硝酸纤维素膜上的蛋白进行染色，染色时间需要2小时甚至过夜(12-24小时)，而用本发明的微波辐射辅助染色法加速了染色进程，微波处理20秒后膜上的蛋白点就可见(用传统方法在室温下温育15分钟后膜上的蛋白点才可见)，染色在2-5分钟内即可完成，原因可能是热效应和微波辐射的非热效应协同作用，加速了染料与蛋白特异结合的速度。此外，用微波辐射至5分钟时会导致点的变形，因此优选的微波辅助染色时间为3分钟，此时点的形状保持完好且能产生足够的灵敏度。而且，和传统的室温下孵育的染色方法相比，微波辐射处理能加深对低浓度蛋白点的染色。上述实验结果表明用本发明的微波辅助染色法对蛋白进行固相染色，可获得快速灵敏的染色效果。
实施例3、利用本发明的蛋白固相定量染色法检测电泳样本中的蛋白含量染色剂含有体积百分浓度为1.0％鸵鸟牌蓝黑墨水，0.03％吐温-20的PBS缓冲液。
可利用本发明的微波辅助蛋白固相染色法检测电泳样本(如SDS-PAGE或IEF)中的蛋白含量，其中标准曲线的获得方法包括以下步骤1)蛋白标准溶液的配制用天平精确称量BSA蛋白干粉，将其分别溶于SDS-PAGE上样缓冲液和IEF水化液中配成10000ng/μl的蛋白溶液，再将两种蛋白溶液进行两倍梯度稀释得到一系列蛋白标准溶液(19.5-10000ng/μl)。
2)微波辅助染色以1微升的点样量将各种浓度的蛋白样品溶液点在硝酸纤维素膜Immobilon-P上，每个浓度点3个样，以不含有BSA的SDS-PAGE上样缓冲液和IEF水化液为对照，将膜在室温下空气干燥后，用蒸馏水在5分钟内洗3次，然后进行微波辅助的墨水染色，即将膜浸于装有染色剂的平皿中，将平皿置于输出功率为900W的格兰氏微波炉中用微波辐射3分钟，然后将膜取出，用蒸馏水洗膜2分钟，最后再用微波辐射5分钟，使膜干燥。
3)将干燥的膜用矿物油浸润成半透明状，用桌面式扫描仪扫描成像，用美国国家卫生研究院开发的软件Image J(http//rsb.info.nih.gov/ij/)进行图像分析，图像的象素值被标准光密度片校准后转换为校正过的光密度值(OD)，光密度值和蛋白量成比例，因此每个点的蛋白量对平均光密度值作图即得到标准曲线。可根据此标准曲线对未知浓度的SDS-PAGE上样缓冲液和IEF水化液进行定量。
溶解在SDS-PAGE上样缓冲液中的标准浓度的BSA经过微波辅助蛋白固相染色后的扫描图像见图4中的图B不同浓度的蛋白质标准的变化系数都小于3％，BSA标准曲线见图4中的图A(其中，小图表示一段范围更小的标准曲线，浓度从19.5ng/μl到1250ng/μl)，BSA的动态范围是19.5ng/μl-10000ng/μl；溶解在IEF水化液中的标准浓度的BSA经过微波辅助蛋白固相染色后的扫描图像见图5中的图B，不同浓度的蛋白质标准的变化系数都小于3％，BSA标准曲线见图5中的图A，两种缓冲液的BSA标准曲线的动态范围都是19.5ng/μl-10000ng/μl，而SDS-PAGE上样缓冲液的和IEF水化液的BSA标准曲线的线性范围分别是39ng-1000ng/μl和19.5ng/μl-2500ng/μl。对于这些上样缓冲液的BSA标准曲线的线性范围足够覆盖实验室常用的直接用于SDS-PAGE电泳分析或者IEF分离的蛋白样本浓度。在SDS-PAGE缓冲液中的BSA标准曲线的线性范围略窄于在IEF水化液中的标准曲线线性范围的原因可能是高浓度的SDS干扰了蛋白在硝酸纤维素膜上的固定效率。
实施例4、检测不同蛋白对标准曲线光密度值的影响将分子量，pI以及翻译后修饰都不同的6种蛋白牛血清白蛋白(BSA)、肌红蛋白(Myoglobin)、刀豆素A(ConA)、γ-球蛋白(γ-Globin)、转铁蛋白(Transferrin)和卵清蛋白(Albumin)分别溶解在IEF水化液中，配成10000ng/μl的蛋白溶液，并按照实施例5的方法进行微波辅助蛋白固相染色，每种蛋白点3个样，扫描图像，并对图像进行图像分析，得到平均光密度值，以检测不同蛋白对标准曲线光密度值的影响。检测结果如图6所示，最大的差异来自于糖蛋白Con A，可能是糖基化修饰导致了蛋白与硝酸纤维素膜的结合效率下降或者蛋白被染色的强度下降。单个蛋白的变化系数仍然不到3％，而6个蛋白之间的变化系数约30.7％，其中除Con A之外的5种蛋白的变化系数为15.4％。这种蛋白之间的差异程度与通常的蛋白质染色方法，如考马斯亮蓝染色或BCA方法相当。其中γ-球蛋白，肌红蛋白和转铁蛋白更适合作蛋白质标准，因为这些蛋白的染色强度与平均值更接近。
权利要求
1.用于对蛋白质进行固相定量的染色剂，是含有体积百分浓度为0.5-1.5％染料型蓝黑墨水，0.02-0.05％吐温-20的PBS缓冲液。
2.根据权利要求1所述的染色剂，其特征在于所述墨水的体积百分浓度为1.0％，吐温-20的浓度为0.03％。
3.根据权利要求1所述的染色剂，其特征在于所述墨水品牌为驼牌。
4.一种蛋白质的固相定量方法，包括以下步骤1)绘制蛋白浓度的标准曲线将一系列已知浓度的蛋白标准溶液以1-2μl相同的点样量点在固相支持膜上，将膜在室温下空气干燥，洗膜，然后将膜浸于权利要求1-3任一所述的染色剂中，用频率为2400-2500MHz、输出功率为700-900W的微波辐射2-5分钟，洗膜，再对膜进行微波辐射使其干燥，将干燥的膜用矿物油或覆盖油浸润成半透明状，扫描成像，对图像进行分析，得到光密度值，然后根据不同浓度蛋白点的光密度值绘出标准曲线；2)将未知浓度的蛋白样品点在固相支持膜上，用与步骤1)相同的方法测定光密度值；3)将步骤2)测定的未知浓度蛋白样品的光密度值与步骤1)绘制的标准曲线进行比对，得到样品中的蛋白浓度。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤1)和步骤2)中的固相支持膜为硝酸纤维素膜或聚偏氟乙烯膜；点样量为1μl；洗膜方法为用蒸馏水在2-5分钟内洗膜2-3次；辅助染色时的微波频率为2450MHz，输出功率为900W，辐射时间为3分钟；利用微波辐射对膜进行干燥的时间为3-6分钟。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述图像分析软件为Image J。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述被进行固相定量的蛋白为γ-球蛋白、肌红蛋白或转铁蛋白；每种样品的点样个数为2-4个，绘制标准曲线时取平均光密度值。
8.根据权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于用电泳上样缓冲液配制一系列已知浓度的蛋白标准溶液和待测蛋白溶液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述电泳上样缓冲液为SDS-PAGE上样缓冲液或IEF水化液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述用于测定SDS-PAGE上样缓冲液和IEF水化液中蛋白浓度的标准曲线的动态范围为19.5-10000ng/μl。
全文摘要
本发明公开了一种蛋白质的固相定量方法及其专用染色剂。该染色剂是含有体积百分浓度为0.5－1.5％染料型蓝黑墨水，0.02－0.05％吐温－20的PBS缓冲液。该定量方法，包括以下步骤1)绘制蛋白浓度的标准曲线；2)将未知浓度的蛋白样品点在固相支持膜上，再对其进行染色，干燥，浸润及光密度值测定；3)将步骤2)测定的未知浓度蛋白样品的光密度值与步骤1)绘制的标准曲线进行比对，得到样品中的蛋白浓度。该方法具有快速、灵敏度高、容易扩大至高通量的分析模式、染色液可重复使用，且重复使用多次后染色能力保持不变、成本低及简单等诸多优点，将在蛋白质组学的研究中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号G01N21/25GK1877289SQ20061008967
公开日2006年12月13日 申请日期2006年7月11日 优先权日2006年7月11日
发明者刘进元, 吴雪萍, 程永升 申请人:清华大学