一种丹参注射液中有效成分的定量测定方法

专利名称：：一种丹参注射液中有效成分的定量测定方法
技术领域：
：本发明涉及一种中药制剂有效成分的定量测定方法，特别是涉及丹参注射液中有效成分的定量测定方法。
背景技术：
：近年来，随着我国人民生活水平的提高，期望寿命的延长和膳食结构的改变，冠心病的发病率和死亡率正呈现上升趋势。我国目前约有4000万冠心病患者，每小时约有260例患者死于心脑血管疾病。冠心病发病率近年来在我国呈急剧上升的趋势。世界卫生组织有报告指出，即使从现在开始就采取有力的预防措施，我国心血管疾病发病率的上升趋势也将持续到2020年左右。心脑血管用药在药品市场中的排名也上升至第二位，仅次于抗感染用药。据了解，目前国内心脑血管类药物市场总的格局是中西药各占一半。从医院的用药数据统计，心脑血管类制剂目前还是由注射剂主导市场，而且，临床实践证明，中药注射剂治疗心脑血管疾病具有化学药产品不可替代的独特功效，也有中药其他剂型难以具备的优势。丹参作为经典的活血化瘀中药，广泛用于治疗冠心病、心绞痛、缺血性脑中风等心脑血管疾病，丹参制剂年销售额约50亿元人民币，尤其是丹参注射液和复方丹参注射液，年销售高达30亿支。现有的丹参注射液收录于部颁中药成方制剂第20册p34，标准编号为WS3-B-3766-98。功能与主治是活血化瘀，通脉养心。用于冠心病，心绞痛。用法与用量为肌内注射，一次24ml，一日12次；静脉注射，一次4ml(用50%葡萄糖注射液20ml稀释后使用)，一日12次；静脉滴注，一次1020ml(用5%葡萄糖注射液100500ml稀释后使用)，一日l次。或遵医嘱。目前的部颁质量标准中仅将原儿茶醛作为质量控制的指标成分，用高效液相色谱法测定其含量每lml含原儿茶醛(C7H603)不得少于0.2mg。该标准收录的丹参注射液制法为取丹参1500g，加水煎煮三次，第一次2小时，第二、三次各1.5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓縮至750ml。加乙醇沉淀二次，第一次使含醇量为75%，第二次使含醇量为85%，每次均冷藏放置后滤过，滤液回收乙醇，并浓縮至约250ml，加注射用水至400ml，混匀，冷藏放置，滤过，用10%氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，煮沸半小时，滤过，加注射用水至1000ml，灌封，灭菌，即得。由于历史的原因，目前的丹参注射剂也存在质量和临床安全性方面的问题。质量方面的问题主要表现为目前的丹参注射液产品是经传统工艺制备的中药材综合成分的提取物，由于认识的不到位以及制法、质控方法不完善，存在有效成分不明确，质量不稳定，表现为临床疗效不稳定，安全性可控性差，发生不良反应多且难以查找原因，难于适应中药现代化和国际化的要求。目前的丹参注射液中未知的非定量成分占相当的比例；一些大分子杂质，如鞣质等难以除去，放置一段时间后会出现色泽变深、混浊、沉淀等现象，从而影响制剂的疗效和安全性。鞣质是影响注射液澄明度的主要因素，鞣质是相对分子量大于iooo(—般3000-5000)的水溶性多酚类化合物，它能同生物碱、蛋白质及药物中的金属离子作用生成沉淀。例如，它与蛋白质分子、生物碱和多糖形成分子间氢键，生成不溶于水的沉淀物；因此必须将注射液中所含的鞣质去除。一般来说，鞣质进入体内极易引起黄疸和肝坏死，肌注局部会发生硬结、疼痛，鞣质是多元酚的衍生物，既溶于醇又溶于水。现有的部颁标准中二次醇沉工艺技术除鞣质技术效果差，所得产品很难合格，并且选择性差，大量有效成分同时被除去。现有的技术还包括热处理冷置法、水醇法、胶醇法、聚酰胺法和胶醇树脂法等(详见王凌等，华西药学杂志，2003，No.18，p275;王健等，基层中药杂志，2001，No.5，p51);水醇法为了除鞣质率高，一般pH值调高至9-10，在如果高的ra下，大量的丹酚酸成分被沉淀除去；在只考虑原儿茶醛的情况下，胶醇树脂法被最为看好，但事实上由于鞣质与丹酚酸类成分的结构相似性，大孔树脂带走了大量的主要有效成分。上述这些除去鞣质的方法选择性差，在除去鞣质的同时，大量的丹酚酸类有效成分被除去；有些方法还弓I入其他杂质，使产品的质量降低。随着对丹参成份认识的不断深入，近年的研究发现，丹参中以丹酚酸B和丹酚酸A为代表的水溶性丹酚酸类成分(一般相对分子量小于1000)心血管活性远比丹参素、原儿茶醛强，丹参水溶性酚酸类成分是丹参注射液的主要药效物质基础已得到学术界公认。丹参酚酸类物质对心血管系统具有广泛而显著的药理活性，具有极强的抗氧化作用，能保护缺血及缺血再灌注引起的心肌损伤、抑制血小板聚集、改善微循环、促进血管舒张并改善血液流变。令人关注的是，现有的部颁标准中的丹参注射液生产工艺中的关键工艺点未对细节进行规定，特别是浓縮等环节未对温度进行控制，由于丹参中主要有效成分是热敏性的水溶性成分，这些成分都不太稳定，原有的整个生产方法对有效成分特别是丹酚酸A、丹酚酸B的破坏严重，丹酚酸A、丹酚酸B损失非常大，需要进一步改进和提高生产工艺。研究表明，丹酚酸B等丹参水溶性有效成分在溶液中均易降解不稳定，张军等人(中国中药杂志vol.30，No.10，p789)曾对丹参水提液中的丹酚酸B稳定性进行研究，结果表明，丹参水液IO(TC加热1小时，丹酚酸B含量降低约30%，受热9小时，丹酚酸B含量降低约95%;60°C加热1小时，丹酚酸B含量降低约15%，受热9小时，丹酚酸B含量降低约60%;5(TC加热1小时，丹酚酸B含量降低约30%，受热8小时，丹酚酸B含量降低约40%。另曲桂武等人(中草药，2005，No.11，pl654)研究发现，丹参酚酸B的化学性质很不稳定。实验中发现水溶液中的丹参酚酸B在低质量浓度(<0.lmg/mL)下室温过夜损失接近30%，其分解产物为丹参素、原儿茶醛等。岳喜典等人(中草药，2005，No.2，p205)研究表明，要保持溶液中丹参酚酸B稳定性，应尽可能做到低溶液pH值、高丹参酚酸B质量浓度、低温，并且要尽量縮短溶液状态的存放时间。鉴于现有的丹参注射液质量标准中仅将原儿茶醛作为质量控制的指标成分，已远远落后于丹参制剂实际质量控制需要。近年来，为了提高对丹参注射液的有效成分的质控水平，许多学者和机构进行了不懈的研究，潘海妮等人对以丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B为质控指标进行了研究，建立了一种丹参注射液的质量控制评价和分析方法；国家有关部门也即将实行一个新的结合指纹图谱技术的丹参注射液质量标准，主要质控指标主要有2个，一是按国家药典会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统评价，本品指纹图谱与对照指纹图谱比较，相似度不得低于O.80;二是本品每lml含丹参素钠(C9H905Na)不得少于0.60mg;含原儿茶醛(C7H603)不得少于0.20mg;含丹酚酸B(C36H3。016)不得少于0.25mg。近年的进一步研究发现，在目前已知的水溶性丹酚酸类成分中，丹酚酸A为其中最强的有效成分，其药效作用是目前主流丹参制剂质控有效成分丹酚酸B的12倍左右。由于长期以来获得高含量的丹酚酸A的技术一直很难突破，丹酚酸A—直未能作为丹参制剂的质控指标。综上，目前现有的丹参注射液生产技术的主要缺陷是制法不很合理，导致主要有效成分丹酚酸A、B损失非常大；缺乏对关键有效成分丹酚酸A的质量控制，导致产品临床疗效不稳定；鞣质去除不完全，临床应用有较大的安全隐患。为克服现有的丹参注射液的制备方法中的缺陷，发明人已在申请号为200710143306.2的专利申请中对新的制备方法进行了详细的阐述。
发明内容鉴于现有的中质量标准中仅将原儿茶醛作为质量控制的指标成分，已远远不能适应目前对丹参注射液有效成分的质量控制和临床用药安全有效的要求，我们在获得高含量丹酚酸A的生产技术(详见中国专利申请200610165779.8)后，通过不断努力，发明了同时测定多种丹参注射液中有效成分的液相测定方法，可被定量的有效成分为丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A。应用本发明，申请人将上述4个质控指标的含量要求作为产品出厂检验的检验质控标准，将丹参注射液的新生产工艺及检测技术成功应用于丹参注射液的生产检验质量控制，由于新增加丹酚酸类中药效最强的丹酚酸A作为质控指标，与传统工艺和质控技术比较，所得丹参注射液产品质量更为稳定可靠，产品的有效性和安全性基本解决，真正达到安全有效，质量可靠。应用本发明，丹参注射液的质量控制中含量测定可包括如下内容它包括对丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A进行定性和定量控制，在一定的色谱条件下测试供试液液相图谱，本品要求每lml含丹参素钠(C9H905Na)不得少于0.65mg;含原儿茶醛(C7H603)不得少于O.23mg;含丹酚酸B(C36H3。0j不得少于0.28mg，含丹酚酸A((^^(V)不得少于0.10mg。本发明所述的定量控制方法为使用梯度洗脱程序应用反相高效液相色谱法同时测定丹参注射液中4种水溶性成分丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A;本发明所使用的一定的色谱条件，包括如下因素色谱柱；Agilent1100高效液相色谱系统，AgilentZORBAX80AExtend-C18柱(4.6X250mm)，流动相A:水-乙腈-甲酸(90:10:0.4，v/v)，流动相B:乙月青;流速1.OmL/min，检测波长280nm，柱温30。C，DAD扫描范围190400nm。所用的线性梯度洗脱程序，具体条件如下表1:表1:线性梯度洗脱程序5Time(min)A%B%01000208515507525701585801585对照品溶液的制备取丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A对照品适量，精密称定，加5X甲醇制成每lml含丹参素钠0.32mg、原儿茶醛0.10mg、丹酚酸B0.12mg和丹酚酸AO.05mg的混合溶液，即得。供试品溶液的制备精密量取本品2ml，置10ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5iU，注入液相色谱仪，测定，即得。本发明的质量控制4个含量控制指标的标准对照品HPLC图谱如图1所示，由4个特征峰组成。所述的四个特征峰的保留时间^为从左到右依次为丹参素钠tK=5.40min，原儿茶醛tK=9.60min，丹酚酸BtK=30.10min，丹酚酸AtK=34.30min。本发明方法可一次同时测定丹参注射液中的多个有效成分。通过对这4个丹参中主要有效成分的定量控制，可大大提高丹参注射液的安全性和有效性。本发明专利生产的丹参注射液制剂质量稳定、可控性强，且检测方法先进、准确、简便，适用于常规生产跟踪质量检验，对控制丹参注射液的质量有重要作用。丹参注射液分析方法建立及质量稳定性评价情况简单汇总如下仪器AgilentllOO型高效液相色谱仪，配脱气机、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、紫外检测器(Agilent公司)。试剂乙腈为色谱纯(MERCK公司)，其余试剂均为分析纯，水为纯净水。对照品丹参素钠(中检所，批号110855-200507)，原儿茶醛(中检所，批号110809-200503)、丹酚酸B(中检所，批号:111562-200609)、丹酚酸A(自制，归_化标定含量98.8%)。色谱条件色谱柱Agilent1100高效液相色谱系统，AgilentZorbax80AExtend-C18柱(4.6乂250咖)，流动相八水-乙腈-甲酸(90:10:0.4，v/v)，流动相B:乙月青;流速1.OmL/min，检测波长280nm，柱温30。C，DAD扫描范围190400nm。所用的线性梯度洗脱程序Omin0%B，20min15%B，50min25%B，70min85%B，80min85B%。分离条件与检测波长的选择在上述色谱条件下，丹参注射液中4个定量指标成分色谱峰与相邻峰均达到基线分离，峰形对称，保留时间适宜，丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A的^分别为丹参素钠tK=5.40min，原儿茶醛tK=9.60min，丹酚酸Bt^=30.10min，丹酚酸At^=34.30min，确定样品检测波长为280nm。线性关系考察精密吸取上述对照品溶液5ia，注入液相色谱仪，按前述色谱条件测定。以对照品溶液质量浓度X(g/L)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线(见6表2:线性关系表)。各指标成分在测定质量浓度内，线性关系良好。表2:线性关系表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>精密度试验仪器精密度精密吸取上述混合对照品溶液51，注入液相色谱仪，按前述色谱条件测定。连续进样5次，以峰面积计算各指标成分相对标准偏差RSD为0.88-1.47%。方法精密度取丹参注射液制剂平行配制5份供试液，各供试液连续进样测定3次，以峰面积计算各指标成分相对标准偏差RSD为1.08-1.46%。日间精密度取同一批丹参注射液样品，连续6天测其含量，结果相对标准偏差RSD均〈1.5%，结果表明该方法日间精密度量符合要求。样品稳定性取丹参注射液供试品，分别在0hr，lhr，2hr，3hr，4hr，按前述色谱条件测定供试品溶液丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A含量，结果相对标准偏差RSD均<1.5%，结果表明供试品在4小时内稳定。回收率试验精密吸取已知含量的丹参注射液5ml，置10ml量瓶中，分别加入各对照品适量，每个对照品均配3个浓度，各对照品加入量依次为丹参素钠(3.9mg，3.3mg，2.6mg)、原儿茶醛(1.4mg，1.2mg，0.9mg)、丹酚酸B(1.7mg，1.4mg，1.lmg)和丹酚酸A(O.6mg，0.5mg，0.4mg)对照品溶液lml，制成供试品溶液，按上述液相色谱条件测定，计算各质控成分的平均回收率依次为丹参素钠99.6%(RSD1.50%)、原儿茶醛100.1%(RSD1.37%)、丹酚酸B99.8%(RSDl.46%)、丹酚酸A99.5%(RSD1.41%)。经过上述研究，本发明确定了如下的色谱条件色谱柱Agilent1100高效液相色谱系统，AgilentZORBAX80AExtend-C18柱(4.6X250mm)，流动相A:水-乙月青-甲酸(90:10:0.4，v/v)，流动相B:乙腈；流速1.0mL/min，检测波长280nm，柱温30。C，DAD扫描范围190400nm。所用的线性梯度洗脱程序Omin0%B，20min15%B，50min25%B，70min85%B，80min85B%。使用仪器类型高效液相色谱仪器型号Agilent1100流动相A:水_乙腈_甲酸(90:10:0.4，v/v)，流动相B:乙腈;梯度方式Omin0%B，20min15%B，50min25%B，70min85%B，80min85B%，检测器二极管阵列(DAD)检测器检测波长280nm柱温3(TC柱型号:ZORBAX80AExtend_C18柱(4.6X250mm)流速:1.OmL/min，积分方法面积归一法图14个含量控制指标的混合标准对照品HPLC图谱图2实施例1制备的丹参注射液HPLC图谱图3实施例2制备的丹参注射液HPLC图谱图4实施例3制备的丹参注射液HPLC图谱图5实施例4制备的丹参注射液HPLC图谱图6实施例5制备的丹参注射液HPLC图谱具体实施例方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步说明。如下实施例中对不同制备工艺的丹参注射液采用本发明的液相测定方法进行定量测定。按照每1ml含丹参素钠不得少于0.65mg;含原儿茶醛不得少于0.23mg;含丹酚酸B不得少于0.28mg，含丹酚酸A不得少于0.10mg的质量标准进行质量判断。鞣质检验依据2005版药典附录注射剂项下鞣质检查法进行。实施例1传统工艺制备丹参注射液取丹参1500g，加水煎煮三次，第一次2小时，第二、三次各1.5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓縮至750ml。加乙醇沉淀二次，第一次使含醇量为75%，第二次使含醇量为85%，每次均冷藏放置后滤过，滤液回收乙醇，并浓縮至约250ml，加注射用水至400ml，混匀，冷藏放置，滤过，用10%氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，煮沸半小时，滤过，加注射用水至lOOOml，灌封，灭菌，即得。按本发明的质控方法进行检验，每1ml含丹参素钠1.OOmg;含原儿茶醛0.90mg;含丹酚酸BO.10mg，含丹酚酸A0.05mg;鞣质检验有大量沉淀。结果判断，按本发明质控方法，除丹参素钠和原儿茶醛符合要求外，鞣质检验和丹酚酸A、B均不合格。实施例2传统工艺结合碱沉(传统工艺，pH=9.0)制备丹参注射液与实施例1基本相同，所不同的是在第二次醇沉时，用40%氢氧化钠溶液调节pH值至9.0，充分搅拌，静置约1小时。冷藏，冷藏后的二次醇沉液过滤，减压蒸馏回收乙醇。加注射用水至400ml，加1:1盐酸调pH至6.8，煮沸半小时，滤过，加注射用水至lOOOml，灌封，灭菌，即得。按本发明的质控方法进行检验，每1ml含丹参素钠0.95mg;含原儿茶醛0.80mg;含丹酚酸BO.05mg，含丹酚酸AO.02mg;鞣质检验澄清。结果判断，鞣质检验合格，但按本发明质控方法，除丹参素钠和原儿茶醛符合要求(均比实施例l低)夕卜，和丹酚酸A、B均不合格(均比实施例l低)。实施例3传统工艺结合碱沉(传统工艺，pH=8.0)制备丹参注射液与实施例2基本一样，所不同的是在第二次醇沉时，用40%氢氧化钠溶液调节pH值至8.0，其他均相同。按本发明的质控方法进行检验，每1ml含丹参素钠0.85mg;含原儿茶醛0.76mg;含丹酚酸BO.09mg，含丹酚酸AO.04mg;鞣质检验有少量沉淀。结果判断，按本发明质控方8法，除丹参素钠和原儿茶醛符合要求外，鞣质检验和丹酚酸A、B均不合格。与实施例1相比，4个主要成分含量相差不大。实施例4本发明的低温浓縮，超滤(分子量5000)复合除鞣工艺与实施例3基本一样，所不同的是在提取后的浓縮和回收乙醇时控制低于6(TC进行，另外在二次醇沉，pH=8.0碱沉后增加超滤除鞣。所用的超滤膜为Romicon中空纤维膜(5000分子量)。具体如下(1)煎煮取丹参1500g，加水煎煮三次，第一次2小时，第二、三次各1.5小时，每次煎毕放出药液过滤(60目筛)，合并滤液。(2)浓縮将滤液低于6(TC减压浓縮至750ml，冷却。(3)醇沉浓縮液冷却后，先加乙醇至含醇量75%，搅拌，静置约1小时。取上清液，冷藏20-48小时，冰库温度控制在5t:以下。冷藏后过滤，低于6(TC减压蒸馏回收乙醇。回收乙醇至浓縮液约300ml，放冷至室温。(4)再加乙醇至含醇量85X，用40X氢氧化钠溶液调节pH值至8.0，充分搅拌，静置约1小时。冷藏40-68小时，冷藏后的二次醇沉液过滤，低于6(TC减压蒸馏回收乙醇。回收乙醇至约250ml(每lml约含原生药8.5-10g)。(5)超滤加注射用水至400ml，加10%盐酸调pH至6.8，混匀，冷藏放置36-60小时，采用Romicon中空纤维膜(5000分子量)超滤，收集滤液。(6)加入适量注射用水，加热煮沸30分钟，放冷至6(TC，加入适量0.1%活性炭，保温10分钟，滤过，取药液测得原始ra值，用10%的NaOH溶液调ra至6.8，用过滤后的注射用水补足至1000ml，并充分搅拌均匀。灌封，灭菌，即得。按本发明的质控方法进行检验，每lml含丹参素钠0.70mg;含原儿茶醛0.35mg;含丹酚酸BO.35mg，含丹酚酸A0.15mg;鞣质检验澄清。结果判断，按本发明质控方法，鞣质检验和4个主要成分含量质控都符合要求。实施例5本发明的低温浓縮，葡聚糖凝胶色谱技术复合除鞣工艺与实施例4基本一样，所不同的是实施例4的步骤(5)中改用葡聚糖凝胶色谱技术，采用葡聚糖凝胶G15，步骤(4)所得药液上葡聚糖凝胶柱，进样后收集从1/3-1/2柱体积开始的洗脱液(最初的洗脱液为大分子物质，废弃)，洗脱液采用适量纯净水。按本发明的质控方法进行检验，每lml含丹参素钠0.69mg;含原儿茶醛0.36mg;含丹酚酸BO.32mg，含丹酚酸AO.13mg;鞣质检验澄清。结果判断，按本发明质控方法，鞣质检验和4个主要成分含量质控都符合要求。但葡聚糖凝胶G15处理量较少，不如实施例4的超滤法。实施例1-5的结果汇总如下，详见表3:表3:实施例1-5的产品检验结果汇总表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>本发明所要求保护的具体技术方案，不限于上述实施例所表达的技术方案的具体组合。权利要求一种丹参注射液中有效成分的定量测定方法，该方法可同时定量测定丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A这四种有效成分，其特征在于采用如下步骤1)对照品溶液的制备取丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A对照品适量，精密称定，加5％甲醇制成每1ml含丹参素钠0.32mg、原儿茶醛0.10mg、丹酚酸B0.12mg和丹酚酸A0.05mg的混合溶液，即得；2)供试品溶液的制备精密量取丹参注射液2ml，置10ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得；3)色谱条件色谱柱AgilentZorbaxSB-C18、XDB-C18或InertsilODS-3其中的一种；流动相；流动相A水-乙腈-甲酸(90∶10∶0.4，v/v)，流动相B乙腈，采用线性梯度洗脱程序0min0％B，20min15％B，50min25％B，70min85％B，80min85B％；流速1.0mL/min；检测波长280nm；柱温30℃；DAD扫描范围190～400nm4)测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。2.权利要求1所述的一种丹参注射液中有效成分的液相测定方法，所述色谱柱指的是AgilentZorbaxSB_C18。全文摘要本发明公开了一种丹参注射液中有效成分的定量测定方法。用于定量的有效成分为丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A，测定步骤包括对照品溶液的制备、供试品溶液的制备和液相测定；色谱条件为C18色谱柱，线性梯度洗脱程序，DAD扫描。该测定方法可用于丹参注射液的质量控制，有效保证了丹参注射液的质量。大规模市场应用表明，本发明的丹参注射液不良反应少、安全性高，疗效确切，质量可控。文档编号G01N30/02GK101773547SQ20101011747公开日2010年7月14日申请日期2007年8月20日优先权日2007年8月20日发明者张建兵,柴建国,沈培强,潘迎锋,王木兰,许正宇,黎豫杭申请人:正大青春宝药业有限公司