一种定量测定五羟色胺的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分析化学、电分析化学、生物电分析化学技术领域，具体涉及一种定量 测定神经递质五羟色胺的电化学检测方法。
【背景技术】
[0002] 五羟色胺（5-HT)是大脑内主要神经递质之一，在脑神经细胞内合成，可参与多种 生理功能及病理状态的调节，如体温，睡眠、饮食、精神情感性疾病等。五羟色胺是一种电活 性物质，可以采用电化学方法进行检测，但其氧化过程中产生的氧化活性产物易吸附在各 种不同材料的电极表面形成绝缘膜，包括贵金属电极，玻碳电极、碳纤维电极以及鹏掺杂金 刚石电极等，导致电极表面被污染而影响检测灵敏度与稳定性。
[0003] 碳纤维超微电极具有高时间、空间分辨率及高灵敏度等优良特性，近年来在多个 领域得到了广泛而深入的研宄，已成为电化学研宄中极具发展前景的一个重要分支。由于 它能够在生物体系中检测特定微区内的快速而微小的化学变化，超微电极电化学检测被广 泛应用在生物微环境中探索细胞化学，而且特别适宜于活体分析。然而，在生物电化学分 析体系中，碳纤维超微电极表面易被电化学反应中产生的自由基或电聚合产物污染而钝 化，电极污染物主要是一些有机生物分子如五羟色胺，组胺，氨基酸，NADH，苯胺等以及其氧 化、代谢产物，它们易在电极表面吸附形成绝缘膜，导致电极电信号随时间延长急剧衰减。 目前，碳纤维超微电极抗污染的方法主要通过快速循环伏安法以及对电极进行修饰处理。 Jackson等报道了通过快速循环伏安法测定五轻色胺（Fast-Scan cyclic voltammetry of5_Hydroxytryptamine，Anal Chem，vol. 67 :1115-1120,1995)，该法能在一定程度上减 轻电极污染，污染问题仍不能忽略，且同时会降低检测灵敏度和选择性。程寒等研制了单 壁碳纳米管修饰的碳纤维微电极（单壁碳纳米管修饰电极的抗污染性能研宄及其用于五 羟色胺检测，分析化学，vol.41 :540-545,2013)，采用安培法对五羟色胺进行检测，修饰电 极对五羟色胺造成的电极污染有显著的减轻。Hashemi等采用电镀方法将阳离子交换聚合 物 Nafion 修饰于碳纤维微电极表面（Voltammetric detection of 5-hydroxytryptamine release in the rat brain，Anal Chem，vol. 81 :9462_9471，2009)，用于老鼠大脑五轻色 胺释放动力学监测；朱明芳等制备了石墨烯-四磺酸基酞菁铁修饰的碳纤维微电极（神经 递质分子电化学测定的新方法研宄，华南理工大学博士学位论文，43-56,2012)，并用于小 鼠海马区中多巴胺和五羟色胺的同时测定，然而对电极进行修饰处理过程较复杂，还会污 染环境，且修饰电极往往存在修饰物在电极表面附着不够牢固、膜的厚度难以控制、电极寿 命较短等缺点。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中五羟色胺测定方法的上述不足，本发明提供了一种新的定量检测 五羟色胺的方法。
[0005] 本发明提供的定量测定五羟色胺的方法，过程包括：
[0006] (1)碳纤维超微电极经清洗后用循环伏安法活化，再用超纯水清洗，得到活化后洁 净的碳纤维超微电极，记为洁净电极；
[0007] (2)采用双电极系统，所有电位均以Ag/AgCl作为参比电极，洁净电极和经火焰灼 烧活化的该洁净电极为工作电极，铁氰化钾水溶液或多巴胺水溶液为基准溶液，梯度浓度 的五羟色胺溶液作为标准溶液，采用差分脉冲伏安法进行检测；
[0008] A、首先取一根洁净电极在基准溶液中扫描，记录峰电流作为基准电流；洁净电极 用超纯水清洗晾干，再在任一浓度五羟色胺标准样品中扫描，记录氧化峰电流；
[0009] B、测试完该浓度五羟色胺的洁净电极用超纯水清洗晾干，火焰灼烧进行活化后再 在基准溶液中扫描，记录峰电流，然后将电极清洗晾干，在另一浓度五羟色胺标准样品中扫 描，记录氧化峰电流；
[0010] 重复B步骤至完成全部五羟色胺标准样品的测试；
[0011] (3)以各次经火焰灼烧活化后的洁净电极在基准溶液中的峰电流与基准电流的比 值为电流校正因子，各梯度浓度五羟色胺溶液中氧化峰电流除以该浓度五羟色胺检测时对 应的校正因子为校正后五羟色胺溶液中氧化峰电流；
[0012] 以五羟色胺浓度和校正后五羟色胺溶液中氧化峰电流绘制成标准曲线，进而得到 相应的线性回归方程；
[0013] (4)取待测样品去除其中的细胞和蛋白后，步骤⑵的电极用超纯水清洗晾干，火 焰灼烧进行活化后在基准溶液中扫描，记录峰电流，然后将电极清洗晾干，在待测样品中扫 描，记录氧化峰电流；将峰电流值带入线性回归方程中，得到待测样品中五羟色胺的浓度。
[0014] 实际检测工作中，待测样品可以为血液、尿液、组织细胞液等，为使检测结果更准 确，最好去除其中的蛋白和细胞等成分。
[0015] 优选地，上述定量测定五羟色胺的方法中，步骤（2)的差分脉冲伏安法中，初始电 位0. 2V、终止电位0. 7V、电位增量0. 004V、振幅0. 05V、脉冲宽度0. ls、采样宽度0. 0167s、 脉冲周期〇. 2s，支持电解质为20mmol/L、pH值7. 2的Tris-HCl缓冲溶液。
[0016] 优选地，上述定量测定五羟色胺的方法中，碳纤维超微电极的制备方法为：将洁净 的玻璃毛细管一端拉制成内径18~22 ym的尖端；碳纤维依次用丙酮、乙醇和二次蒸馏水 超声清洗后在空气中晾干；将碳纤维和铜丝用碳粉导电胶粘连，将碳纤维从玻璃毛细管另 一端穿入至露出玻璃毛细管尖端外，毛细管另一端用环氧树脂密封，环氧树脂固化后固定 铜丝；将带有碳纤维的毛细管尖端置于750~850°C的火焰下灼烧至毛细管尖端熔融将碳 纤维密封于其中；再将经熔融密封的碳纤维靠向340~360°C的火焰至黑色背景下观察到 碳纤维尖端微红时立即拿开，获得碳纤维超微电极。
[0017] 优选地，上述定量测定五羟色胺的方法中，铁氰化钾水溶液中铁氰化钾的摩尔浓 度为1. OX l(T3m〇l/L，多巴胺水溶液中多巴胺的摩尔浓度为1. OX l(T4m〇l/L。当电极尖端碳 纤维长度约为1〇〇 U m时，在浓度为1. 0 X l(T3m〇l/L铁氰化钾和1. 0 X l(T4m〇l/L多巴胺溶液 中氧化峰电流均较大，数量级为1 X 10_8A，电流重现性好，适合作为基准溶液。
[0018] 优选地，上述定量测定五羟色胺的方法中，梯度浓度五羟色胺溶液的五羟色胺浓 度在1. 0XKT6~2. 0Xl(T4m〇l/L范围内。实验表明，五羟色胺的浓度在该范围内时，其氧 化峰电流随浓度增大而增大，线性关系最稳定，因此能确保获得的检测结果最准确。
[0019] 优选地，上述定量测定五羟色胺的方法中，五羟色胺溶液由IX l(T2m〇l/L五羟色 胺母液经pH值7. 2的Tris-HCl稀释配制。
[0020] 浓度为1 X l(T2m〇l/L五羟色胺母液由0? lmol/L HC104水溶液溶解五羟色胺粉末 配制而成，然后置于4°C冰箱内保存。样品在每次实验前由母液用20mmol/L、pH值7. 2的 Tris-HCl缓冲溶液稀释至所需的浓度，选择Tris-HCl稀释配制梯度标准溶液主要目的是 作为支持电解质。
[0021] 根据类似的技术原理，本发明还提供了另一种定量测定五羟色胺的方法，过程包 括：
[0022] (1)碳纤维超微电极经清洗后置于H2S04溶液中用循环伏安法活化，再用超纯水清 洗，得到活化后洁净的碳纤维超微电极，记为洁净电极；
[0023] (2)采用双电极系统，所有电位均以Ag/AgCl作为参比电极，将多个洁净电极在 1. OX l(T5m〇l/L多巴胺基准溶液中进行差分脉冲伏安扫描，筛选出峰电流差异在20%以内 的电极作为工作电极；
[0024] (3)梯度浓度五羟色胺溶液标准样品的每个浓度值对应一个工作电极，测定并记 录各工作电极在1. 〇X l(T5m〇l/L多巴胺基准溶液中的峰电流，以最低浓度五羟色胺溶液对 应的工作电极在基准溶液中的峰电流作为基准电流，其他工作电极在基准溶液中的峰电流 与基准电流的比值为电流校正因子，