专利名称：海洋中含细菌叶绿素的微生物的准确定量方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物的定量方法，尤其是涉及一种采用基于时间序列观察、自动成像和数字化分析的落式荧光显微镜法对海洋环境中独特的含细菌叶绿素(Bchl.a)的微生物群的准确定量方法。
背景技术：
含细菌叶绿素(Bchl.a)的微生物是海洋中一个特殊的功能类群，有着重要的生态学意义和资源环境意义(Kolber et al.，2000，2001)。至今，用于海洋中含细菌叶绿素的微生物的计数方法主要有以下几种红外快速脉冲速率(IRFRR)诱导荧光瞬时动力学技术(Kolber etal.，2000)、红外落式荧光显微镜技术(IREM)(Kolber et al.，2001)、高效液相色谱法(HPLC)(Goericke，2002)、双重调节技术(dual modulation techniques)(Koblizek et al.，2005)和定量聚合酶链式反应(QPCR)(Schwalbach and Fuhrman，2005)等。IRFRR是一独特的能监测细菌光合作用过程中电子传递的技术(Kolber et al.，2000)，但尚无仪器上市，这项技术只能在个别专业实验室可提供。HPLC能直接测定细菌叶绿素a和叶绿素a的含量及比值(BChl.a/Chl.a)，且能根据光合色素比例，比较海洋中含细菌叶绿素的微生物和浮游植物对能量循环的贡献，但不适于生物量的估计。QPCR法是基于光合基因的定量方法，而并非对BChl.a的直接检测，这个方法是有前景的，有助于海洋中所有含同样基因序列的微生物的研究。但该法受限于已知的含细菌叶绿素的微生物，即没有足够的已知序列用于设计能覆盖全部海洋中含细菌叶绿素的微生物的引物。所有上述方法都不能提供海洋中含细菌叶绿素的微生物的直接丰度，即微生物功能群的直接测量，且不同的方法所得的结果(如BChl.a/Chl.a)差异很大。
上述各种方法中，IREM是检测海洋中含细菌叶绿素的微生物丰度的最简便的方法，该方法以BChl.a所发的红外荧光为检测信号(Kolber et al.，2001；Schwalbach and Fuhrman，2005)。但是，我们发现自然海水样品中丰富的蓝细菌(海洋环境中常见的属为原绿球藻和聚球藻)导致了IREM法的显著阳性误差(Zhang and Jiao 2004；Schwalbach and Fuhrman，2005)。因为在含细菌叶绿素的微生物检测的显微设置下能同时检测到蓝细菌发出的红外荧光，且在自然海水样中蓝细菌丰度与海洋中含细菌叶绿素的微生物在同一个数量级上，因此这种阳性误差是相当可观的。Zhang和Jiao(2004)报道在东海的浅水域中由聚球藻所引进的正误差可高达30％。而由另一组蓝细菌——原绿球藻所引进的误差尚未计算入内。因为原绿球藻所发出的荧光信号被海水样中共存的具强荧光的较大细胞，如聚球藻(Synechococcus)所掩盖，从而在最初的蓝细菌视野下无法被观察到。在经典的落式荧光显微镜(EM)或IREM法中，快速观察对防止荧光的焠灭是必要的，所以我们一般采用最初的蓝细菌图像进行误差校正，故原绿球藻的存在对海洋中含细菌叶绿素的微生物计数造成的严重误差(Zhang andJiao 2004；Schwalbach and Fuhrman，2005)无法用普通的IREM法校正。
发明内容
本发明的目的在于针对红外落式荧光显微镜(IREM)法不能解决的聚球藻和原绿球藻共存所引起的海洋中含细菌叶绿素的微生物计数的误差，提供一种新的能对海洋中含细菌叶绿素的微生物进行准确定量的方法，即“基于时间序列观察的扣除蓝细菌误差的红外落式荧光显微镜法”，该法能准确计算出聚球藻和原绿球藻的总数，从而可对海洋中含细菌叶绿素的微生物进行准确计数。
本发明所采用的技术方案如下1).将所采样品预过滤、固定、双链DNA荧光染料(4’6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色、过滤并制片；2).用配有红敏的电子耦合组件(CCD)照相机(SPOT Diagnostic Instruments，Inc.)和汞灯(Carl Zeiss Light MicroscopyAXIOSKOP 4)的落式荧光显微镜进行观察，以3组不同的荧光激发块分别对同一视野的红外(IR)、蓝细菌(Cyano)和DAPI图像进行观察和拍照；显微聚焦后，进行IR、Cyano和DAPI图像时间序列上的获取图像；3).对图像中的细胞进行识别和分析，并获得新的二元数字化图像；4).计算；假设一个视野下，分别获得IR图像a、平台期的Cyano图像b(时间序列观察中获得的蓝细菌数目最大的图像，包括聚球藻和原绿球藻)和DAPI图像c，并分别获得相应的二元数字化图像d、e和f，那么海洋中含细菌叶绿素的微生物的丰度＝Boolean AND[(d)，(f)]-Boolean AND[(d)，(e)](其中“Boolean AND”指“逻辑运算与”)。
在步骤1)中，所说的样品预过滤的方法是将样品用孔径为20μm的筛绢预过滤，以除去大的有机生物体和无机物颗粒；所说的固定方法是将预过滤后的样品用终浓度为2％的多聚甲醛在暗中固定15分钟；所说的双链DNA荧光染料的染色方法是用终浓度为5μg/ml的双链DNA荧光染料在室温下暗中染色30分钟；所说的过滤并制片方法是将染色后的样品用真空泵和滤器以小于0.03MPa的压力抽滤到25mm直径、0.2μm孔径的黑色聚碳酸酯膜上，然后剪取1/4膜样(过滤有样品的聚碳酸酯膜)，在载玻片和盖玻片上各滴一滴镜油，将1/4膜样(细胞面朝上)放在载玻片上，后盖上盖玻片压平。
在步骤2)中，用配有红敏的电子耦合组件照相机和50W汞灯的落式荧光显微镜进行观察，以3组不同的荧光激发块分别对同一视野的红外、蓝细菌和双链DNA荧光染料图像进行观察和拍照，所有的图像均通过自动曝光获得；显微聚焦后，进行红外、蓝细菌和双链DNA荧光染料图像时间序列上的获取，每隔60秒获取一张图像，持续10-15分钟。
在步骤3)中，对图像中的细胞可用Image-Pro Plus(IPP)软件(Media Cybernetics，Inc.)进行识别和分析，并获得新的二元数字化图像。
与已有的技术相比，本发明的优势在于技术的普及性(落式荧光显微镜在一般实验室均有提供)；容易操作且花费小；能够在单细胞水平上将海洋中含细菌叶绿素的微生物、蓝细菌与样品中其它细菌区别开来，从而可对海洋中含细菌叶绿素的微生物进行准确计数。
具体实施例方式
1.将所采样品先以20μm的筛绢预过滤以除去大的有机生物体和无机物颗粒，后用终浓度为2％的多聚甲醛(PFA)固定15分钟，再以终浓度为5μg/ml的DAPI染色30分钟，之后细胞被过滤到0.2μm孔径的黑色聚碳酸酯(PC)膜(Whatman)上，剪取1/4膜样，细胞面朝上制片。
2.用EM对制片进行观察，所用的荧光激发块如下所示。含红外荧光的细胞所用的荧光激发块(Chroma Technology Corp)是350-550nm激发，LP 850nm发射，650nm分光(Kolberet al.，2001；Zhang and Jiao，2004)(IR-settings)。染DAPI的细胞用于对照，其所用的荧光激发块是330-390nm激发，440-490nm发射，400-430nm分光(Zeiss Filter set 02)(Kolber er al.，2001；Zhang and Jiao，2004)(DAPI-settings)。蓝细菌(主要包括聚球藻和原绿球藻)细胞所用的荧光激发块是BP 546±12nm激发，LP 590nm发射(Li and Wood，1988；Sherry and Wood，2001)，FT 580nm分光(Zeiss Filter set 15)(Cyano-settings)。每个显微镜视野用×100的油镜观察，对同一个视野同时获得红外图像、蓝细菌图像和DAPI图像。所有的图像均通过自动曝光获得，其“gain limit”(增益限制，自动成像软件中的一个设置参数)是8。时间序列的IR、Cyano和DAPI图像在初始约30秒的聚焦步骤后，连续被捕获10-15分钟，时间间隔是60秒。
3.对图像中的细胞用Image-Pro Plus(IPP)软件(Media Cybernetics，Inc.)进行识别和分析。首先通过测定平均背景灰度值并以此重新生成灰度图像，使原始图像标准化。图像中的细胞边界以IPP的“Variance filter”(差异过滤，IPP软件中的一个设置参数)来测定并强化，“Variance filter”会以灰度值计算的标准偏差来替换周围3×3相邻像素点灰度值。生成的图像以“3×3 neighborhood median filter”(3×3相邻中值过滤，IPP软件中的一个设置参数)进行弱化。最后软件以一固定设置的灰度值自动识别细胞，从而获得二元图像。将CCD图像中的点进行二元数字化以产生一个新的图像，可以获得更可信的数据。在这个二元图像中背景灰度值为“0”，而每个被识别的点不管大小都为“1”。最后，不同图像之间的细胞定位可以通过逻辑运算“与”来进行。
4.计算假设一个视野下，分别获得IR图像a、平台期的蓝细菌图像b(时间序列观察中获得的蓝细菌数目最大的图像，包括聚球藻和原绿球藻)和DAPI图像c，并分别获得相应的二元数字化分析结果图像d、e和f，那么海洋中含细菌叶绿素的微生物的丰度＝Boolean AND[(d)，(f)]-Boolean AND[(d)，(e)]。
权利要求
1.海洋中含细菌叶绿素的微生物的准确定量方法，其特征在于其步骤为1).将所采样品预过滤、固定、双链DNA荧光染料染色、过滤并制片；2).用配有红敏的电子耦合组件照相机和汞灯的落式荧光显微镜进行观察，以3组不同的荧光激发块分别对同一视野的红外、蓝细菌和双链DNA荧光染料图像进行观察和拍照；显微聚焦后，进行红外、蓝细菌和双链DNA荧光染料图像时间序列上的获取图像；3).对图像中的细胞进行识别和分析，并获得新的二元数字化图像；4).计算假设一个视野下，分别获得红外图像a、平台期的蓝细菌图像b和双链DNA荧光染料图像c，并分别获得相应的二元数字化图像d、e和f，那么海洋中含细菌叶绿素的微生物的丰度＝Boolean AND[(d)，(f)]-Boolean AND[(d)，(e)]，其中“Boolean AND”指“逻辑运算与”。
2.如权利要求1所述的海洋中含细菌叶绿素的微生物的准确定量方法，其特征在于在步骤1)中，所说的样品预过滤的方法是将样品用孔径为20μm的筛绢预过滤，以除去大的有机生物体和无机物颗粒。
3.如权利要求1所述的海洋中含细菌叶绿素的微生物的准确定量方法，其特征在于所说的固定方法是将预过滤后的样品用终浓度为2％的多聚甲醛在暗中固定15分钟。
4.如权利要求1所述的海洋中含细菌叶绿素的微生物的准确定量方法，其特征在于所说的双链DNA荧光染料的染色方法是用终浓度为5μg/ml的双链DNA荧光染料在室温下暗中染色30分钟。
5.如权利要求1所述的海洋中含细菌叶绿素的微生物的准确定量方法，其特征在于所说的过滤并制片方法是将染色后的样品用真空泵和滤器以小于0.03MPa的压力抽滤到25mm直径、0.2μm孔径的黑色聚碳酸酯膜上，然后剪取1/4膜样，在载玻片和盖玻片上各滴一滴镜油，将1/4膜样放在载玻片上，后盖上盖玻片压平。
6.如权利要求5所述的海洋中含细菌叶绿素的微生物的准确定量方法，其特征在于所说的膜样为过滤有样品的聚碳酸酯膜，将1/4膜样细胞面朝上并放在载玻片上，后盖上盖玻片压平。
7.如权利要求1所述的海洋中含细菌叶绿素的微生物的准确定量方法，其特征在于在步骤2)中，用配有红敏的电子耦合组件照相机和50W汞灯的落式荧光显微镜进行观察，以3组不同的荧光激发块分别对同一视野的红外、蓝细菌和双链DNA荧光染料图像进行观察和拍照，所有的图像均通过自动曝光获得。
8.如权利要求1所述的海洋中含细菌叶绿素的微生物的准确定量方法，其特征在于在步骤2)中，显微聚焦后，进行红外、蓝细菌和双链DNA荧光染料图像时间序列上的获取，每隔60秒获取一张图像，持续10-15分钟。
9.如权利要求1所述的海洋中含细菌叶绿素的微生物的准确定量方法，其特征在于在步骤3)中，对图像中的细胞用Image-Pro Plus(IPP)软件(Media Cybernetics，Inc.)进行识别和分析，并获得新的二元数字化图像。
全文摘要
海洋中含细菌叶绿素的微生物的准确定量方法，涉及一种微生物的定量方法，提供一种新的能对海洋中含细菌叶绿素的微生物进行准确定量的方法，其步骤为样品预过滤、固定、双链DNA荧光染料染色、过滤并制片；用配有红敏的电子耦合组件照相机和汞灯的落式荧光显微镜进行观察，以3组不同的荧光激发块分别对同一视野的红外、蓝细菌和双链DNA荧光染料图像进行观察和拍照；显微聚焦后，进行红外、蓝细菌和双链DNA荧光染料图像时间序列上的获取图像；对图像中的细胞进行识别和分析，并获得新的二元数字化图像；计算由红外图像、蓝细菌图像、染料图像、二元数字化图像，得海洋中含细菌叶绿素的微生物的丰度。
文档编号C12Q1/04GK1710096SQ200510078730
公开日2005年12月21日 申请日期2005年6月3日 优先权日2005年6月3日
发明者焦念志, 张瑶, 陈瑶 申请人:厦门大学