专利名称：纤维寡糖发酵性发酵细菌属性状转化微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有β-葡萄糖苷酶外源基因的重组DNA以及含有该重组DNA的性状转化微生物，该性状转化微生物可用于由含有纤维寡糖的原料高效地生产乙醇。
背景技术：
乙醇生产中所用的主要微生物有酵母属的酵母、发酵单胞菌属或发酵细菌属的细菌。通常，这些微生物由葡萄糖等单糖高效地生产乙醇，但不能由寡糖或多糖生产乙醇。因此，以纤维素类生物质为原料生产乙醇的场合，首先，必须将纤维素分解为用微生物可发酵的单糖。纤维素的分解、糖化中，通常采用使用纤维素酶的酶法，或使用硫酸等的酸糖化法等，但现状是用这些方法也很难将纤维素完全分解为单糖，或者为了提高分解率而过量地进行反应时，糖的回收率降低，结果，存在乙醇的生产效率变差等问题。
因此，为了提高以生物质为原料的乙醇生产的收率，有必要将β-葡萄糖苷酶基因导入乙醇生产所用的微生物中，构建能够以纤维素的部分分解物即纤维寡糖为底物，生产乙醇的性状转化微生物。
已知发酵单胞菌属和发酵细菌属的细菌的发酵速度比酵母菌属的酵母快，有关以发酵单胞菌属的细菌作为宿主细胞的性状转化微生物的构建，已进行过各种尝试。例如，美国专利NO.5,712,133号的说明书中，公开了将戊糖发酵性性状转化至发酵单胞菌属的细菌中。但是，即使按该美国专利所述的方法将β-葡萄糖苷酶基因导入发酵单胞菌属的细菌中，也不能使β-葡萄糖苷酶分泌到细胞外，而且，由于纤维寡糖不能透过发酵单胞菌属的细胞壁，因此，不能由纤维寡糖发酵生产乙醇。另外，WO98/45451中，公开了通过将克雷伯氏菌属细菌的纤维二糖整合系基因性状转化至发酵单胞菌属，从而可以由细胞内的纤维二糖生产乙醇，但乙醇的生产效率不高。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种性状转化微生物，其针对不能利用纤维寡糖的发酵细菌属微生物，用重组DNA的方法，导入β-葡萄糖苷酶，从而具有由纤维寡糖生产乙醇的能力。
本发明者着眼于β-葡萄糖苷酶生产性微生物，进行各种筛选，可以获得表现出广泛的纤维寡糖分解特性的酶。但是，由于发酵细菌属细菌的宿主-载体系统未建立，所以对载体的构建、性状转化的方法、纤维寡糖代谢关联酶的基因的克隆等方面进行了反复努力研究，结果，这回发现，以发酵细菌属作为宿主细胞时，性状转化的β-葡萄糖苷酶可以分泌到细胞外，由此可排除因底物进入而限速的影响，由含有纤维寡糖的发酵原料能够高效地生产乙醇，从而完成了本发明。
因此，本发明提供具有导入了β-葡萄糖苷酶外源基因的发酵单胞菌属的纤维寡糖发酵性，也就是具有以纤维寡糖为底物生产乙醇的能力的性状转化微生物。
此外，本发明还提供将来源于β-葡萄糖苷酶生产性菌株的、编码β-葡萄糖苷酶的DNA片段与载体结合而构成的重组DNA。
图1是载体质粒的限制酶酶切位点图。
图2是含有β-葡萄糖苷酶基因的重组质粒的限制酶酶切位点图。
图3是表示利用重组棕榈发酵细菌由纤维二糖发酵生产乙醇的性能的图。
图4是表示利用重组棕榈发酵细菌由纤维二糖批式发酵生产乙醇的性能的图。
以下，对本发明进一步详细说明。
本发明中，将具有β-葡萄糖苷酶生产能力的微生物用作DNA供体，由该供体分离、纯化编码β-葡萄糖苷酶的DNA后，用各种方法切断，制备含有β-葡萄糖苷酶基因的DNA片段。使该含有β-葡萄糖苷酶基因的DNA片段与载体DNA片段，通过例如DNA连接酶等结合，形成含有β-葡萄糖苷酶基因的重组DNA。
对本发明中所用的含有β-葡萄糖苷酶基因的DNA供体微生物无特别的限制，只要具有分解纤维素、部分分解纤维素或纤维寡糖的能力，都可以使用，但特别适用的是属于瘤胃球菌属的微生物，其中优选白色瘤胃球菌。其它的瘤胃球菌属微生物或瘤胃球菌属以外的微生物中，具有β-葡萄糖苷酶产生能力的微生物，以及因启动子部位或核糖体结合部位的异常等而没有β-葡萄糖苷酶产生能力，但在其DNA上编码β-葡萄糖苷酶结构基因的微生物也可以用作含有β-葡萄糖苷酶基因的DNA供体。进一步，通过基因重组等导入了β-葡萄糖苷酶结构基因的性状转化微生物等也可以作为含有β-葡萄糖苷酶基因的DNA供体微生物使用。
含有β-葡萄糖苷酶基因的重组DNA，通过导入作为宿主的属于发酵细菌属的微生物，可以构建具有产生β-葡萄糖苷酶能力的性状转化微生物。导入的重组DNA的全部或一部分可以整合到发酵细菌属的宿主细胞的基因组中，也可以存在于性状转化所用的载体上。
DNA从上述供体微生物的分离、纯化可以用其自身已知的方法进行，例如齐藤·三浦等的方法(Biochem.Biophys.Acta.Vol.72，619-629，1963)及其改进的方法，还可用使用市售的DNA提取试剂盒的方法等进行。以下，对按照齐藤·三浦等的方法进行的方法进一步具体地说明。
首先，将供体微生物接种于含有0.5％甘氨酸的酵母-淀粉培养基(组成酵母提取物0.2％，可溶性淀粉1.0％，pH7.3)等合适的液体培养基中，在4-60℃，优选30℃下，搅拌培养8-48小时，优选搅拌培养过夜。培养结束后，通过固-液分离操作，例如在0-50℃，优选4℃、转速为3000-15000rpm，优选10000rpm的条件下进行离心分离，从而收集菌体。
然后将收集的微生物悬浮于VS缓冲液(0.15M NaCl，0.1M EDTA，pH8.0)中，加入溶菌酶后，在4-45℃，优选37℃，放置0.5-4小时，优选放置1小时，得到原生质体液。在该液体中加入TSS缓冲液(0.1MTris，0.1M NaCl，1％SDS，pH9.0)和5M NaCl，使原生质体溶解。接着，加入TE溶液(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)-饱和酚，使其平稳地充分悬浮。将所得的悬浮液在0-50℃，优选4℃，转速为3000-15000rpm，优选12000rpm下离心分离，得到的上层(水相)悬浮于氯仿中。进一步将其在0-50℃，优选4℃、转速为3000-15000rpm，优选12000rpm下进行离心分离，得到的上层(水相)再次用酚及氯仿进行悬浮处理。
随后，加入冷的乙醇，回收生成的白色混浊的粗染色体DNA，将该DNA溶解于SSC缓冲液(0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠)中，对SSC缓冲液透析过夜。将核糖核酸酶按终浓度为1-50μg/ml，优选10μg/ml的量加入该透析内液中，在4-45℃，优选37℃，放置0.5-16小时，优选放置2小时。再加入终浓度为0.1-10μg/ml，优选1μg/ml的蛋白酶，在4-45℃，优选37℃，放置15分钟-8小时，优选放置30分钟。将其与上述同样地用酚及氯仿处理、对SSC缓冲液透析，得到纯化的供体微生物的染色体DNA液。
用限制酶等分解上述所得的供体微生物的DNA，用蔗糖密度梯度法除去1kbp以下的DNA片段，可以将得到的物质用作供体DNA片段。此时所用的限制酶无特别的限定，可以使用切断DNA的EcoRI等各种酶类。此外，除了上述的酶法以外，也可以用超声波处理或物理剪断力等将DNA切断。在这种情况下，如果用Klenow(クレノ一)片段、DNA聚合酶、绿豆(マンダビ一ン)核酸酶等酶处理供体DNA片段的末端，则后面与载体DNA的结合效率提高，因而优选。还有，对于以供体微生物的DNA或其片段作为模板进行PCR扩增的产物，也可以直接，或进行上述的处理后，作为供体DNA片段使用。
另一方面，作为载体DNA片段，无特别的限定，但可以优选使用革兰氏阴性细菌间的广泛宿主域性质粒来源的pRK290、pMFY40或pMFY31经限制酶酶切处理后的物质等。也可以适当选择使用上述以外的载体，例如，已知的革兰氏阴性细菌的广泛宿主域性质粒。对所用的限制酶，也不限于生成粘末端的酶，可以使用将DNA切断的各种酶类，还可以用与上述切断供体微生物的DNA同样的方法，将载体DNA切断。
在与上述供体DNA片段结合反应之前，可以将所得的载体DNA片段用碱性磷酸酶进行处理。由此提高该片段与供体DNA片段的结合效率。而且，通过PCR扩增制备供体DNA片段的场合，使用在扩增片段的两末端预先给予SalI等限制酶位点的引物，使用由该限制酶切断的DNA片段和用同样的限制酶切断的载体片段，则可以提高结合效率。对于供体DNA片段与载体DNA片段的结合反应，可以用已知的使用DNA连接酶的方法等常规方法进行，例如，将供体DNA片段与载体DNA片段退火后，在生物体外，通过适当的DNA连接酶的作用，可以制成重组DNA。另外，必要时，也可以在退火后导入宿主微生物，利用生物体内的DNA修复能力，形成重组DNA。
作为插入含有供体DNA片段和载体DNA片段的重组DNA的宿主微生物，只要具有乙醇发酵能力而且能使重组DNA稳定地保持，则可以使用任何一种微生物，本发明中，适用的微生物是属于发酵细菌属的微生物，一般可使用棕榈发酵细菌。将重组DNA导入宿主微生物的方法没有特别的限制，棕榈发酵细菌等的场合，适合用电穿孔等利用电刺激的方法导入重组DNA。此外，对于棕榈发酵细菌以外的其他乙醇生产性微生物，例如运动发酵单胞菌及酵母、其他的宿主，也可以用同样的方法导入重组DNA。
作为这样所得的性状转化微生物的生长培养基，例如，在宿主微生物为发酵细菌的场合，经常使用RM培养基等。用发酵细菌以外的枯草杆菌和酵母等作为宿主微生物的场合，可以用与所用的宿主微生物相对应的各种培养基培养，培养温度等培养条件也可以根据宿主微生物的性质适当设定。另外，如果所用的载体DNA片段是编码各种抗生素抗性基因的片段时，通过在培养基中添加适量的相应的抗生素，能够使重组DNA更稳定地保持。还有，如果所用的载体DNA编码宿主微生物营养缺陷性的互补基因，通过使用不含有该营养素的培养基，同样能够使重组DNA的稳定性提高。
根据本发明，用重组DNA的方法，提供能够赋予发酵细菌属的微生物纤维二糖发酵性的重组DNA，以及含有该重组DNA片段的性状转化微生物。通过使用该性状转化微生物，可以以含有纤维二糖的糖液为原料，高效地生产乙醇。
以含有纤维二糖的糖液为原料生产乙醇可按下述方法进行用上述纤维寡糖发酵性性状转化微生物使含纤维二糖的糖化原料发酵，从所得的发酵液回收乙醇。例如，可以使用将上述性状转化微生物固定化的固定化载体，按照其自身已知的乙醇发酵法进行。
上述性状转化微生物在固定化载体上的固定化可按其自身已知的方法进行，例如包埋法、物理吸附法、共价结合法等。
作为载体，中空状、凹凸状、多孔质状等形状的单位体积的表面积大的物质或者吸水后膨胀的物质中，持有流动性、具有不容易从反应系统流出的粒径及比重的物质适用；作为载体的形状，例如板状体、纤维状体、圆筒等特殊形状体，海绵状体，粒、块状体，立方状体等任何一种都可以，其中，优选容易确保流动性和充分的表面积的微小粒状体。作为载体的材料，可以使用以往作为微生物和酶等的载体材料使用的各种有机·无机材料，例如粒状活性炭、破碎活性炭、木炭、沸石、云母、砂粒等无机材料；光硬化性树脂、聚氨基甲酸乙酯、聚乙烯醇、聚乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚丙烯、琼脂、海藻酸、角叉聚糖(カラギ一ナン)、纤维素、葡聚糖、琼脂糖、离子交换树脂等树脂材料；硅胶等多孔质陶瓷；无烟煤；树脂材料中掺入活性炭等的物质等，这些材料可以单独使用或2种以上组合使用。
上述固定化载体通常是充填在生物反应器内使用。发酵所用的生物反应器因其形式不同，有完全混合槽型、充填层型、膜型、流动层型、横型等反应器。如果使用这样的生物反应器，则可以进行连续发酵，不需要进行微生物等的投入、回收步骤，所以优选。
上述乙醇发酵时，可以将微生物的各种营养源按照需要配合在糖液中，例如，作为氮源，可以使用酵母提取物、玉米浆、胨、肉提取物、鲣鱼提取物等。
以下，通过实施例对本发明进一步进行具体地说明，但本发明不只限于这些实施例。
实施例实施例1棕榈发酵细菌的基因导入方法据报道，一般大肠杆菌和假单胞菌等革兰氏阴性细菌中存在具有自主传递性的多种抗药性质粒DNA。已知这些质粒在大肠杆菌和假单胞菌之间进行转移。已有过将这些广泛宿主域性的多种抗药性质粒、以及残留与这些广泛宿主域性的多种抗药性质粒的传递性和自主复制有关的基因区域的质粒作为广泛宿主域性的载体质粒进行利用的例子(BIO/TECHNOLOGY，November，784-791，1983)。至目前为止，有关棕榈发酵细菌的载体质粒及其基因导入方法尚未开发。因此，从革兰氏阴性细菌间的广泛宿主域性质粒中，选择含有Tc抗性标记的pRK290以及pMFY40以及含有Cm抗性标记的pMFY31这3种作为将基因导入棕榈发酵细菌的载体质粒(Agric.Biol.Chem.，Vol.49(9)，2719-2724，1985)(图1)。由于将基因导入棕榈发酵细菌的方法是未知的，所以采用一般的基因导入法中的电穿孔法。
将棕榈发酵细菌(ATCC 51623)用RM培养基(2.0％葡萄糖，1.0％Bacto-酵母提取物，0.2％KH2PO4，pH6.0)静置培养过夜，取5ml该预培养液接种于50ml的T培养基(2.0％葡萄糖，1.0％Bacto-酵母提取物，1.0％KH2PO4，0.2％(NH4)2SO4，0.05％MgSO4·7H2O，pH6.0)，30℃下培养90分钟。将培养液在4℃、300rpm下离心分离10分钟，收集菌体，加入20ml冷却的10％甘油，悬浮、洗净。在4℃、3000rpm下再离心10分钟，制成感受态细胞(コンピテントセル)。将200μl感受态细胞和10μl载体质粒DNA溶液在冰上混合后，转移至电穿孔装置附带的样品池中，在电压为200V，电容(キャピタンシ一)为250μFD，电阻为200Ω的条件下，施加电脉冲。将1mlT培养基立即加入样品池中，30℃下静置培养1小时后，在选择培养基上形成菌落，该选择培养基中添加了与所使用的广泛宿主域性质粒载体的抗药性基因的表达相对应的抗生素。采用上述开发的基因导入方法，棕榈发酵细菌的质粒pMFY40的性状转化效率约为1×106/μgDNA(表1)。
表1棕榈发酵细菌的性状转化效率使用的质粒 性状转化效率(个/μg)pRK2907.45×103pMFY401.01×106pMFY319.21×105实施例2含有β-葡萄糖苷酶基因的重组质粒的制备以由白色瘤胃球菌菌体制备的基因组DNA为模板，通过PCR扩增该菌来源的β-葡萄糖苷酶基因，将此扩增的DNA片段插入载体质粒中，制备重组质粒。作为PCR中使用的β-葡萄糖苷酶基因扩增用的引物，使用根据已知的该基因的碱基序列(Nucleic Acids Res。Vol.18，671，1990)设计的以下2种引物，该2种引物也含有位于β-葡萄糖苷酶基因上游区域的启动子区，其两末端赋予作为限制酶切断部位的SalI位点BGN引物5′-GCGGTCGACATCAAGGTGTGATGTTGATTATACC-3′BGC引物5′-CGCGTCGACTCATGTTTGACAGCTTATCATCGAT-3′用限制酶SalI切断PCR所得含有启动子和β-葡萄糖苷酶基因的约3.2kpb的DNA片段，另一方面，用SalI切断载体质粒pMFY31后，与经碱性磷酸酶处理的DNA片段混合，利用连接酶使其连接。取10μl含有该重组质粒的连接酶反应溶液与200μl实施例1所述的棕榈发酵细菌感受态细胞混合，用电穿孔法进行性状转化。性状转化株选择在添加了用作药剂的100μg/ml氨苄青霉素和20μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷(X-glc)的T平板培养基上蓝色的菌落。所得的性状转化株保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，其保藏号为FERM P-19450(其在平成16年6月30日根据布达佩斯条约移交给国际保藏，保藏号为FERM BP-10047)。另外，插入β-葡萄糖苷酶基因的重组质粒称为pMF31-βg(图2)。
实施例3重组棕榈发酵细菌株的纤维寡糖发酵性对实施例2中制备的重组棕榈发酵细菌株内的β-葡萄糖苷酶表达及细胞内定域性进行研究。
棕榈发酵细菌/pMFY31-βg株、棕榈发酵细菌/pMFY31株和大肠杆菌JM109/pMFY31-βg株分别培养后，由回收的菌体进行细胞分级(Science，Vol.156(781)，1451-1455，1967)，测定下列各细胞级分的β-葡萄糖苷酶活性相当于细胞外级分的培养液上清液、相当于细胞表层级分的菌体诜净液、高渗液的洗液、相当于胞质级分的渗透压冲击(shock)液、细胞膜级分、细胞质内级分(J.Bacteriol.，Vol.161(1)，432-434，1985)。
棕榈发酵细菌/pMFY31-βg株的β-葡萄糖苷酶活性与大肠杆菌JM109/pMFY31-βg株的程度相同。而且，对于表达的β-葡萄糖苷酶，棕榈发酵细菌/pMFY31-βg中，活性定域在洗菌液中为29.5％、渗透压冲击液中为17.1％、无细胞提取液中为29.5％，表现出比大肠杆菌高的分泌性(表2)。也就是说，在表达的全部活性中，约50％透过细胞膜分泌。
将重组菌棕榈发酵细菌/pMFY31-βg株接种于以2％葡萄糖、2％纤维二糖以及2％葡萄糖+纤维二糖为碳源的培养基中，测定菌体生长及乙醇生成量的时间进程。对于以纤维二糖为唯一碳源的培养基，其生长速度比葡萄糖培养基的低，但在培养的第10天，消耗了2％的纤维二糖，产生理论收率的乙醇(图3)。
表2β-葡萄糖苷酶在棕榈发酵细菌内的表达和细胞定域性棕榈发酵细菌T109 棕榈发酵细菌T109 大肠杆菌JM109(pMFY31)(pMFY31-βg) (pMFY31-βg)细胞级分活性 定域性 活性 定域性活性 定域性(U/ml)(％) (U/ml) (％) (U/ml) (％)培养液上清 ＜0.01-0.07 6.7 0.01 1.3菌体洗净液 ＜0.01-0.31 29.5 0.06 7.6高渗洗净液 ＜0.01-0.05 4.8 0.01 1.3渗透压冲击 ＜0.01-0.18 17.1 0.02 2.5细胞质级分 ＜0.01-0.31 29.5 0.59 74.7膜级分 ＜0.01-0.13 12.4 0.10 12.7总活性1.05 0.791单位1分钟内，由1μmol对硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷游离出对硝基苯酚所需的酶量实施例4将重组菌棕榈发酵细菌FERM P-19450(FERM BP-10047)接种于以来源于生物质部分糖化液的纤维二糖为唯一碳源的CB培养基(2.0％纤维二糖，1.0％酵母提取物，1.0％ KH2PO4，0.2％(NH4)2SO4，0.05％MgSO4·7H2O，pH6.0)，静置培养5天，作为预培养液。正式培养用上述的CB培养基，将预培养液按10％的比例接种于正式培养用的CB培养基中，30℃下缓慢搅拌进行培养。测定菌体生长程度、纤维二糖浓度及乙醇浓度的时间进程，经过7天的培养，大体上将纤维二糖消耗完，产生理论收率的乙醇(图4)。
实施例5在废木材的硫酸糖化制备的糖液(10％葡萄糖，1％纤维二糖)中，分别按下述终浓度添加下述物质酵母提取物1.0％，KH2PO41.0％，(NH4)2SO40.2％，MgSO4·7H2O 0.05％，用pH调整至6.0的培养基进行连续发酵。重组棕榈发酵细菌FERM P-19450(FERM BP-10047)用光硬化性树脂ENTG-3800(关西ペイント公司生产)包埋固定化。连续发酵中使用通风管型生物反应器(流动层型)，将固定化载体按20％的充填率投入反应器后，由反应器的下部连续注入上述培养基。而且，一旦捕集到通过发酵而生成的二氧化碳后，从反应器的下部再次供给，从而形成流动床。在30℃、稀释率D＝0.1h-1下进行连续发酵时，能够以99％以上的糖消耗率以及95％以上的乙醇收率，稳定进行连续发酵1个月以上。
实施例6将来源于旧纸的纤维素用纤维素酶进行酶糖化，在制备的糖液(8％葡萄糖，2％纤维二糖)中，分别按下述终浓度添加下述物质酵母提取物1.0％，KH2PO41.0％，(NH4)2SO40.2％，MgSO4·7H2O 0.05％，用pH调整至6.0的培养基进行连续发酵。将中空圆筒型(2mm×3mm)聚丙烯制成的载体投入菌体悬浮液中，使重组棕榈发酵细菌FERM P-19450(FERM BP-10047)进行吸附固定化。连续发酵中使用固定床生物反应器(充填层型)，将固定化载体按80％的充填率投入反应器后，从反应器的下部连续供给上述培养基。在30℃、稀释率D＝0.2h-1下进行连续发酵时，能够以99％以上的糖消耗率以及95％以上的乙醇收率，稳定进行连续发酵1个月以上。
权利要求
1.一种发酵细菌属的纤维寡糖发酵性性状转化微生物，其导入β-葡萄糖苷酶外源基因。
2.一种重组DNA，将来源于β-葡萄糖苷酶生产性菌株的编码β-葡萄糖苷酶的DNA片段与载体结合而成。
3.根据权利要求2所述的重组DNA，其中β-葡萄糖苷酶生产性菌株为属于瘤胃球菌属的微生物。
4.根据权利要求1所述的性状转化微生物，其中导入权利要求2或3所述的重组DNA。
5.根据权利要求4所述的性状转化微生物，其中导入的重组DNA的全部或一部分整合在发酵细菌属宿主细胞的基因组中。
6.根据权利要求4所述的性状转化微生物，其中导入的重组DNA的全部或一部分存在于载体中。
7.一种乙醇的生产方法，其特征在于，用权利要求1所述的纤维寡糖发酵性性状转化微生物使含有纤维二糖的糖化原料发酵，从所得的发酵液回收乙醇。
8.一种固定化载体，将权利要求1所述的纤维寡糖发酵性性状转化微生物固定化。
9.一种生物反应器，配备权利要求8所述的固定化载体。
10.一种乙醇的生产方法，其特征在于，使用权利要求8所述的固定化载体，使含有纤维二糖的糖化原料连续发酵。
全文摘要
本发明提供一种性状转化微生物，其针对不能利用纤维寡糖的发酵细菌属的微生物，用重组DNA的方法，将β－葡萄糖苷酶基因导入，从而能够由纤维寡糖生产乙醇。
文档编号C12P7/10GK1580245SQ20041005567
公开日2005年2月16日 申请日期2004年8月2日 优先权日2003年7月31日
发明者梁濑英司, 冈本贤治, 高寺贵秀, 杉浦敦子 申请人:关西涂料株式会社