一种用于诱导生产纤维素酶的糖混合液的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于诱导生产纤维素酶的糖混合液的制备方法及应用，属于微生 物发酵技术领域。
【背景技术】
[0002] 纤维素和半纤维素是世界上最丰富的可再生能源，利用纤维素酶和半纤维素酶可 W将其水解为葡萄糖和木糖，通过生物法或者化学法进一步转化为己醇、下醇、木糖醇和慷 酵等生物能源和生物基化学品，对于解决未来能源危机，维持社会的可持续发展具有重要 意义。
[0003] 丝状真菌和分解纤维素的细菌能生成胞外纤维素酶，该赋予该生物水解纤维素 目-1,4糖巧键从而生成纤维寡糖或者葡萄糖的能力，该些酶给生物提供了利用纤维素来生 长的能力。
[0004] 里氏木霉如沁乃猫reesei)是目前发现的最有效的纤维素酶生产菌之一，而 且已经开发了里氏木霉纤维素酶的产品，该些产品广泛应用于生物能源、洗涂剂和布料等 领域。此外，还已经开发了里氏木霉生产异源蛋白的能力。可操作的连接到里氏木霉可诱 导的启动子后，编码目标蛋白的基因可W被调节。其中，启动子是迄今为止发现 的在里氏木霉中表达能力最强的启动子，但是CM2启动子为诱导型启动子，使用何种诱导 物是能否实现基因大量表达的关键。而且里氏木霉中主要的分泌型纤维素酶基因均为诱导 型，比如<；?/7备人<；?化^、媒人6妨、6树、乂7/7人^：网巧[]姑如等，其表达和生成均由诱导物所决 定，已经发现槐糖是其最强有力的液体诱导物，其诱导能力是纤维二糖的2500倍，是乳糖 的233倍，并且诱导能力高于纤维素（J. Bacteriol. 1962，83，400-408)。而葡萄糖是 该些纤维素酶基因表达的抑制物，但是有些里氏木霉突变体，比如Rut-C30已经部分解除 葡萄糖抑制，同时发现里氏木霉中CRE1蛋白为使葡萄糖抑制的主要蛋白，将其敲除或者突 变，有助于在葡萄糖培养基中使纤维素酶和半纤维素酶基因表达。
[0005] 纤维素酶的商业化生产最大的问题是给木霉提供合适的诱导物。目前普遍采用纤 维素类物质或者乳糖分批补料发酵来生产纤维素酶。但是利用该两种诱导物来生产纤维素 酶均有一定的缺陷，利用纤维素类物质生产纤维素酶，会使液体培养基中固体物质含量过 高，导致发酵罐难于控制，过大的发酵罐转速消耗能源，同时固体物质不易于流加培养，并 且该些物质通常需要一定的预处理之后才能使用；而乳糖在一些国家和地区价格昂贵，不 适用于大规模生产，该些因素导致纤维素酶生产成本过高。
[0006] 有研究者证实（Agric. Biol. Chem.，1987，51 巧)，2255-2化6)，甜菊糖巧利 用一定浓度的盐酸在一定温度下，赔育一定时间后，分离纯化，利用活性炭层析可W制备纯 度较高的槐糖，而槐糖是纤维素酶的最强力诱导物。但是该个步骤中槐糖的分离和纯化即 耗时耗力，又增加了生产成本。另外，水解液中的葡萄糖没有得到利用，所W本工作直接利 用葡萄糖和槐糖混合液进行诱导纤维素酶基因表达，葡萄糖可W作为微生物生长的碳源， 而槐糖可W作为诱导物，该种方法避免了纯化槐糖的成本，简化了诱导物的生产过程，具备 创新性。
[0007] 通过使用可溶性底物和诱导物巧日乳糖和槐糖)，可W克服与使用纤维素作为诱导 物相伴随的一系列问题。槐糖是比纤维素更有效的诱导物，但是槐糖价格昂贵难W生产。因 此，在比固体纤维素更容易控制和处理的同时，槐糖仍然使生产纤维素酶的成本昂贵而难 W接受，因此用W工业化生产纤维素酶是不切实际的。显然，仍然需要方便的可溶性底物、 并且低廉的在丝状真菌巧日里氏木霉）中诱导纤维素酶的方法。另外，用廉价的诱导剂来调 节可诱导的启动子表达内源基因或外源基因的能力具有巨大的商业价值。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了一种用于诱导生产纤维素酶的糖混合液的制备及应用，W解决在纤 维素酶生产或者外源蛋白生产过程中利用高浓度纤维素导致的发酵难控制、能耗过大问题 等导致的成本过高问题。通过廉价的混合糖可溶性诱导物，高水平的生产纤维素酶或者来 自不同异源构建体的蛋白。
[0009] 本发明的技术方案是：一种用于诱导生产纤维素酶的糖混合液的制备方法包括下 述步骤： (1) 将含糖巧类物质配成浓度为5%-20% (重量/重量）水溶液，再加入无机酸或 者有机酸，使混合物的酸浓度为0.01 mol/1-l mol/L;所述含糖巧类物质为甜菊糖巧 (Stevioside)、莱鲍迪巧 A (Rebaudioside A)、莱鲍迪巧 B (Rebaudioside B)或者莱鲍迪 巧C (Rebaudioside C)或其混合物；所述无机酸为盐酸、硫酸、次氯酸、硝酸或磯酸，所述有 机酸为甲酸、己酸、丙酸、马来酸、苹果酸或巧樣酸； (2) 在25-25(TC下赔育1 min-100 h，冷却，过滤后液体为含有槐糖和葡萄糖的糖混合 液，其中酸浓度越高，可使用的反应温度越低，当反应温度达到22CTC W上时，不加入任何酸 来水解甜菊糖。
[0010] 一种用于诱导生产纤维素酶的糖混合液的应用包括W下步骤： (1) 斜面培养；包含可诱导启动子的野生型细胞或包含纤维素酶启动子的构建体在3% 麦芽浸粉固体培养基中在28 C下培养7 d，用无菌水洗下抱子，放于4 C下备用； (2) 种子培养；将洗下的抱子，接种于10 g ri玉米浆，5 g 1^1葡萄糖培养基中，28 C 下培养1山作为种子液； (3) 发酵培养：将种子液W 10%的体积比接种于发酵培养基中，在250 ml H角瓶中装 入50 ml发酵培养基，在28°C、150 r/min条件下发酵培养7 d; 所述发酵培养基配方为：糖混合液10-15 g ri，蛋白腺1 g r\尿素0.3 g r\ (NH4)2S〇4l.4 g 1-1，KH2PO42 g 1-1，M拆〇4*7&0 0. 3 g 1-1，CaCls 0. 4 g 1-1，FeS(V7H2〇 5 mg 1-1，MnS〇4.H2〇 1.7 mg 1-1，ZnS(V7H2〇1.4 mg 1-1，C0CI22 mg 1-1，吐温80 0. 2 ml 1-1，500 ml 1-1 0.2 M pH 5.0 化2册〇4-巧樣酸缓冲液。
[0011] 另一种用于诱导生产纤维素酶的糖混合液的应用包括W下步骤： (1) 斜面培养；包含可诱导启动子的野生型细胞或包含纤维素酶启动子的构建体在3% 麦芽浸粉固体培养基中在28 C下培养7 d，用无菌水洗下抱子，放于4 C下备用； (2) 种子培养；将洗下的抱子，接种于10 g ri玉米浆，5 g 1^1葡萄糖培养基中，28 C 下培养1山作为种子液； (3)发酵培养：按10%接种量接种至装液量为3 L发酵培养基的7.5 L发酵罐中，在发 酵的前48 h为菌体生长主要阶段，控制发酵温度为28C，抑利用氨水控制为不低于4,待发 酵罐内糖消耗完后开始补料，所述补料物质为糖混合物，保证发酵罐中糖浓度为1 g ri-2 g rs其中发酵罐转速W达到发酵液混合均匀为指标，溶氧通过控制氧气和空气进气比例 为 20〇/〇 ; 所述发酵培养基配方为：糖混合液10-15 g ri，蛋白腺1 g r\尿素0.3 g r\ (NH4)2S〇4l.4 g 1-1，KH2PO42 g 1-1，M拆〇4*7&0 0. 3 g 1-1，CaCls 0. 4 g 1-1，FeS(V7H2〇 5 mg 厂1，MnSCV&O 1.7 mg 厂1，ZnS(V7H2〇1.4 mg 厂1，C0CI22 mg 厂1，吐温80 0. 2 ml 1-1，500 ml 1-1 0.2 M pH 5.0 化2册〇4-巧樣酸缓冲液。
[0012] 所述包含可诱导启动子的野生型细胞为包含槐糖可诱导启动子和葡萄糖可诱导 启动子的里氏木霉；所述包含纤维素酶启动子的构建体为包含里氏木霉的CM2启动子的 细菌，所述细菌为链霉菌属、热单胞菌属、芽抱杆菌属或纤维