单胞菌属。
[0013] 现在已经发现，利用酸溶液水解甜菊糖巧，在一定温度下赔育一定时间后，会生产 含量可观的纤维素酶基因表达的诱导物的糖混合物。该糖混合物含有约1-30 g ri的槐 糖，和20-70 g ri的葡萄糖。一个吸引人的优势是，该混合物无须纯化等复杂的步骤，只需 调整抑后（是否浓缩可选）即可诱导纤维素酶的生成。该发现提供了在工业上需要的乳糖 或纯化槐糖的低廉的替代品，和比用于在丝状真菌中生产由可诱导的启动子调控的蛋白的 固体纤维素更方便的替代品。更具体的观点是，本发明的糖混合物可用于木霉属的纤维素 酶生产。
[0014] 制备糖混合物的技术方案是甜菊糖巧在酸作用下水解1 min-100 h，过滤掉固体 物质异甜菊醇后用于基因表达。其中甜菊糖巧浓度为5%-20%，酸浓度为0.1 mol ri-1 mol 1一1，温度为常温到250 °C，赔育时间为Imin到10化，酸种类为常见的无机酸或者有机酸，包 括但不限于盐酸、硫酸或者巧樣酸。
[0015] 本发明所述的发酵生产蛋白质的方法是利用糖混合物作为碳源，采用分批发酵、 分批补料发酵或者连续发酵诱导基因表达，生产蛋白质。所述糖混合物作为碳源的初始浓 度为0.1 g ri-50 g 14,其中优选为5 g ri-20 g厂1。若采用分批补料发酵方式，可控制 发酵液中糖浓度为0.01 g ri-5 g ri，其中优选方案为糖浓度越低越好。或者不采用控制 糖浓度的分批补料方式，但是仍W糖混合物作为碳源进行补料的发酵方式。
[0016] 所述菌株为丝状真菌或者可降解纤维素的细菌，其中优选的菌株为里氏木霉。
[0017] 其中，初始培养基成份与补料培养基成份可W相同或不同，如可根据本领域的公 知常识，选择培养基的组分。如加入适当的款皮、吐温80或者纤维素类物质共同诱导基因 表达。
[0018] 本发明的有益效果是；该方法利用含糖巧类物质与酸溶液反应得到糖混合物，W 该糖混合物作为里氏木霉的诱导物，发酵生产纤维素酶。解决了在纤维素酶生产或者外源 蛋白生产过程中利用高浓度纤维素或其他固体不溶诱导物导致的发酵难控制、能耗过大问 题等导致的成本过高问题。通过廉价的混合糖可溶性诱导物，高水平的生产纤维素酶或者 来自不同异源构建体的蛋白。
【附图说明】
[0019] 图1糖混合诱导物中槐糖的离子色谱检测结果。
[0020] 图2糖诱导物与其它常用诱导物诱导里氏木霉产纤维素酶能力对比。
[0021] 图3糖诱导物对摇瓶培养的里氏木霉纤维素酶的诱导。
[0022] 图4糖诱导物对发酵罐培养的里氏木霉纤维素酶的诱导。
【具体实施方式】
[0023] 下面的实施例用于解释而不是限制要求保护的发明。
[0024] 实施例1 本实施例解释了如何制备用于诱导里氏木霉表达纤维素酶基因的诱导性糖混合物。表 1为不同底物和不同酸浓度条件下处理温度和处理时间的不同条件。
[00巧]表1为可溶诱导物制备条件。
【主权项】
1. 一种用于诱导生产纤维素酶的糖混合液的制备方法，其特征在于：包括下述步骤： (1) 将含糖苷类物质配成浓度为5%-20% (重量/重量）水溶液，再加入无机酸或者 有机酸，使混合物的酸浓度为0.01 mol F1-I mol Γ1;所述含糖苷类物质为甜菊糖苷 (Stevioside)、莱鲍迪苷 A (Rebaudioside A)、莱鲍迪苷 B (Rebaudioside B)或者莱鲍迪 苷C (Rebaudioside C)或其混合物；所述无机酸为盐酸、硫酸、次氯酸、硝酸或磷酸，所述有 机酸为甲酸、乙酸、丙酸、马来酸、苹果酸或柠檬酸； (2) 在25-250°C下孵育I min-100 h，冷却，过滤后液体为含有槐糖和葡萄糖的糖混合 液，其中酸浓度越高，可使用的反应温度越低，当反应温度达到220°C以上时，可不加入任何 酸来水解甜菊糖。
2. 根据权利要求1所述的一种用于诱导生产纤维素酶的糖混合液的应用，其特征在 于，包括以下步骤： (1) 斜面培养：包含可诱导启动子的野生型细胞或包含纤维素酶启动子的构建体在3% 麦芽浸粉固体培养基中在28 °C下培养7 d，用无菌水洗下孢子，放于4 °C下备用； (2) 种子培养：将洗下的孢子，接种于10 g Γ1玉米浆，5 g厂1葡萄糖培养基中，28 °C 下培养I d，作为种子液； (3) 发酵培养：将种子液以10%的体积比接种于发酵培养基中，在250 ml三角瓶中装 入50 mL发酵培养基，在28°C、150 r/min条件下发酵7 d; 所述发酵培养基配方为：糖混合液10-15 g Γ1，蛋白胨I g Γ1，尿素0.3 g Γ1， (NH4)2SO4 I. 4 g Γ1，KH2PO4 2 g Γ1，MgS04.7H20 0.3 g Γ1，CaCl2 0.4 g Γ1，FeS04.7H20 5 mg Γ1，MnS04*H20 1.7 mg Γ1，ZnS04.7H201.4 mg Γ1，CoC122 mg Γ1，吐温80 0.2 ml Γ1，500 ml Γ1 0.2 M pH 5.0 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液。
3. 根据权利要求1所述的一种用于诱导生产纤维素酶的糖混合液的应用，其特征在 于，包括以下步骤： (1) 斜面培养：包含可诱导启动子的野生型细胞或包含纤维素酶启动子的构建体在3% 麦芽浸粉固体培养基中在28 °C下培养7 d，用无菌水洗下孢子，放于4 °C下备用； (2) 种子培养：将洗下的孢子，接种于10 g Γ1玉米浆，5 g厂1葡萄糖培养基中，28 °C 下培养I d，作为种子液； (3) 发酵培养：按10%接种量接种至装液量为3 L发酵培养基的7.5 L发酵罐中，在发 酵的前48 h为菌体生长主要阶段，控制发酵温度为28 °C，pH利用氨水控制不低于4,待发 酵罐内糖消耗完后开始补料，所述补料物质为糖混合物，保证发酵罐中糖浓度为I g户_2 g Γ1，其中发酵罐转速以达到发酵液混合均匀为目的，溶氧通过氧气和空气进气比例控制 为 20% ; 所述发酵培养基配方为：糖混合液10-15 g Γ1，蛋白胨I g Γ1，尿素0.3 g Γ1， (NH4)2SO4 I. 4 g Γ1，KH2PO4 2 g Γ1，MgS04.7H20 0.3 g Γ1，CaCl2 0.4 g Γ1，FeS04.7H20 5 mg Γ1，MnS04*H20 1.7 mg Γ1，ZnS04.7H201.4 mg Γ1，CoC122 mg Γ1，吐温80 0.2 ml Γ1，500 ml Γ1 0.2 M pH 5.0 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液。
4. 根据权利要求2或3所述的一种用于诱导生产纤维素酶的糖混合液的应用，其特征 在于：所述包含可诱导启动子的野生型细胞为包含槐糖可诱导启动子和葡萄糖可诱导启动 子的里氏木霉；所述包含纤维素酶启动子的构建体为包含里氏木霉的启动子的细菌， 所述细菌为链霉菌属、热单胞菌属、芽孢杆菌属或纤维单胞菌属。
【专利摘要】本发明涉及一种用于诱导生产纤维素酶的糖混合液的制备方法及应用，属于微生物发酵技术领域。该方法利用含糖苷类物质与酸溶液反应得到糖混合物，并以该糖混合物作为里氏木霉的诱导物，发酵生产纤维素酶。利用该可溶性诱导物解决了在纤维素酶生产过程中利用高浓度不溶的纤维素而产生的发酵难控制、能耗过大、生产成本过高的问题。通过廉价的混合糖可溶性诱导物，高水平诱导生产纤维素酶。
【IPC分类】C12R1-465, C12R1-07, C12R1-01, C12N9-42
【公开号】CN104630186
【申请号】CN201510065650
【发明人】李勇昊, 赵心清, 白凤武
【申请人】大连理工大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月7日