对纤维素底物特异性提高的突变双功能木聚糖酶/纤维素酶及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体设及对纤维素底物特异性提高的突变双功能木聚 糖酶/纤维素酶及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 植物细胞壁多糖主要包括纤维素和半纤维素，它的来源丰富、可再生，是生产可再 生生物燃料的理想原料。将植物细胞壁多糖完全降解为可发酵的简单单糖需要包括纤维素 酶和半纤维素酶在内的一系列酶的协同作用。革兰氏阳性菌化Idicellulosiruptor属成 员的基因组编码了多个嗜热的、高活性的降解植物细胞壁多糖的糖巧水解酶，在降解植物 细胞壁多糖上具有重要的应用价值。
[0003] 在化Idicellulosiruptor 属化Idicellulosiruptorbescii 种细菌的基因组中， 存在一个基因簇编码=个多结构域糖巧水解酶。该=个蛋白拥有几乎相同的C端序列，包 括两个串联的CBM3b和一个极C端的GH48外切葡聚糖酶。S个蛋白的区别主要在于N端： CbCel9A/Cel48A的N端为一个G册家族蛋白，CbXynlOC/Cel48B的N端为一个細10家族蛋 白，而CbXgl74A/Cel48C的N端为一个細74家族蛋白。
[0004] 许多已发现的木聚糖酶均属于CA巧家族（Carbohy化ate-Active Enzymes, http: //www. cazy. orfi)的第10和11家族（即細10和細11)。細11家族的酶具 有严格的底物特异性，只能水解木聚糖；而与之相反的是，GH10家族的酶则具有较宽泛的 底物特异性，有的GH10木聚糖酶除能水解木聚糖外，还能水解番茄碱、大麦木聚糖或人工 纤维素底物如对硝基酪-0-纤维二糖（pNPC)或駿甲基纤维素钢（CMC)。
[000引 Caldicellulosiruptorbescii 菌的 CbXynlOC/Cel48B 的 N 端細10 蛋白 (CbXynlOC)既能降解具有0-1，4-木糖巧键的木聚糖，又能降解含有0-1，4-葡萄糖巧键 的大麦葡聚糖（还含有0-1，3-葡萄糖巧键）和微晶纤维素，因此为一种双功能酶。因为 可W同时降解植物细胞壁多糖最重要的两个成分纤维素和木聚糖，因此双功能木聚糖酶/ 纤维素酶在工业上有重要的应用价值。但和其具有的木聚糖酶活性相比，CbXynlOC的纤维 素酶活性相对较低。因此，需要对该酶进行分子工程改造，使其获得更好的针对纤维素的降 解能力。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供对纤维素底物特异性提高的双功能木聚糖酶/纤维素酶突 变体。
[0007] 本发明的再一目的是提供上述对纤维素底物特异性提高的突变双功能木聚糖酶/ 纤维素酶的编码基因。
[000引本发明的再一目的是提供包含上述对纤维素底物特异性提高的突变双功能木聚 糖酶/纤维素酶的编码基因的重组质粒。
[0009] 本发明的再一目的是提供包含上述对纤维素底物特异性提高的突变双功能木聚 糖酶/纤维素酶的编码基因重组菌株。
[0010] 本发明的再一目的是提供一种生产上述对纤维素底物特异性提高的突变双功能 木聚糖酶/纤维素酶的方法。
[0011] 本发明的再一目的是提供获得所述双功能木聚糖酶/纤维素酶突变体的方法，是 通过设计引物对编码双功能木聚糖酶/纤维素酶的基因野生型（SEQ ID NO. 2)进行定点突 变后在大肠杆菌中表达制备而得。
[0012] 根据本发明，所述突变体是在氨基酸序列SEQ ID NO. 1所示的双功能木聚糖酶/ 纤维素酶CbXynlOC野生型的基础上进行突变，将第94位的谷氨酷胺（曲和第306位的亮 氨酸（L)同时点突变为丙氨酸（A)。
[0013] 所述构建方法为，设计突变引物，W编码双功能木聚糖酶/纤维素酶的基因野生 型的质粒祀T46-cbXynlOC为模板依次进行两次PCR扩增。纯化得到含有突变密码子的质 粒，并将其转化进大肠杆菌感受态细胞化21 〇)E3)进行表达，得到重组突变体蛋白。
[0014] 所述的祀T46-cbXynlOC 的构建方法为，W 化Idicellulosiruptor bescii 的基因 组DM为模板，W引物CbXyn 10C-F和CbXyn 10C-R对cbXyn 10C基因进行扩增。电泳纯化 PCR产物中的目的条带并按照祀T-46化/LIC试剂盒说明书将cbXynlOC基因克隆至祀T-46 得到祀T46-cbXynlOC重组质粒。
[0015] 所述构建祀T46-cbXynlOC的引物是；
[0016] 饥XynlOC-F ;5'-GACGACGACAAGATGCCTGACTGGAACATTCCAAGTTTATATG-3'（SEQ NO. 3)
[0017] CbXynlOC-R ;5'-GAGGAGAAGCCCGGTTATGATGTCCCTGATGCTTCTATTACTGC-3'（SEQ NO. 4)
[0018] 所设计的用于定点突变的引物为：
[0019] Q94A-F ;5'-CTTTAGTGTGGCACAGCGCGACGCCTGATTGG-3'（沈Q NO. 5)
[0020] Q94A-R ;5'-CCAATCAGGCGTCGCGCTGTGCCACACTAAAG-3'（沈Q NO. 6)
[002U L306A-F ;5'-CCACAGGACGCACTTCAGAAGCAAGC-3'（SEQ NO. 7)
[0022] L306A-R ;5' -TTCTGAAGTGCGTCCTGTGGGGGTG-3'(沈Q NO. 8)
[0023] 将含有突变双功能木聚糖酶/纤维素酶基因的重组菌活化培养后接种到含有 100 y g/ml氨节青霉素的LB培养基进行预培养，于37°C，250rpm培养6小时；再将预培养 细菌转接至含有100 y g/ml氨节青霉素的LB培养基中，仍于37°C，250巧m培养至菌体ODe。。 =0. 3,加入IPTG进行诱导，同时将温度调整为25°C，继续培养16h。
[0024] 所述活化培养是将在甘油中于低温保存的含编码双功能木聚糖酶/纤维素酶突 变体的祀T46-cbXynlOC的化21 〇)E3)划线至含有100 y g/ml氨节青霉素的LB平板上，培 养温度37 °C，静置过夜培养。
[0025] 所述活化培养基组成；酵母粉5g^，膜蛋白腺lOg/1，化C1 5g/l，琼脂粉15g/l， 抑7. 0 ;所述预培养和诱导所用的LB培养基为酵母粉5g^，膜蛋白腺lOg/1，化Cl 5g/l， pH7. 0〇
[0026] 本发明通过定点突变获得一个对纤维素底物特异性提高的双功能木聚糖酶/纤 维素酶突变体。该突变体对纤维素底物的选择特异性，均较野生型有显著提高。W (对纤 维素底物CMC的ktat/Km) / (对木聚糖底物的ktw/Km)作为底物选择性参数，Q94A/L306A突变 体较野生型提高了 2. 76倍；Q94A/L306A降解滤纸的能力较野生型提高了 1. 15倍。
【具体实施方式】 [0027] 实施例1 [002引一、克隆
[0029] W 化Idicellulosiruptor bescii 的基因组 DNA 为模板，W引物 CbXynlOC-F保-GACGACGACAAGATGCCTGACTGGAACATTCCAAGTTTATATG - 3'）和 CbXynlOC-R
[0030] 保-GAGGAGAAGCCCGGTTATGATGTCCCTGATGCTTCTATTACTGC - 3'）对 cbXynlOC 基因 进行扩增。PCR体系为：
[0031]
[0032]
【主权项】
1. 对纤维素底物特异性提高的突变双功能木聚糖酶/纤维素酶CbXynlOC，其特征在 于，所述突变体是将氨基酸序列SEQ ID NO. 1所示的双功能木聚糖酶/纤维素酶CbXynlOC 的第94位的谷氨酰胺（Q)和第306位的亮氨酸（L)同时点突变为丙氨酸（A)。
2. 对纤维素底物特异性提高的突变双功能木聚糖酶/纤维素酶CbXynlOC编码基因，其 特征在于，所述基因编码权利要求1所述的对纤维素底物特异性提高的突变双功能木聚糖 酶/纤维素酶CbXynlOC。
3. 包含权利要求2所述对纤维素底物特异性提高的突变双功能木聚糖酶/纤维素酶 CbXynlOC编码基因的重组质粒。
4. 包含权利要求2所述对纤维素底物特异性提高的突变双功能木聚糖酶/纤维素酶 CbXynlOC编码基因的重组菌株。
5. 制备权利要求1所述对纤维素底物特异性提高的突变双功能木聚糖酶/纤维素酶 CbXynlOC的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1)使用以下引物对对核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的序列进行PCR扩增， 引物对：Q94A Q94A-F :5'-CTTTAGTGTGGCACAGCGCGACGCCTGATTGG-3' Q94A-R :5'-CCAATCAGGCGTCGCGCTGTGCCACACTAAAG-3' ⑵以编码Q94A突变质粒的双功能木聚糖酶/纤维素酶CbXynlOC基因作模板，用引物 对L306A进行PCR扩增： L306A-F :5'-CCACAGGACGCACTTCAGAAGCAAGC-3' L306A-R :5'-TTCTGAAGTGCGTCCTGTGGGGGTG-3' ； (3)表达步骤（2)获得PCR产物，获得权利要求1所述对纤维素底物特异性提高的突变 双功能木聚糖酶/纤维素酶CbXynlOC。
6. 权利要求1所述的对纤维素底物特异性提高的突变双功能木聚糖酶/纤维素酶 CbXynlOC的应用。
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体涉及对纤维素底物特异性提高的突变双功能木聚糖酶/纤维素酶及其编码基因和应用。所述突变体是在氨基酸序列SEQ ID NO.1所示的双功能木聚糖酶/纤维素酶CbXyn10C野生型的基础上进行突变，将第94位的谷氨酰胺(Q)和第306位的亮氨酸(L)同时点突变为丙氨酸(A)。该突变体对纤维素底物的选择特异性和对纤维素底物的特异酶活均较野生型有显著提高。
【IPC分类】C12N15-70, C12R1-19, C12N9-42, C12N1-21, C12N15-56
【公开号】CN104630185
【申请号】CN201510054287
【发明人】苏小运, 姚斌, 薛鲜丽, 石鹏君, 罗会颖, 黄火清, 王亚茹, 柏映国, 杨培龙
【申请人】中国农业科学院饲料研究所
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月3日