专利名称：一种利用底物诱导调控纤维素酶生产的方法
技术领域：
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种利用底物诱导调控纤维素酶生产的方法。
背景技术：
纤维素是一种结构复杂的高分子物质，因而能降解纤维素的酶均非单一酶，而是一个复杂的多酶体系。纤维素酶是指能水解纤维素β-1，4葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，是起协同作用的多组分酶系，在工农业诸多领域均广泛的应用。如纤维素酶可将农作物秸杆、蔗渣等工农业废弃物生物转化为葡萄糖，再经其它微生物进一步转化为酒精、单细胞蛋白等生物化工产品。此外纤维素酶还可用于医药、印染、茶叶加工等方面。纤维素酶主要包括三类酶组分葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、葡萄糖苷酶或称纤维二糖酶，三种酶共同存在并协同作用才能将晶体纤维素水解为葡萄糖。细菌、真菌、放线菌等均能产生纤维素酶，而丝状真菌生产纤维素酶具有以下特点纤维素酶为胞外酶，便于酶的分离和提取；产酶效率高，且产生的纤维素酶酶系结构较为合理；同时可产生许多半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等。目前一般用于工业化生产纤维素酶菌种为真菌，其中酶活力较强的菌株为木霉属、曲霉属和青霉属。当前，在纤维素酶的工业化应用中，由于其过高的应用成本，直接限制了其推广，同时也成为制约木质纤维原料制取乙醇工业化瓶颈之一，如何降低纤维素酶的应用成本，通常通过降低纤维素酶的生产成本、降低用量、回收利用等途径达到。目前纤维素酶研究的热点领域为制备低成本、高活力的纤维素酶；其研究手段主要为改进生产工艺、培育高产菌株。高产酶菌株的筛选往往周期长、结果不确定性大；而结合菌株特性，通过工艺改进达到提高酶活力、降低单位酶生产成本则易于实现。大量研究表明，纤维素酶作为一种诱导酶，在诱导物存在的情况下可大量产酶，但大多诱导物由于其水溶性差，且不能作为碳源直接利用，使其在工业化应用中受限。目前能够诱导纤维素酶的可溶性碳源有槐糖、山梨糖、龙胆二糖、纤维二糖、纤维低聚糖等，槐糖是公认的纤维素酶最有效的诱导物，但其价格昂贵，难以工业化应用；能够诱导纤维素酶并能工业化应用的可溶性碳源主要是纤维二糖、纤维低聚糖等。在CN 101525606 A中公开了一种纤维素酶的制各方法，其包括以下步骤(I)培养皿液体菌种制备；(2)三角瓶种曲培养；(3)固态厚层通风发酵培养；(4)精制提纯。它采用制备液体菌种、固态厚层通风发酵培养制取高活力纤维素酶，但是它采用的发酵物为米糠和麸皮，未能用到秸杆微晶纤维素，所以需要一种以可溶性碳源A和不溶性秸杆微晶纤维素作为诱导物并用而且大量生产的一种以底物诱导生产高效纤维素酶的方法。
发明内容
本发明提供一种利用底物诱导调控纤维素酶生产的方法， 即以绿色木霉(CGMCC编号NO. 5832)作为纤维素酶生产菌，以可溶性碳源A和不溶性秸杆微晶纤维素作为诱导物进行代谢过程调控，通过控制培养基组成、PH调控、通风比、诱导物流加方式等手段生产高活性纤维素酶。为实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案
本发明提供的利用底物诱导调控纤维素酶生产工艺步骤如下
(1)菌种制备选用绿色木霉为生产菌株，分别经斜面试管培养、摇瓶扩大培养或种子罐扩大培养，制备所需液体菌种；
(2)发酵培养将绿色木霉的液体菌种，按液体发酵培养基体积的8 10%接种，28 30°C下通气培养,培养至40 60h后以流加补料的方式,流加以可溶性碳源A和微晶纤维素作为诱导物的补料培养基，流加速率4. O 28. 0L/h*m3发酵液，直至发酵结束；整个培养过程米用流加氨水调控发酵pH在4. 2 4. 8 ;发酵时长为90 168h ;发酵结束，将发酵液过滤即得粗酶液，粗酶液可直接使用或经浓缩后使用。本发明提供的菌种及培养基制备具体操作步骤如下
(I)斜面培养
马铃薯琼脂培养基(PDA):将马铃薯洗净去皮，称取200g，切成小块，置于IL水中，煮沸30分钟，8层纱布过滤，滤液中加入琼脂18克，不断搅拌至琼脂完全融化，停止加热；迅速加入IOg葡萄糖，搅拌使其溶解，补足水分至IOOOmL,适量分装至试管或茄子瓶中，盖上棉塞，于121°C下高压蒸汽灭菌30分钟。划线接种绿色木霉于28 30°C下培养5 7天。⑵摇瓶培养 无菌条件下，将斜面菌种孢子接入三角瓶的种子培养基中，置于摇床，220rpm下，振荡培养22 24h，培养温度为28 30°C。⑶扩大培养
将摇瓶种子转接于种子罐扩大培养18 24h，培养温度28 30°C。以上所述种子培养基含有葡萄糖1. 0%,麸皮4. 0%, (NH4) 2S04 O. 6%，KH2PO4 O. 2%，CaCl2 O. 05%, MgSO4 · 7H20 O. 08%, pH 5· O。⑷液体发酵培养基
秸杆微晶纤维素2 6%，碳原Α0. 5 1. 0%，麸皮O. 5 1. 0%，玉米浆1. 5 2. 0%，(NH4)2SO4 O. 3 O. 6%, KH2PO4 O. 2 O. 4%, CaCl2 O. 05 O. 08%, MgSO4 ·7Η20 O. 05 O. 1%，MnSO4O. 02 O. 04 %，FeSO4O. 02 O. 04 %，ZnSO4 · 7Η20 O. 04 O. 08 %，Cocl2 · 6 H2OO. 04 O. 08%。余量为水，制成混合浆料，调节pH在4. 4 5. 2之间，121 °C高压蒸汽灭菌30分钟。(5)补料培养基
可溶性碳源A 14 20%,秸杆微晶纤维素2 8%，玉米浆1. O 2. 0%，(NH4)2SO4 O. 4 O. 6%, KH2PO4 O. 2 O. 4%, CaCl2 O. 05 O. 1%，MgSO4 · 7Η200· I O. 2%，余量为水，制成混合浆料，121°C高压蒸汽灭菌30分钟。纤维素酶作为一种复合酶，又是诱导酶，木霉生产纤维素酶通常受到底物的诱导，纯的纤维素虽为较好的诱导物，但其价格贵，难以工业化应用于纤维素酶的生产；而微晶纤维素，纤维含量高，是一种广泛应用的辅料；价格低廉，也可作为纤维素酶的诱导物利用，但其水溶性差，不易被菌体直接利用。可溶性碳源A是纤维二糖的结构类似物，能够迅速诱导纤维素酶的合成，且诱导产酶能力高于纤维二糖，然而随着A作为可溶性糖的不断消耗，其诱导能力减弱，菌株产酶能力将下降。本发明以可溶性碳源的A和难溶性的秸杆微晶纤维素同时作为碳源和诱导物利用，既能满足菌株生长所需速效碳源和长效碳源的双重供应，又能协同诱导纤维素酶基因的表达大幅提高纤维素酶的发酵水平。本发明采用流加培养技术，以特定的流速加入诱导产酶的补料培养基，可避免因诱导物作为碳源被消耗而引起产酶能力的下降，从而持续不断的提高菌株的产酶能力。本发明采用的底物诱导调控纤维素酶生产，酶活力达200IU/ml。本发明提供的方法对提高纤维素酶活力、降低纤维素酶的应用成本具有显著的作用，可操作性强，且在开发利用秸杆等天然纤维质资源的同时，无环境污染，是促进秸杆乙醇产业化的有效手段，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
本发明以可溶性碳源A和微晶纤维素做为纤维素酶的诱导物，诱导产酶；采用流加补料方式，不断补充A物质及微晶纤维素以实现底物对产酶的持续诱导，从而提高菌株产酶能力，降低单位酶的生产成本。目前研究表明各种同聚或异聚二糖是真菌产纤维素酶的较好诱导物，以β_1、2或β_1、4糖苷键连接的二糖具有较高的诱导能力，但对于纤维素酶的诱导物及其诱导机理仍未有确定性结论。具体实施中，控制流加时机及补料培养基的组成、以及流加量确定对整个诱导过程具有决定性作用。培养过程条件控制参照以下具体实例
实施例1
⑴培养基
发酵培养基秸杆微晶纤维素4. 0%，葡萄糖1. 0%，麸皮1. 0%，玉米浆1. 5%，(NH4) 2S04O. 6%, KH2PO4 O. 2%, CaCl2 O. 08%, MgSO4 · 7H20 O. 1%，MnSO4O. 02 %，FeSO4O. 02 %，ZnSO4 · 7H20O. 06%, Cocl2 · 6 H2O O. 04%，余量为水。补料培养基可溶性碳源A 16%，秸杆微晶纤维素5%，2· 0%玉米衆，(NH4) 2S04O. 4%, KH2PO4 O. 4%, CaCl2 O. 1%，MgSO4 · 7Η200· 2%，余量为水。⑵将液体菌种，按8% (V/V)接种于50L发酵罐，起始pH 5. O，搅拌速度300rpm，发酵温度29°C下通气培养，发酵48h后，以4. 0L/h*m3速率进行连续流加补料，直至发酵结束；发酵过程通过流加氨水调节pH在4. 2 4.8 ;发酵时长达90-168h，停止发酵，发酵液中纤维素酶酶活力(FPA)为202. 6IU/ml ;将发酵液过滤即得粗酶液。实施例2 ⑴培养基
发酵培养基秸杆微晶纤维素5. 0%，葡萄糖O. 8%，麸皮1. 0%，玉米浆1. 2%，(NH4) 2S04O. 4%, KH2PO4 O. 2%, CaCl2 O. 08%, MgSO4 · 7H20 O. 1%，MnSO4O. 02 %，FeSO4O. 02 %，ZnSO4 · 7H20O. 06%, Cocl2 · 6 H2O O. 08%，余量为水。补料培养基可溶性碳源A 18%，秸杆微晶纤维素6%，玉米浆1. 6%，(NH4) 2S04
O.4%, KH2PO4 O. 4%, CaCl2 O. 1%，MgSO4 · 7Η200· 2%,余量为水。
⑵将液体菌种，按10% (V/V)接种于6m3发酵罐，起始pH 4. 8，搅拌速度150rpm，发酵温度30°C下通气培养，发酵50h后，以6. 4L/h*m3速率进行连续流加补料，直至发酵结束；发酵过程通过流加氨水调节pH在4. 4 4. 8 ;发酵时长达124h，停止发酵，发酵液中纤维素酶酶活力(FPA)为192. 60IU/ml ;将发酵液过滤即得粗酶液。与未采用诱导调控比较酶活力提闻130%。实施例3 ⑴培养基
发酵培养基秸杆微晶纤维素5. 5%，葡萄糖O. 5%，麸皮O. 5%，玉米浆1. 5%，(NH4)2S04 O. 4%, KH2PO4 O. 2%, CaCl2 O. 05%, MgSO4 · 7H20 O. 06%, MnSO4O. 04%, FeSO4O. 04%，ZnSO4 · 7H20 O. 06%, Cocl2 · 6 H2O O. 08%。补料培养基可溶性碳源A 14%，秸杆微晶纤维素8%，玉米浆2. 0%，(NH4) 2S04
O.6%, KH2PO4 O. 5%, CaCl2 O. 1%，MgSO4 · 7Η200· 1%，余量为水。⑵将液体菌种，按10%· (V/V)接种于60m3发酵罐，起始pH 4. 8，搅拌速度lOOrpm，发酵温度30°C下通气培养，发酵40h后，以7. 8L/h*m3速率进行连续流加补料，直至发酵结束；发酵过程通过流加氨水调节pH在4. 4 4.8 ;发酵时长达86-144h，停止发酵，发酵液中纤维素酶酶活力(FPA)为196. 60IU/ml ;将发酵液过滤即得粗酶液。与未采用诱导调控比较酶活力提高150%。
权利要求
1.一种利用底物诱导调控纤维素酶生产的方法，其特征在于以绿色木霉作为纤维素酶生产菌，以可溶性碳源A和不溶性秸杆微晶纤维素作为诱导物进行代谢过程调控，通过控制培养基组成、PH调控、诱导物流加等手段生产高活性纤维素酶。
2.如权利要求1所述的一种利用底物诱导调控纤维素酶生产的方法，其特征在于液体发酵工艺步骤是⑴菌种制备选用绿色木霉为生产菌株，分别经斜面试管培养、摇瓶扩大培养或种子罐扩大培养，制备所需液体菌种；(2)发酵培养将绿色木霉的液体菌种，按液体发酵培养基体积的8 10%接种，28 30°C下通气培养，培养至40 60h后以流加补料的方式，流加以可溶性碳源A和不溶性秸杆微晶纤维素作为诱导物的补料培养基，流加速率4. O 28. 0L/h*m3发酵液，直至发酵结束；整个培养过程采用流加氨水调控发酵pH在4. 2 4. 8 ;发酵时长为900 168h ;发酵结束，将发酵液过滤即得粗酶液，粗酶液可直接使用或经浓缩后使用。
3.如权利要求2所述的一种利用诱导底物调控纤维素酶生产的方法，其特征在于所述液体发酵工艺的液体发酵培养基配方为稻杆微晶纤维素4. O 6. 0%,葡萄糖O. 5 1.0%,麸皮 O. 5 1. 0%,玉米浆1. 5 2. 0%, (NH4) 2S04 O. 3 O. 6%, KH2PO4 O. 2 O. 4%,CaCl2 O. 05 O. 08%,MgSO4 ·7Η20 O. 05 O. 1%,MnSO4O. 02 O. 04%,FeSO4O. 02 O. 04%，ZnSO4 · 7Η20 O. 04 O. 08%，Cocl2 · 6 H2O O. 04 O. 08%，余量为水。
4.如权利要求2所述的一种利用诱导底物调控纤维素酶生产的方法，其特征在于所述液体发酵工艺的补料培养基配方为可溶性碳源A 14 20%，秸杆微晶纤维素4 8%,玉米浆1. O 2. 0%, (NH4) 2S04 O. 4 O. 6%, KH2PO4 O. 2 O. 4%, CaCl2 O. 05 O. 1%，MgSO4 · 7Η200· I O. 2%，余量为水。
5.如权利要求2所述的一种利用底物诱导调控纤维素酶生产的方法，其特征在于所述的补料时机及补料速率的确定发酵培养至40 60h以流加补料的方式,流加以可溶性碳源A和秸杆微晶纤维素作为诱导物的补料培养基，补料培养基的流加速率为4. O ,28. 0L/h*m3 发酵液。
全文摘要
本发明提供一种利用底物诱导调控纤维素酶生产的方法，即以绿色木霉作为纤维素酶生产菌，以可溶性碳源A和不溶性秸秆微晶纤维素作为诱导物进行代谢过程调控，通过控制培养基组成、pH调控、通风比、诱导物流加方式等手段生产高活性纤维素酶；本发明提供的方法对提高纤维素酶活力、降低纤维素酶的应用成本具有显著的作用，可操作性强，且在开发利用秸秆等天然纤维质资源的同时，无环境污染，是促进秸秆乙醇产业化的有效手段，具有广阔的应用前景。
文档编号C12R1/885GK103045566SQ20121054226
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者赵子高, 王林风, 阎振丽 申请人:河南天冠纤维乙醇有限公司