雄烯二酮耐底物突变株及其诱变选育方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及利用硫酸二乙酯和紫外线复合诱变新金分枝杆菌，并结合梯度平板法 初筛技术和摇瓶发酵复筛技术，选育出耐底物且能有效降解植物留醇侧链获取雄烯二酮的 新金分枝杆菌WS3dcoAacteritt? ，属生物工程技术领域。 技术背景
[0002] 雄烯二酮（AD)作为合成留体类激素药物的重要原料和关键中间体，是当前国家急 需解决的激素药物的重要原料，对机体起着非常重要的调节作用，被誉为"生命的钥匙"。几 乎所有留体激素类药物都是以雄烯二酮为起始原料进行生产的，如：性激素、蛋白质同化激 素、孕激素、皮质激素及地塞米松、可的松等，具有重要的商业价值。
[0003] 分枝杆菌、节杆菌及棒杆菌等很多微生物都能以植物留醇作为碳源产生雄烯二酮 等代谢中间体。通过微生物转化法生产雄烯二酮可以充分利用长期以来被用作废物的植物 甾醇，摆脱了原材料来源因"黄姜"和"穿地龙"供应受季节、地域等自然因素对生产的制约， 同时对保护自然资源和生态环境起到了很好的作用。但微生物对植物留醇的转化过程仍然 存在很多限制因素：留体化合物疏水性强，在水中的溶解度低；菌株转化能力普遍较低，高 浓度底物投加量对转化过程的抑制等。因此提高菌株的转化能力，改善菌种对底物的耐受 性进而提高投料浓度等都是留体生物转化中要解决的关键问题 为了提高微生物对植物留醇的转化效率和产物产量，紫外、DES等物理和化学等诱变 及高浓度底物驯化培养法常被用来选育优良菌株。吴宝华等用紫外线照射和NTG复合诱 变的方法处理节杆菌，经筛选获得一株株ADD分解酶缺陷型菌株，能有效积累ADD，该菌对 豆甾醇的降解率达到95%。杨英等分别采用紫外线照射、6°Co、紫外线与6°Co复合诱变处 理出发菌株价co知cteriw?sp.BD696,筛选得到一高转化率突变株，其AD产量较出发菌 株提高39. 2%，且没有结构类似物ADD产生。黄丽君等以一株降解植物留醇产生雄烯二酮 的分枝杆菌为研宄对象，先后利用亚硝基胍（NTG)和N+注入技术对其进行诱变处理，最终 选育出一株高产突变株5/7.N-2,其雄稀二酮生产能力较出发菌株提高了 37. 8%。Vidal等在含有14g/L13-谷留醇的培养基中反复培养分枝杆菌 sp.MB-3683和B-11045 (这两株菌均能以谷留醇作唯一碳源)， 连续转接培养7次后，两株菌对谷甾醇的转化率分别提高了 44%和21%。MalaviyaA等将 5/7.在谷留醇浓度不断提高的液体培养基中驯化培养来提高分枝杆菌对谷 甾醇的耐受性，结果显示在谷留醇浓度为20g/L的转化体系中，驯化培养的 s/7菌株的整体转化率达到23. 8%，高于原始菌株的17. 31%。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种雄烯二酮耐底物突变株及其诱变选育方法， 该方法能够提高菌种对底物植物留醇的耐受性，增加整个转化体系中的底物投料浓度，为 微生物转化法生产雄烯二酮提供优良菌种一新金分枝杆菌WS3。
[0005] 本发明所述的菌株新金分枝杆菌WS3,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号 为CCTCC NO. M 2014322,保藏日期为2014年7月4日，拉丁文学名为#尺〇如cteriws 腫WS3。摇瓶发酵其雄稀二酮生成率达40. 9%，是野生菌株的1. 59倍，保藏地址是中 国武汉大学。
[0006] 所述的新金分枝杆菌有以下微生物学特征： 1.形态学上特征为： a.细胞形态呈细长略弯曲的杆状，有时有分枝或出现丝状体，具有膨大或棒状末端；b.大小为6?10ym;c.菌落光滑、饱满、中间隆起、边缘不整齐、不透明，菌落呈橙黄色。
[0007] 2.该菌株的生理生化特征为： a.本菌株可以利用合成培养基生长；b.培养时间：4~7天；c.对氧气的需求：好气；d.生长pH范围：6. 0?8. 5;e.生长最适宜温度：28?32°C;f.转化的主要产物为雄烯 二酮。
[0008] 本发明还提供新金分枝杆菌WS3的选育方法，即利用硫酸二乙酯和紫外线诱变方 法进行复合诱变、结合梯度平板法初筛以及摇瓶发酵进行复筛和验证、选育出一株产雄烯 二酮耐底物且遗传稳定的突变菌株。
[0009] 本发明所述选育方法包括如下步骤： ① 菌悬液的制备： 取斜面上培养4~7天的新金分枝杆菌出发菌株，用pH7. 0的无菌磷酸缓冲液配制菌悬 液，经1〇~15倍系列稀释达到浓度100~1000cfu/mL备用； ② 硫酸二乙酯和紫外线复合诱变； ③ 初筛：通过梯度平板法对耐底物突变株进行初筛； ④ 复筛：挑取生长较好的菌落在梯度板上连续传代几次转接斜面，进行摇瓶发酵复 筛； ⑤ 验证高产菌株： 将复筛后得到的耐底物菌株传代培养5次，每次都用与复筛一样的方法对菌株雄烯二 酮生产稳定性进行验证； ⑥ 尚广菌株的保减： 将筛选出的一株雄烯二酮耐底物突变菌株采用甘油管法和冷冻真空干燥法进行保藏。
[0010] 本发明所述方法的具体步骤为： I取培养4~6天的新鲜斜面一只，用20mL0.ImoL/LpH7. 0的磷酸盐缓冲液将斜面菌 种洗下，倒入装有数粒玻璃珠的150mL已灭菌三角瓶中，充分振荡20min后，用塞有脱脂棉 的无菌漏斗过滤，制得菌悬液，将菌悬液进行稀释，浓度控制在l〇〇-l〇〇〇cfu/mL; I用DES溶液诱变处理I中培养的新金分枝杆菌出发菌株10~40分钟后，加入 0. 5mL25%硫代硫酸纳终止剂，5~30分钟后将培养液置于无菌培养皿进行紫外照射诱变； f取0.lmL经=步骤处理的培养液稀释至一定浓度，取0.lmL分别涂布到基本培养 基平板及添加留醇浓度为29^4%的梯度培养基平板上，黑暗培养6~24小时，然后置于恒温 培养箱中30 ~32°C避光培养4 - 7天； €;将步骤+f中培养出的菌落挑出，接入发酵培养基中培养5~7天，控制相同的培养条 件，收集发酵液； I用高效液相色谱法分析经+1步骤培养的发酵液中的雄烯二酮含量，并挑出雄烯二 酮含量高的菌株进行复筛； 曹将初筛中挑选出来的菌株，接入发酵培养基中培养5~7天，控制相同的培养条件， 收集发酵液，计算雄烯二酮生成率，挑选出雄烯二酮高产菌株； +2将复筛后得到的高产菌株扩大培养5~7次，每次采用f+的方法对菌株的稳定性进 行验证，筛选得到高产、稳定的突变菌株。
[0011] 本发明DES和紫外线复合诱变处理的出发菌株培养物处于对数生长期。
[0012] 本发明所述梯度平板中底物植物留醇的浓度为2%~4% ;化学诱变剂DES的诱变浓 度为1%。
[0013] 本发明紫外照射诱变采用15W或30W紫外灯，提前预热20~30分钟后，将菌液置于 距离紫外灯20~30cm处进行紫外照射30~240秒。
[0014]本发明所述的发酵培养基为改良后的合成培养基（％):玉米浆2~5,NaN03 0.3~0.6，葡萄糖0.1~0.5，（順4)2册04 0 . 06，豆油16，植物甾醇2，泡敌0.01，口116.0-8.5。
[0015] 本发明所述诱变后菌株WS3的摇瓶培养条件为温度28?32° C、摇床转速200? 300转/分钟。
[0016] 本发明利用新金分枝杆菌对化学和物理诱变剂比较敏感，生命力比较顽强，有较 强的植物留醇转化潜力，提出了利用DES和紫外线复合诱变手段，结合梯度平板法初筛技 术和摇瓶发酵复筛技术，选育出植物耐受性高且遗传稳定的新金分枝杆菌WS3,通过这种方 法可以有效的提高新金分枝杆菌降解植物留醇的能力，为利用微生物转化法生产雄烯二酮 提供了优良菌种。突变菌株新金分枝杆菌WS3可用于雄烯二酮的生产。
[0017]
【附图说明】： 图1为本发明方法流程图； 图2所示为出发菌株JXNU02的AD浓度与AD生成率图； 图3所示为突变株新金分枝杆菌WS3的AD浓度与AD生成率图；
【具体实施方式】： 以下结合实施实例对本发明进行详细说明。
[0018] 实施例1 : 新金分枝杆菌的硫酸二乙酯和紫外线复合诱变： I分别配制〇?lm〇L/L的K2HP04溶液（甲液）和0?lm〇L/L的KH2P04溶液（乙液），取 甲液61. 5mL，乙液38. 5mL混合，得到pH7.0的磷酸盐缓冲液100mL。
[0019] f用10mL0.ImoL/LpH7. 0的磷酸缓冲液将培养6天的新金分枝杆菌JXNU02斜 面菌苔洗下，倒入装有无菌玻璃珠的三角瓶中，充分振荡l〇min，用塞有脱脂棉的无菌漏斗 过滤，得到菌悬液，经10倍系列稀释达到浓度为l〇〇-l〇〇〇cfu/mL备用。
[0020]f分别吸取2mL于5个锥形瓶内，并加入18mLImoL/LPH7.0磷酸缓冲液。取上 述四个锥形瓶，各加硫酸二乙酯0. 2mL，最终配成3%的诱变溶液。
[0021] J.诱变混合液放在振荡仪中分别振荡处理l〇min，20min，30min，40min，使菌与 诱